王 星，郭 楠

1.川北醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，四川 南充 637100；2.復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院 藥劑科，上海 201199

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是肥胖和代謝綜合征的肝臟表現(xiàn),已成為嚴(yán)重影響人類健康的疾病之一,全球發(fā)病率高達20%～30%[1]。肥胖、糖尿病和胰島素抵抗均與NAFLD相關(guān),另外,NAFLD患者通常都伴隨糖代謝紊亂。目前NAFLD的治療還沒有特效藥。奧貝膽酸(obeticholic acid,OCA)是天然膽汁酸鵝去氧膽酸的一種新型衍生物,是法尼醇X核受體(famesoid X receptor,FXR)的有效激活劑,比天然膽汁酸激動FXR活性更強[2-3]。FXR是核受體超家族之一,主要分布在肝臟、腎上腺和小腸組織中,在脂肪組織、心臟和脾臟中也有表達[4]。OCA激動肝細(xì)胞上的FXR受體后,調(diào)節(jié)膽固醇合成膽汁酸的過程,抑制肝臟內(nèi)脂肪生成,抑制糖異生及發(fā)揮抗炎作用[5]。OCA被批準(zhǔn)用于治療原發(fā)性膽道疾病患者以及對熊去氧膽酸難治或不耐受膽管炎患者。此外,OCA目前正處于治療非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)的Ⅲ期臨床試驗中,并已顯示出其治療肝脂肪變性、炎性反應(yīng)和纖維化的作用[6-7]。盡管對OCA開展過很多研究,但OCA對高脂飲食喂養(yǎng)(high-fat diet,HFD)小鼠糖脂代謝的研究還鮮有報道。因此,本研究擬探討OCA對HFD小鼠的糖脂代謝的影響,為其進一步開發(fā)提供直接的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:雄性SPF級8 周齡體質(zhì)量20 g～24 g C57BL/6J小鼠[北京華阜康生物科技股份有限公司,SCXK(京)2019-0008]30只,飼養(yǎng)于川北醫(yī)學(xué)院SPF級動物房,溫度:(23±2)℃,濕度:45%～65%,自由攝食和飲水。

1.1.2 主要試劑:奧貝膽酸(上海畢得醫(yī)藥科技有限公司,純度>98%);高脂飼料(Research diets公司);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、三酰甘油(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)、高密度脂蛋白總膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白總膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司);Trizol和引物序列(Invitrogen公司);第一鏈cDNA合成試劑盒和qPCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及給藥:根據(jù)體質(zhì)量、血糖、TG和TC含量將HFD小鼠隨機分為模型組(model)和奧貝膽酸干預(yù)組(OCA,10 mg/kg,連續(xù)給藥6周),每組10只,喂正常飼料的10只小鼠作為對照組(control)。對照組和模型組灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium,CMC-Na)。

1.2.2 血清中生化指標(biāo)的測定:末次給藥后,眼內(nèi)眥靜脈叢取血0.8 mL,室溫靜置2 h后,4 ℃ 6 000 r/min離心10 min,留取血清,按說明書測定血清中脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3 肝臟指數(shù)和肝臟脂質(zhì)含量的測定:末次給藥禁食6 h后,稱重,處死小鼠,留取肝臟并稱重,根據(jù)公式計算肝臟指數(shù),肝臟指數(shù)=(肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量)×100。稱取一定質(zhì)量的肝臟,加入預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液,手術(shù)剪盡可能剪碎,機械勻漿器勻漿,冰上靜置40 min后,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清液,按說明書測定肝臟內(nèi)TG、TC和FFA含量,用BCA法測定上清液中蛋白質(zhì)含量,最終結(jié)果用蛋白質(zhì)濃度進行校正。

1.2.4 肝臟蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色檢測肝組織形態(tài):處死小鼠時留取部分肝臟固定于4%中性多聚甲醛中,石蠟包埋后用切片機切割為5 μm厚切片,之后用HE染色,染色之后用顯微鏡觀察肝臟的形態(tài)。

1.2.5 RT-qPCR檢測肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)mRNA的表達水平:測定的mRNA包括FXR、小異二聚體伴侶(small heterodimer chaperone,SHP)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding protein,SREBP)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)、乙酰輔酶A羧化酶-1(acetyl-coenzyme A carboxylase 1,ACC1)、硬脂酰輔酶A去飽和酶-1(stearoyl-coenzyme A desaturase 1,SCD1)、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1α(carnitine palmitoyl transferase-1α,CPT1α)和細(xì)胞色素P450ω-羥化酶-4A14(cytochrome P450 omega-hydroxylase 4A14,CYP4A14)。實驗方法為:稱量一定質(zhì)量的肝臟,加入Trizol,用剪刀將肝臟剪碎,機械勻漿,提取肝臟中的RNA,再用試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,逆轉(zhuǎn)條件為:25 ℃條件下10 min;之后42 ℃條件下15 min,最后85 ℃滅活5 min。隨后進行擴增反應(yīng),其擴增條件為:95 ℃ 預(yù)變性30 s,之后95 ℃ 5 s,60 ℃ 10 s,進行40個循環(huán),最后60 ℃條件下30 s。最終結(jié)果用相對定量法(2-ΔΔCt)進行分析。各目的基因的上下游引物(表1)。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequence for RT-qPCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 OCA改善HFD小鼠糖耐量異常并提高其胰島素敏感性

在葡萄糖耐量實驗(oral glucose toterance test,OGTT)實驗中, 糖負(fù)荷后, 模型組HFD小鼠每個時間點的血糖和曲線下面積(area under the curve,AUC)明顯高于對照組(P<0.01);OCA干預(yù)組顯著降低模型組30 min、120 min(P<0.01)血糖及AUC(P<0.05)。在胰島素數(shù)糖耐量實驗(insulin tolerance test,ITT)中,小鼠注射胰島素后,模型組各個時間點血糖和AUC明顯高于對照組(P<0.01),OCA干預(yù)組明顯降低模型組40 min血糖(P<0.01)和AUC(P<0.05)(圖1)。

OGTT.oral glucose tolerance test; AUC.area under the curve; ITT.insulin tolerance test; OCA.obeticholic acid; HFD.high-fat diet; A.OGTT in mice; B.AUC in OGTT; C.ITT in mice; D.AUC in ITT; #P<0.05, ##P<0.01 compared with control group; *P<0.05, **P<0.01 compared with model group

2.2 OCA改善HFD小鼠血脂代謝紊亂

模型組小鼠血清中TG(P<0.05)、TC、LDL-C和FFA含量明顯高于對照組(P<0.01),HDL-C含量明顯低于對照組(P<0.01);OCA干預(yù)組顯著降低模型組小鼠血清中TG(P<0.05)、TC、LDL-C和FFA含量(P<0.01),升高HDL-C水平(P<0.01)(表2)。

表2 OCA減輕HFD小鼠血脂代謝紊亂Table 2 OCA reduced the disorder of blood lipid metabolism in HFD mice n=10)

2.3 OCA降低HFD小鼠血清中ALT和AST活性

模型組小鼠清中ALT(P<0.05)和AST(P<0.01)活性明顯強于對照組,表明高脂飼料喂養(yǎng)對肝臟功能有一定的損害;OCA干預(yù)組明顯降低模型組小鼠血清中ALT(P<0.05)和AST(P<0.01)活性(圖2)。

ALT.alanine aminotransferase; AST.aspartate aminotransferase; OCA.obeticholic acid; HFD.high-fat diet; A.ALT activities in serum; B.AST activities in serum; #P<0.05, ##P<0.01 compared with control group; *P<0.05, **P<0.01 compared with model group

2.4 OCA改善HFD小鼠肝臟脂肪變性

HE染色結(jié)果表明,對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常, 肝細(xì)胞排列規(guī)則,肝索結(jié)構(gòu)清晰可辨,未見肝細(xì)胞脂肪變性、壞死等;模型組小鼠肝臟中可見許多大小不一的空泡狀的脂滴,肝細(xì)胞排列雜亂并伴有壞死,肝索結(jié)構(gòu)受損;OCA干預(yù)組對這些異常變化都有一定的改善(圖3)。脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)測定結(jié)果表明,模型組小鼠肝臟內(nèi)TG、TC和FFA含量明顯高于對照組(P<0.01);OCA干預(yù)組明顯降低模型組小鼠肝臟內(nèi)TG(P<0.01)、TC(P<0.05)和FFA(P<0.01)含量;此外,OCA明顯降低模型組小鼠的肝臟指數(shù)(P<0.05)(表3)。

表3 OCA降低HFD小鼠肝臟脂質(zhì)含量并降低肝臟指數(shù)Table 3 OCA reduced the liver lipid content and liver index in HFD mice n=10)

圖3 OCA對HFD小鼠肝組織形態(tài)的影響Fig 3 Effect of OCA on the morphology of liver in HFD mice

2.5 OCA調(diào)節(jié)HFD小鼠肝臟中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達

模型組小鼠肝臟中基因Fxr(P<0.01)、Shp(P<0.05)、Cpt1α(P<0.01)和Cyp4a14(P<0.01)的表達低于對照組,基因Srebp(P<0.01)、Fasn(P<0.01)、Acc1(P<0.05)、Scd1(P<0.01)的表達高于對照組;OCA干預(yù)組明顯增加模型組小鼠肝臟中基因Fxr、Shp、Cpt1α和Cyp4a14的表達(P<0.01),降低模型組小鼠肝臟基因Srebp、Fasn、Acc1的表達(P<0.05),具有降低模型組小鼠肝臟基因Scd1表達的趨勢(表4)。

表4 OCA調(diào)節(jié)HFD小鼠肝臟中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達

3 討論

OCA是激活FXR受體最具代表性且具有良好活性的一種化合物。研究報道OAC能明顯改善NAFLD、NASH以及調(diào)節(jié)2型糖尿病KKAy小鼠的糖脂代謝[6-8]。本研究證實OCA對HFD小鼠的糖耐量異常、胰島素抵抗和肝臟脂肪變性有改善作用。

本研究發(fā)現(xiàn)OCA對HFD小鼠的糖代謝有一定的作用,能明顯改善小鼠的糖耐量受損,提高其對胰島素的敏感性,與報道一致[9-10]。長期高脂飲食導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂,脂質(zhì)代謝紊亂又會促使糖代謝異常,結(jié)果發(fā)現(xiàn)OCA明顯改善HFD小鼠血清中脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo),提示OCA改善糖代謝可能與其調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝有關(guān)。肝臟是機體調(diào)節(jié)糖代謝最重要的器官,HFD容易引起肝臟脂質(zhì)蓄積,導(dǎo)致肝臟重量增加和功能受損[11]。血清ALT和AST是HFD、高膽固醇飲食和酒精引起肝組織損傷的標(biāo)志酶(酶學(xué)指標(biāo))。本研究顯示,OCA明顯降低HFD小鼠血清中這兩個酶的活性;HE染色和肝臟內(nèi)脂質(zhì)測定結(jié)果表明,OCA明顯降低肝臟內(nèi)脂質(zhì)堆積,改善肝臟病理結(jié)構(gòu)異常,進一步明確,OCA對肝臟有保護作用。同時推測,OCA可能通過延緩肝臟脂肪變性而改善肝臟功能,進而對HFD小鼠的糖代謝有一定的影響。后續(xù)研究OCA如何改善HFD小鼠肝臟脂肪變性。FXR是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子和核受體超家族的成員之一,配體與FXR結(jié)合后會誘導(dǎo)其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,同時使DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶基因啟動子中的FXR應(yīng)答元件結(jié)合,進而啟動FXR轉(zhuǎn)錄而調(diào)節(jié)靶基因,從而參與多種代謝途徑的調(diào)節(jié)[12]。SREBP也是一種核轉(zhuǎn)錄因子,通過調(diào)控脂質(zhì)相關(guān)基因(FASN、ACC1和SCD1)的表達,促進肝臟FFA及TG的合成[13]。據(jù)報道,FXR通過增強SHP的表達來抑制SREBP的表達,進而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[14]。小鼠肝臟中這些基因表達的測定結(jié)果,確實發(fā)現(xiàn)OCA增加基因Fxr、Shp表達,抑制SREBP表達。不僅如此,OCA對SREBP下游與脂質(zhì)合成及氧化相關(guān)基因的表達也有一定的調(diào)節(jié)作用。這些結(jié)果說明,OCA可能通過調(diào)節(jié)FXR/SHP/SREBP信號途徑來改善HFD小鼠肝臟脂肪變性。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn),OCA能改善HFD小鼠的糖耐量異常和血脂代謝紊亂,提高其對胰島素的敏感性,減輕HFD小鼠肝臟脂肪變性,其機制可能與調(diào)節(jié)FXR/SREBP信號途徑有關(guān)。