柳 俊，鄒定峰，繆時英，宋 偉，李 凱

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005

不孕不育癥是一個全球性醫(yī)學(xué)問題。研究報告表明40%～50%的不孕不育癥的病例是由男性因素導(dǎo)致的,主要表現(xiàn)為精子發(fā)生障礙和系統(tǒng)性疾病[1]。精子發(fā)生是發(fā)生在動物睪丸及附睪內(nèi)的高度復(fù)雜、協(xié)調(diào)、有序的動態(tài)過程,涉及復(fù)雜的調(diào)控機制。

研究表明部分RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein, RBP)在轉(zhuǎn)錄基因表達的調(diào)節(jié)中起重要作用,進而影響精子發(fā)生過程。如Nanos2編碼一種鋅指RNA結(jié)合蛋白,缺失將導(dǎo)致精原干細胞(spermatogonial stem cell, SSC)缺失,過表達則會導(dǎo)致精原干細胞堆積[2-3]。Lin28A作為精原干細胞的標(biāo)志物之一,也是一種RNA結(jié)合蛋白,其具有促進精原干細胞增殖的功能[4-5]。

細胞分裂周期相關(guān)蛋白2(cell devision cycle associated 2,CDCA2) 是一種與細胞周期相關(guān)的RNA結(jié)合蛋白[6]。有研究表明在細胞的有絲分裂過程中,CDCA2 可與蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1,PP1) 結(jié)合,確保核膜重組過程順利進行[7]。此外,CDCA2 還可參與染色質(zhì)重塑和DNA損傷修復(fù)等過程[8-9]。本研究利用 CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合Cre-loxP介導(dǎo)的重組系統(tǒng)對睪丸高表達的基因Cdca2進行敲除并獲得了純合的生殖細胞特異性敲除小鼠品系。通過對Cdca2組織特異性敲除小鼠進行雄性生殖功能的表型分析,為研究該編碼基因的功能提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物: SPF 級 C57BL/6J 雄鼠 12只,雌鼠12只,體質(zhì)量20～25 g(斯貝福生物技術(shù)有限公司); SPF 級成年Cdca2floxed雜合子雄鼠3只,雌鼠3只(委托北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司構(gòu)建);Cdca2生殖細胞特異性敲除雄鼠12只(本實驗所構(gòu)建);上述動物均在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所動物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)標(biāo)準為 3～5只/籠,溫度區(qū)間為20 ℃ ～24 ℃,濕度區(qū)間為50%～70%,光照時間為8∶00～ 20∶00,期間自由飲水?dāng)z食。

1.1.2 主要試劑:AG RNAex Pro RNA提取試劑(艾科瑞生物技術(shù)有限公司);互補DNA(cDNA)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司);動物睪丸組織固定液(武漢賽維爾生物科技有限公司);SDS-PAGE 快速凝膠試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司);BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司); Anti-CDCA2一抗(艾比瑪特醫(yī)藥科技上海有限公司,36263);Anti-beta-actin一抗(Proteintech公司, 66009); 山羊抗小鼠IgG/辣根酶標(biāo)記(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,ZB-2305);250 bp-DNA ladder(上海捷瑞生物工程有限公司);瓊脂糖(Biowest公司);引物(北京天一輝遠生物科技有限公司合成)(表1)。

1.2 方法

1.2.1 CDCA2系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建:多蛋白序列比對由MAFFT進行比對,系統(tǒng)發(fā)育樹由IQ-TREE軟件構(gòu)建。進化距離標(biāo)注在分支線上,代表進化支變化的程度,越短代表差異越小,進化距離越近。

1.2.2 檢測小鼠各部位組織mRNA和蛋白質(zhì):將8周齡的成年雄性小鼠用脫頸法處死,解剖小鼠,獲得小鼠的肺、心、脾、腎、腦、肝、睪丸、附睪等組織,將組織放入離心管中,并加入1 mL Trizol試劑 (RNA提取液), 于冰上超聲裂解組織5 min。隨后將樣本室溫放置 5 min 使其得到充分裂解,加入 200 μL氯仿,充分震蕩混勻、室溫放置10 min后,于離心機中12 000 r/min,4 ℃離心 15 min,吸取離心管中的上層水相至新管中并加入等體積異丙醇,上下顛倒混勻,室溫靜置約10 min。12 000 r/min,4 ℃離心10 min后棄上清液留 RNA沉淀于管底。加入預(yù)冷過的1 mL DEPC水配置的75%乙醇洗滌 RNA沉淀, 7 500 r/min,4 ℃離心 10 min后棄上清液,再次重復(fù)洗滌。 打開離心管室溫晾干,加入 DEPC水溶解,并測量 RNA濃度。將提取后的 RNA 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix說明進行,每個樣品反轉(zhuǎn)錄 1 μg RNA。Q-PCR體系(每孔20 μL,每個樣品3個重復(fù)孔)配置如下: Q-PCR Mix 10μL,前、后向引物各 0.4 μL,cDNA0.5 μL, ddH2O 2 μL。 Q-PCR引物序列見 (表1)。 Q-PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性 95 ℃, 5 min, 擴增和熒光信號收集(95 ℃ 30 s,60 ℃ 30s)×40 cycle,熔解曲線 (60 ℃ 30 s,+0.3 ℃/s,90 ℃ 15 s)用上述方法取得小鼠各組織后,根據(jù)每個組織的大小向 離心管中加入適量SDS裂解液,添加蛋白酶及磷酸酶抑制劑,于冰上進行超聲裂解。裂解后冰上靜置5 min, 隨后100 ℃電浴10 min,12 000 r/min離心5 min,取上清,部分BCA測定、部分制樣(濃度:4 g/L)。于預(yù)制膠中80 V電泳30 min,120 V電泳1 h。320 mA轉(zhuǎn)膜1 h 30 min。5%脫脂牛奶封閉1 h。使用anti-CDCA2和anti-Actin的一抗, 4 ℃過夜孵育。TBST洗3次,每次10 min。二抗孵育1 h, TBST洗3次,每次10 min。隨后進行顯影。

1.2.3 生殖細胞特異性敲除Cdca2小鼠的構(gòu)建:使用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Cdca2floxed雜合子小鼠,外顯子5和7兩側(cè)有兩個loxP位點和同源臂。為了生成Cdca2floxed純合小鼠品系,將獲得的雜合子小鼠,相互交配,得到Cdca2floxed純合雌性小鼠。將Cdca2floxed純合雌性小鼠與組織特異性Cre的雄性小鼠Ddx4-Cre(在胚胎第15天雄性生殖細胞中表達)交配,以獲得Cdca2floxp/+-Cre雄性小鼠。最后將Cdca2floxed純合雌性小鼠與Cdca2floxp/+-Cre雄性小鼠交配獲得生殖細胞特異性敲除Cdca2的Cdca2floxp/floxp-Cre小鼠,方案及原理見(圖2B)。

1.2.4 鑒定小鼠基因型:剪取小鼠尾尖約5 mm,置于1.5 mL 離心管中,加入50 μL堿性組織裂解液,100 ℃電浴40 min。加入50 μL酸性溶液中和,震蕩混勻。12 000 r/min離心2 min去除鼠毛雜質(zhì), 將獲得的鼠尾 DNA樣品進行 PCR鑒定其基因型。 PCR體系(每個樣品20 μL)配置如下:2×Taq PCR StarMix 10 μL,上下游引物各1 μL,鼠尾DNA樣品6 μL,ddH2O 2 μL。PCR擴增 條件:95 ℃ 5 min,(95 ℃ 25 s,64.5 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s)×35 cycle,72 ℃ 2 min,16 ℃保持。PCR 后進行瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)DNAladder及電泳條帶位置判斷基因型。

1.2.5 小鼠睪丸石蠟切片蘇木精-伊紅(hematox-ylin-eosin dyeing,HE)染色:8周齡的野生型小鼠和Cdca2floxp/floxp-Cre小鼠用脫頸法處死,收集睪丸和附睪,在動物睪丸組織固定液中固定48 h,隨后按照常規(guī)的蘇木精-伊紅(HE)染色流程制片,并用中性樹脂封片,自然晾干后置于顯微鏡下拍照觀察。

1.2.6 小鼠精子計數(shù)、活率、運動參數(shù)分析:取野生型和Cdca2floxp/floxp-Cre成年雄鼠各3只,脫頸法處死,收集一側(cè)附睪精子于獲能培養(yǎng)液(DMEM F12+10%胎牛血清) 中, 37 ℃ 5% CO2中培養(yǎng)30 min,進行體外獲能。用精子全自動檢測分析系統(tǒng)(computer assisted sperm analysis,CASA) 檢測精子數(shù)量、運動性及精子活率。每組重復(fù)3次,取平均值比較差異有無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.7 小鼠生育力測試:分別取8周齡的雄性Cdca2floxp/floxp-Cre和野生型雄性小鼠各3只,將其與12只野生型C57BL/6J成年雌鼠按1∶2的比例合籠,交配3個月。定期對雌鼠檢栓,確保交配。記錄每只孕鼠平均每胎所生的幼崽數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CDCA2在小鼠睪丸中高表達

Cdca2位于小鼠14號染色體上,全長39.5 kb, 其編碼的蛋白由982個氨基酸組成。首先通過公共數(shù)據(jù)庫NCBI搜索了CDCA2在人類中的表達模式,發(fā)現(xiàn)其在睪丸組織中高表達(圖1B)。通過多序列比對構(gòu)建了CDCA2的蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明CDCA2在哺乳類動物中具有較高的保守性(圖1A)。為了證實其在小鼠中的表達,取小鼠的不同組織進行了Q-PCR和Western blot檢測,結(jié)果顯示其在睪丸組織高表達(圖1C, D)。

2.2 構(gòu)建生殖細胞特異性敲除Cdca2小鼠模型

成功構(gòu)建了Cdca2floxed雜合子小鼠(圖2A),經(jīng)過與Ddx4-Cre工具鼠配繁,得到與Cdca2floxp/+-Cre雄性小鼠。將其與Cdca2floxed純合雌性小鼠交配獲得生殖細胞特異性敲除Cdca2的Cdca2floxp/floxp-Cre小鼠(圖2B, C),并通過小鼠基因型鑒定證實。與野生型小鼠相比,Cdca2floxp/floxp-Cre小鼠生長、發(fā)育和行為均表現(xiàn)正常(圖2D)。

A.schematic diagram of Cdca2 conditional knockout mouse construction; B.mating diagram of germ cell conditional gene knockout mice; C.genotype identification of Cdca2 conditional gene knockout mice; D.photos of adult wild type(WT) mice and Cdca2 conditional knockout mice

2.3 CDCA2缺失對小鼠精子發(fā)生和生育力無明顯影響

在成功構(gòu)建生殖細胞特異性敲除Cdca2floxp/floxp-Cre小鼠后,對小鼠進行生育力測試,發(fā)現(xiàn)Cdca2floxp/floxp-Cre小鼠與野生型小鼠相比,繁育的小鼠數(shù)量幾乎相同(圖3E),并且睪丸大小和質(zhì)量之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3A,B)。隨后比較了Cdca2floxp/floxp-Cre小鼠與野生型小鼠的精子濃度,發(fā)現(xiàn)Cdca2floxp/floxp-Cre小鼠的精子濃度僅下降了5%(圖3C)。HE染色結(jié)果顯示生殖細胞特異性敲除Cdca2小鼠的睪丸曲細精管具有正常的結(jié)構(gòu)包括從精原干細胞到精子等各級生精細胞(圖3D)。此外還利用計算機輔助精液分析系統(tǒng)測定了Cdca2floxp/floxp-Cre小鼠與野生型小鼠的精子活率及精子運動狀況(圖3E),包括精子正常形態(tài)與異常形態(tài)百分比(圖4A)、精子運動直線性(圖4B)、精子平均鞭打頻率(圖4C)、精子平均運動性(圖4D)、精子進行性運動性(圖4E)、以及精子頭部平均側(cè)擺幅值(圖4F)等。各組精子數(shù)、精子活動能力和運動參數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。這些發(fā)現(xiàn)表明睪丸高表達基因Cdca2的缺失對小鼠的精子發(fā)生和生育能力沒有明顯影響。

A.typical image of testis from wild type(WT) and Cdca2 germ cell specific knockout mice aged 8 weeks; B.testis weight of WT and Cdca2 germ cell specific knockout mice aged 8 weeks; C.sperm count of 8-week old WT and Cdca2 germ cell specific knockout mice; D.hematoxylin-eosin(HE) staining of testis and epididymis sections from WT and Cdca2 germ cell specific knockout mice aged 8 weeks; E.fertility test of 8-week old WT and Cdca2 germ cell specific knockout mice

A.percentage of normal and abnormal sperm morphology; B.linearity of sperm movement; C.sperm comment on flogging frequency; D.average motility of sperm; E.progressive sperm movement; F.average sidesway amplitude of sperm head

3 討論

目前有大量研究鑒定了睪丸特異表達基因在雄性生殖中的功能及機制。研究表明睪丸高表達基因數(shù)量約為1 000個,其中約400個睪丸高表達基因被研究人員證實對精子發(fā)生和雄性生殖具有重要意義[10-11]。仍有大量睪丸高表達基因未被證實是否在精子發(fā)生過程中起到重要作用。

Cre-loxP介導(dǎo)的重組系統(tǒng)是一種強大的基因編輯工具,可以實現(xiàn)組織特異性基因編輯,因其高效性、準確性、快速性、時空特異性的優(yōu)勢,已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物的構(gòu)建[12]。細胞分裂周期相關(guān)蛋白 (cell division cycle-asociated protein,CDCAs)家族共計 8 個成員(CDCA1～8)[13]。其中CDCA2在細胞周期中參與核膜的重組、調(diào)控 DNA 損傷,并在人和小鼠睪丸組織中高表達。本研究證明Cdca2在小鼠睪丸組織中高表達,再通過構(gòu)建生殖細胞特異性敲除Cdca2小鼠模型,分析了Cdca2缺失后小鼠的精子發(fā)生和生育能力,發(fā)現(xiàn)Cdca2缺失后對小鼠精子發(fā)生和生育力并無明顯影響,此外CASA分析表明Cdca2缺失后小鼠的精子活率和活動性與野生型小鼠相當(dāng)。

RNA測序結(jié)果顯示Cdca2在精母細胞及精子細胞階段高表達,這表明CDCA2可能在精子減數(shù)分裂及精子形成時期發(fā)揮作用。但結(jié)果顯示生殖細胞特異性敲除Cdca2后,小鼠的精原細胞增殖、精母細胞減數(shù)分裂及精子形成階段均未觀察到明顯損傷。但這并不意味著生殖細胞缺失Cdca2在分子水平?jīng)]有發(fā)生明顯變化。后續(xù)可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA sequencing,RNA-seq)分析檢測Cdca2缺失后生殖細胞在轉(zhuǎn)錄水平是否改變。本研究發(fā)現(xiàn),盡管Cdca2在睪丸組織中高表達,但在雄性生育中Cdca2可能是其功能冗余,或CDCA家族的其他成員可能會補償其功能。這些數(shù)據(jù)將有助于研究人員篩選對生育、精子發(fā)生至關(guān)重要的基因,并避免研究重復(fù),為后續(xù)進一步確定CDCA2功能提供了一定的研究基礎(chǔ)。