小粒絨盾小蠹Xyleborinus saxesenii(Ratzeburg，1873)的形態(tài)和分子鑒定

王子豪 榮書利 郝廣斌 王婷婷 曹鵬 王俊平

摘要：[目的]為明確青島嶗山區(qū)小蠹種類，本研究對誘集到的小蠹進(jìn)行分類鑒定，更好地豐富生物多樣性。[方法]采用形態(tài)學(xué)觀察和線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I （COI）序列分析的方法進(jìn)行小蠹種類簽定。[結(jié)果]鑒定嶗山區(qū)的1種小蠹為小粒絨盾小蠹，隸屬于象蟲總科、小蠹亞科、絨盾小蠹屬，該小蠹的典型特征為鞘翅自斜面前緣開始，溝間部具突起的顆瘤，由前向后略許增大，成為縱列，第2溝間部無顆瘤，與2017年呂坤鑒定的山核桃新害蟲——小粒絨盾小蠹描述的形態(tài)特征一致。基于COI基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（ML樹）顯示，該小蠹樣本與美國和東南亞小粒絨盾小蠹樣本序列聚成一支。[結(jié)論]本文基于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)兩方面的鑒定，明確該誘集到的小蠹為小粒絨盾小蠹并且該種在山東首次記錄發(fā)現(xiàn)。此研究結(jié)果為小蠹快速DNA鑒定以及溯源分析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：小粒絨盾小蠹；分子簽定；形態(tài)特征

中圖分類號：Q969.514.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-1498（2023）03-0185-05

材小蠹族（Xyleborini）昆蟲又稱食菌小蠹，是一類蛀干害蟲同時具有經(jīng)濟意義，隸屬于鞘翅目（Coleoptera），象蟲科（Curculionidae），小蠹亞科（Scolytinae）。目前該族包括37屬，約1 200種，中國記載10屬42種。材小蠹族類群主要取食木質(zhì)部中的真菌，堵塞疏導(dǎo)組織，并且自身也攜帶真菌甚至攜帶病原體入侵植物并加速植物死亡。Xyleborus glabratus Eichhoff所攜帶的病原菌，就曾在美國的東南部造成了鱷梨（Persea americana Mill.）的大面積死亡，并且在北美洲該族已經(jīng)成為最具侵略性和攻擊性的小蠹類蛀干害蟲。

小粒絨盾小蠹（Xyleborinus saxesenii（Ratzeburg，1873）），隸屬于材小蠹族（Xyleborini），絨盾小蠹屬（Xyleborinus）。殷蕙芬1984年將材小蠹族的32種歸在材小蠹屬下，1991年材小蠹族分成10個屬，1837年，小粒絨盾小蠹由Ratzeburg發(fā)現(xiàn)并定名為Bostrichus saxesenii，該種有21個同物異名，多數(shù)學(xué)者將其稱為小粒材小蠹（Xyleborus saxeseni），但此命名法未將材小蠹族分屬，本文根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察和測序結(jié)果，將該材小蠹分到絨盾小蠹屬下，為小粒絨盾小蠹。

小粒絨盾小蠹主要分布在中國（江西、云南、安徽、浙江、廣西、福建、貴州、湖南、吉林、江蘇、新疆、西藏、臺灣、山西、陜西、四川），朝鮮，日本，越南，加拿大，北美，南美，阿根廷，巴西，智利，厄瓜多爾，巴拉圭，烏拉圭等，已知寄主包括橡膠樹（Hevea brasiliensis、（H.B.K） Mull.Arg.），五倍子樹（Rhus chinensis，Mill），山核桃（Carya cathayensis，Sarg.），蘋果（Malus purmila，Mill），云杉（Picea asperata，Mast），櫟樹（Quercus stenophylla，Makino），楊梅（Myrica rubra，（Lour.）S.et Zucc.），柿子（Diospyros kaki，Thunb），錐栗（Castanea henryi，（SSkan） Rehd.et Wils.），桉屬植物（Eucalyptus sp，L'Her），槭屬植物（Acer sp.，L），松屬植物（Pinus sp，Linn），等。

2022年3月，在嶗山地區(qū)設(shè)置多層漏斗型小蠹誘捕器，懸掛地的林分主要是黑松林，周圍也有刺槐等闊葉樹。在對嶗山區(qū)小蠹種類監(jiān)測過程中，發(fā)現(xiàn)小蠹誘捕器內(nèi)收集到一種小蠹，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。旨在為小蠹類蛀干害蟲快速DNA鑒定以及溯源分析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1蟲源采集

2022年3月，在山東省青島市嶗山區(qū)（36.315929°N，120.603775°E）設(shè)置小蠹誘捕器誘集昆蟲成蟲。

1.2形態(tài)特征觀察

采集到的樣本儲存于無水乙醇中，使用超景深顯微鏡（基恩士Kenyence VHX-7000）對小蠹的成蟲形態(tài)特征進(jìn)行觀察和拍照。

1.3分子生物學(xué)鑒定

隨機抽取4頭小蠹成蟲，挑胸部和腹部組織，采用T5 Direct PCR Kit（Animal Tissue）試劑盒，提取個體基因組DNA，置于-20℃保存待用。

利用小蠹亞科通用引物S1718和A2411擴增COI基因，PCR擴增體系為2×T5 Direct PCR Kit（Animal Tissue）13 uL，S1718 1 uL，A24111 uL，DNA模板2pL和ddH2O 8UL共25uL。PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min；94℃變性45 s，47.2℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行35次循環(huán)；72℃延伸10 min；產(chǎn)物置于4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序。

以COI基因序列建樹：選取本試驗的Xsaxesenii序列（Genbank No.OP002147.1），來自Genbank的12條序列作為參考序列（表1），落葉松八齒小蠹（Ips subelongatus Motschulsky）（Genbank No.KC411952.1）作為外群，運用MAGA 7最大似然法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)學(xué)鑒定

小粒絨盾小蠹體長2.0 mm，圓柱形，黑褐色，鞘翅后部及斜面顏色稍淺，紅褐色，觸角和足黃褐色（a、b）。復(fù)眼類似腎形，前緣中部具深的缺刻（c）；觸角錘狀部端部有如經(jīng)過切削而成的圓形削面，其上具圓形毛縫（d）；前胸背板背面觀后方前圓，成長盾形（e）。鞘翅基部翅縫處下陷成坑，三角形，內(nèi)生濃密絨毛，小盾片從中成錐狀突起，易被絨毛遮蓋（e）；鞘翅側(cè)面觀鞘翅背緣前部2/3平直延伸，后部的1/3弓曲下降（b）；鞘翅自斜面前緣開始，溝間部具突起的顆瘤，由前向后略許增大，成為縱列，第2溝間部無顆瘤（f）。如（圖1）。

2.2成蟲分子生物學(xué)鑒定

采集于青島市嶗山區(qū)誘捕器內(nèi)的4頭小蠹成蟲樣本，通過分子鑒定均屬于同一物種；該小蠹COI基因長度為698 bp（OP002147.1），經(jīng)Blast對比可知，該小蠹與美國序列樣本（MK643403.1、MK643400.1）和東南亞序列樣本（MN620034.1）相似度達(dá)99%。ML系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）顯示該小蠹（OP002147.1）與Xsaxesenii聚為一支，但與同屬不同種的紋盾材小蠹（X.artestriatus）（Eichhoff，1878）（MW617396.1、MN620020.1）、X octospinosus（MW617443.1）、X.sharpae（MW617408.1）、X.attenuatus（MW617405.1）、X.andrewesi（OM422678.1）分在不同支上。

3討論

材小蠹族是重要的林業(yè)害蟲，主要分布在熱帶和溫帶地區(qū)，寄主廣泛，包括針葉樹和闊葉樹，幾乎終生生活在樹木木質(zhì)部中，難以被發(fā)覺。大多數(shù)種類蛀食衰弱樹、倒木、瀕死樹木或死樹。據(jù)劉章華等人報道小粒絨盾小蠹在浙江地區(qū)為害錐栗，1年發(fā)生3～5代，以成蟲越冬，全年均可見到成蟲。本研究中誘捕器監(jiān)測到的小粒絨盾小蠹主要出現(xiàn)在4-6月，推測由于寄主、環(huán)境和地理因素因，該蟲在嶗山區(qū)的為害情況與浙江地區(qū)不同，且該蟲只在誘捕器內(nèi)發(fā)現(xiàn)，因此其寄主種類和生活史還有待研究。

本文并未對小粒絨盾小蠹雄蟲進(jìn)行描述，因為材小蠹族所有雄蟲為單倍體，相比雌蟲體型短小，樣貌丑陋無翅且數(shù)量少，通常不用來鑒定和描述使用，在誘集過程中也未發(fā)現(xiàn)雄蟲。

Cognato利用COI基因研究了Conophthorussp的系統(tǒng)發(fā)生和地理環(huán)境與寄主對該屬昆蟲的影響；常虹等區(qū)分了齒小蠹屬Ips sp.的不同物種；王銀竹等研究了長小蠹科Platypodidae昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。本研究在誘集過程中發(fā)現(xiàn)，誘集到的小粒絨盾小蠹在形態(tài)學(xué)上與同屬的小蠹難以區(qū)分，或是因為肢體殘缺而無法辨別，因此利用COI基因序列比對進(jìn)行小粒絨盾小蠹分子鑒定可以有效彌補形態(tài)鑒定的不足。

材小蠹族類群被稱為食菌小蠹，通過以真菌覆蓋的木材為食，并可傳播真菌或病原菌。據(jù)文獻(xiàn)記載，1844年Hartig鑒定北方毛胸小蠹（Anisandrus dispar，F(xiàn)）體內(nèi)存在的共生菌為白落叢梗孢-Monilia candida，到1967年，Batra鑒定該共生真菌為哈氏蟲道真菌（Ambrosiella hartigii，L.R.Batra），王天龍鑒定培養(yǎng)出3種足距小蠹屬（Xylosandrus sp.）儲菌器的共生真菌，短翅足距小蠹（Xylosandrus brevis Eichhoff）、X.germanus Blandford的共生真菌均為哈氏蟲道真菌，黑色枝小蠹（Xylosandrus compactus Eichhoff）的共生真菌為Ambrosiella xylebori Brader ex Arx& Hennebert。小粒絨盾小蠹共生真菌種類及聯(lián)合作用方式有待進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

本文作者針對一種小蠹進(jìn)行研究，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，明確該誘集到的小蠹為小粒絨盾小蠹，為山東首次報道，研究結(jié)果豐富了生物多樣性。該小蠹最主要的形態(tài)特征為鞘翅自斜面前緣開始，溝間部具突起的顆瘤，由前向后略許增大，成為縱列，第2溝間部無顆瘤，該特征可作為小粒絨盾小蠹的鑒別特征。