載脂蛋白E通過降低高爾基體膜蛋白73表達(dá)抑制小鼠肝癌細(xì)胞系增殖

侯孟杰，趙 娜，2，黃富強(qiáng)，王亞南，劉芳銘*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生理學(xué)系，北京 100005；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院 輸血科，山東 濟(jì)南 250000

載脂蛋白E(apolipoprotein E, APOE)是兩親性血漿蛋白[1],主要在肝臟合成,功能主要是神經(jīng)元修復(fù)、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)以及三酰甘油和膽固醇的運(yùn)輸和代謝[2]。APOE屬于可交換載脂蛋白家族,通過結(jié)合膜受體介導(dǎo)循環(huán)脂蛋白和組織之間的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移[1]。APOE缺乏會引起體內(nèi)血脂濃度升高,導(dǎo)致動脈粥樣硬化和非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生[2]。

高爾基體膜蛋白73(Golgi protein 73, GP73)是一種高爾基體跨膜糖蛋白,通常存在于順式高爾基體中。GP73在幾乎所有上皮細(xì)胞中表達(dá),但在正常肝細(xì)胞中低表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)GP73隨酒精性肝炎、乙型肝炎、肝硬化等病情進(jìn)展表達(dá)量逐漸增加[3],可作為肝臟疾病及肝癌診斷標(biāo)志物[4]。近期研究表明GP73高表達(dá)可促進(jìn)非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生[5]。

盡管APOE與GP73都與非酒精性脂肪性肝病相關(guān),但兩者之間是否存在調(diào)控關(guān)系尚不清楚,本研究通過在線數(shù)據(jù)分析,利用小鼠組織、肝癌細(xì)胞系,探討APOE與GP73之間的調(diào)控關(guān)系,為探索APOE或GP73異常相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和靶向治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物:Gp73敲除(Gp73-KO)及其對照小鼠(本實(shí)驗室保存)[6],Apoe敲除(Apoe-KO)小鼠及野生型(WT)小鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司),飼養(yǎng)條件均為SPF級別,動物實(shí)驗均符合“國際實(shí)驗動物應(yīng)用和管理條例”的規(guī)定和倫理要求(審批編號:ACUC-A01-2022-042)。

1.1.2 細(xì)胞系:人胚腎細(xì)胞系HEK-293FT、人源肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh7、MHCC97H、SNU398、Li-7、PLC/PRF/5(本實(shí)驗室保存);鼠源肝癌細(xì)胞系Hepa1-6(國家實(shí)驗細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺)。

1.1.3 主要試劑:DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基(Corning公司);MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、LipofectamineTM2000(Lipo2000)轉(zhuǎn)染試劑盒、LipofectamineTMRNAi MAX試劑盒(Invitrogen公司);過表達(dá)APOE(人源)質(zhì)粒(北京擎科生物科技有限公司);過表達(dá)GP73質(zhì)粒(廣州市銳博生物科技有限公司);短發(fā)夾RNA-Apoe(short hairpin RNA-Apoe,shRNA-Apoe)(上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司,序列見表1);小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)(蘇州吉瑪基因股份有限公司,序列見表2);細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司);Actin抗體、人源APOE抗體(Cell Signaling Technology公司;鼠源APOE抗體、鼠源GP73抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司);人源GP73抗體(Proteintech公司);熒光兔二抗-800通道、鼠二抗-800通道(LI-COR公司);無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(天根生化科技有限公司);雷帕霉素(rapamycin, Rapa)(Selleck公司);蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制(Roche公司)。

表1 短發(fā)夾RNA-Apoe序列Table 1 Short hairpin RNA-Apoe sequence

表2 小干擾RNA序列Table 2 Small interfering RNA sequence

1.2 方法

1.2.1 使用cBioPortal網(wǎng)站(http://www.cbioportal.org)分析TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌組織APOE與GP73基因表達(dá)情況;使用Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium(CPTAC)網(wǎng)站(https://gdc.cancer.gov/about-gdc/contributed-genomic-data-cancer-rese-rch/clinical-proteomic-tumor-analysis-consortium-cptac)分析肝癌中APOE與GP73蛋白表達(dá)情況。兩個分析網(wǎng)站的數(shù)據(jù)均在基因表達(dá)數(shù)據(jù)歸一化處理后,采用Pearson correlation統(tǒng)計學(xué)方法得出。

1.2.2 小鼠分組及處理:飼養(yǎng)Gp73敲除小鼠及其對照鼠、Apoe敲除小鼠及野生型(wild type,WT)小鼠至3月齡,斷頸處死,剖開腹腔,取新鮮肝臟、腎臟組織,后續(xù)檢測相應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)量。

1.2.3 慢病毒包裝及細(xì)胞系構(gòu)建:使用Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑將包裝質(zhì)粒PMD2G、PSPAX2和PLKO-shApoe或?qū)φ召|(zhì)粒PLKO-shNC以1∶2∶2轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞,8 h后換液,48 h后收集培養(yǎng)液上清,用0.45 μm濾膜過濾后分裝,保存至-80 ℃。將Hepa1-6細(xì)胞鋪在6孔板內(nèi),貼壁后,將病毒液和新鮮全培養(yǎng)基以2∶1加入6孔板內(nèi)感染細(xì)胞,同時加入1 000×凝聚胺增加感染效率。感染48 h后利用2 μg/mL的嘌呤霉素篩選含抗性的細(xì)胞,得到Apoe敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株及其對照細(xì)胞株。

1.2.4 細(xì)胞的分組及處理:用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素雙抗)培養(yǎng)HepG2、Huh7、MHCC97H、Li-7、PLC/PRF/5細(xì)胞;用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,1%青霉素鏈霉素雙抗和1%丙酮酸鈉)培養(yǎng)Hepa1-6細(xì)胞;用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%血清和1%青霉素鏈霉素雙抗)培養(yǎng)SNU398癌細(xì),培養(yǎng)環(huán)境均為37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染siNC、siGp73到Hepa1-6細(xì)胞中;轉(zhuǎn)染shGp73和shNC到高表達(dá)GP73的Huh7;轉(zhuǎn)染過表達(dá)GP73質(zhì)粒及對照到Hepa1-6細(xì)胞中;轉(zhuǎn)染過表達(dá)GP73質(zhì)粒及對照到低表達(dá)GP73的HepG2細(xì)胞中;轉(zhuǎn)染siNC和siApoe到高表達(dá)APOE的PLC/PRF/5;轉(zhuǎn)染過表達(dá)APOE質(zhì)粒及其對照到低表達(dá)APOE的Huh7、SNU398細(xì)胞中。其中siRNA利用RNAi MAX轉(zhuǎn)染,過表達(dá)質(zhì)粒利用lipo2000轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染方法分別按照說明書進(jìn)行,于轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞蛋白質(zhì)。

1.2.5 Western blot檢測小鼠肝腎組織及肝癌細(xì)胞系內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況:小鼠肝腎組織用裂解液研磨破碎(30 mg/mL),之后離心取上清,置于98 ℃加熱10 min,得到變性蛋白液。用加入溴酚藍(lán)的裂解液進(jìn)行稀釋,置于-20 ℃保存,可直接用于電泳。用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞,可直接提取蛋白液用于電泳。用SDS-PAGE,之后轉(zhuǎn)膜,封閉。根據(jù)目的蛋白選擇一抗4 ℃孵育過夜,用TBS清洗3遍,加入對應(yīng)二抗室溫孵育2 h,用TBS清洗3遍,在OdysseyCLX雙色紅外激光成像系統(tǒng)顯影,使用ImageJ軟件分析,以內(nèi)參蛋白為標(biāo)準(zhǔn),對蛋白質(zhì)的表達(dá)情況進(jìn)行定量。

1.2.6 CCK8法檢測細(xì)胞增殖能力:將穩(wěn)定低表達(dá)APOE的Hepa1-6細(xì)胞株及其對照細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞貼壁后用RNAi MAX轉(zhuǎn)染siRNA, 24 h后將細(xì)胞接種于96孔板,每孔接種3 000個細(xì)胞,每組設(shè)置5個復(fù)孔,待細(xì)胞貼壁開始算作0 h, 加入CCK8,2 h后檢測各孔在450 nm波長的吸光度值, 后續(xù)檢測24 h, 48 h。用GraphPad Prism 8 分析評估細(xì)胞活力。

1.2.7 CCK8法檢測藥物處理對細(xì)胞增殖影響:將穩(wěn)定低表達(dá)APOE的Hepa1-6細(xì)胞株及其對照細(xì)胞接種于96孔板,每孔接種3 000個細(xì)胞,每組設(shè)置5個復(fù)孔,待細(xì)胞貼壁加入雷帕霉素(1 nmol/L),同時設(shè)置空白組。24 h后加入CCK8,2 h后檢測各孔在450 nm波長的吸光度值,用GraphPad Prism 8分析評估細(xì)胞活力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 APOE與GP73在肝癌中負(fù)相關(guān)

在人肝癌樣品中APOE與GP73的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系,RNA相關(guān)性R值為-0.26,P<0.001(TCGA,圖1A);蛋白相關(guān)性R值為-0.27,P<0.001(CPTAC,圖1B)。APOE和GP73在MHCC97H、Huh7、HepG2、PLC/PRF/5、Li7、SNU398多種肝癌細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖1C)。

A, B.Pearson correlation analysis was performed to analyze the correlation between gene expression level of GP73 and APOE according to the TCGA database (n=372 in hepatocellular carcinoma) (A) and the CPTAC database (n=159 in hepatocellular carcinoma) (B); C.Western blot was used to analyze APOE and GP73 expression in liver cancer cell lines

2.2 敲除小鼠體內(nèi)Gp73不影響APOE表達(dá)

與對照組WT小鼠相比,Gp73敲除小鼠肝臟、腎臟中GP73幾乎不表達(dá),且APOE蛋白表達(dá)量未發(fā)生改變(圖2A, B)。

A, B.Western blots were used to analyze APOE and GP73 expression of WT(wild type) and Gp73-KO mouse liver (A) and kidney (B); *P<0.05 compared with the control group

2.3 肝癌細(xì)胞中GP73改變不影響APOE表達(dá)

在小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6中,與對照組siNC相比,Gp73敲低組GP73表達(dá)量明顯減少, APOE蛋白的表達(dá)量并未發(fā)生改變(圖3A)。同樣,在人肝癌細(xì)胞系Huh7中,敲低GP73也不會影響APOE的表達(dá)(圖3B)。在Hepa1-6及HepG2細(xì)胞中過表達(dá)GP73同樣不改變APOE蛋白表達(dá)量(圖3C, D)。

A-D.Western blots were used to analyze APOE and GP73 expression in multiple cells: Hepa1-6 siNC and siGp73-1,-2 cells (A); Huh7 shNC and shGP73 cells (B); Hepa1-6 NC and GP73-over-expression (OE) cells (C); HepG2 NC and GP73-OE cells (D); *P<0.001 compared with the control group

2.4 敲除小鼠體內(nèi)Apoe導(dǎo)致GP73表達(dá)上調(diào)

與對照組WT小鼠相比,Apoe敲除小鼠肝臟組織中GP73表達(dá)明顯上調(diào)(圖4)。

*P<0.001 compared with the control group

2.5 敲低肝癌細(xì)胞系中APOE促進(jìn)GP73表達(dá)

在小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6中,與對照組shNC相比,shApoe組的APOE表達(dá)降低,同時GP73表達(dá)明顯上調(diào)(圖5A)。在人肝癌細(xì)胞系PLC/PRF/5中,與對照組siNC相比,siAPOE組的APOE表達(dá)降低,同時GP73水平明顯上調(diào)(圖5B)。

2.6 肝癌細(xì)胞系中過表達(dá)APOE抑制GP73表達(dá)

在人肝癌細(xì)胞系Huh7和SNU398中,與對照組相比,APOE過表達(dá)組的GP73表達(dá)量明顯減少(圖5C, D)。

A-D.Western blots were used to analyze APOE and GP73 expression in multiple cells: Hepa1-6 shNC and shApoe-1,-2 cells (A); PLC/PRF/5 siNC and siAPOE-1,-2 cells (B); Huh7 NC and APOE-OE cells (C); SNU398 NC and APOE-OE cells (D); *P<0.01, **P<0.001 compared with the control group

2.7 Apoe敲低促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖

與對照組shNC相比,shApoe組的Hepa1-6細(xì)胞增殖速度明顯加快(圖6)。

*P<0.01, **P<0.001 compared with the control group

2.8 下調(diào)GP73能夠逆轉(zhuǎn)敲低Apoe促進(jìn)的細(xì)胞增殖

在Hepa1-6細(xì)胞中,與對照組 shApoe相比,shApoe-siGp73中GP73表達(dá)量下降(圖7A),且細(xì)胞增殖速度減緩(圖7B)。與對照組相比,雷帕霉素處理抑制GP73表達(dá)(圖7C),并對Apoe敲低細(xì)胞的增殖有更明顯的抑制作用(圖7D)。

A.Western blot was used to analyze APOE and GP73 expression in Hepa1-6 shApoe cells treated with siNC or siGp73; B.effect of Gp73 knockdown on the proliferation of Hepa1-6 shApoe cells; C.Western blot was used to analyze APOE and GP73 expression in Hepa1-6 shNC and shApoe cells treated with control or rapamycin (1 nmol/L); D.effect of rapamycin on the viability of Hepa1-6 shNC and shApoe cells; *P<0.01, **P<0.001 compared with the shNC group; #P<0.001 compared with the shApoe group

3 討論

肝癌與代謝性疾病密切相關(guān),非酒精性脂肪性肝病是一種由過量三酰甘油在細(xì)胞質(zhì)滯留引起的慢性肝病,病情進(jìn)展會發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、乃至肝癌[7]。GP73作為新興“明星”診斷分子,在多種腫瘤包括由非酒精性脂肪性肝進(jìn)展到肝癌的過程中隨病情進(jìn)程逐漸增加[4]。同時,研究表明GP73高表達(dá)能夠引起非酒精性脂肪性肝病和肝癌的發(fā)生[5]。APOE的研究目前多集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng),包括神經(jīng)元增殖、膜修復(fù)和重塑及阿爾茲海默病發(fā)病關(guān)聯(lián)性等[8]。此外,APOE還具有促進(jìn)膽固醇反向轉(zhuǎn)運(yùn)的功能[9],APOE缺失會導(dǎo)致小鼠血清三酰甘油和膽固醇水平增加,在高脂高膽固醇飲食喂養(yǎng)下加速非酒精性脂肪性肝、肝炎及纖維化的發(fā)生[10]。本研究中,通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)APOE與GP73負(fù)相關(guān),進(jìn)一步探究兩者之間的調(diào)控關(guān)系,對APOE降低或GP73活化引起的非酒精性脂肪性肝病、肝癌及其他疾病的治療有重要意義。

已知HCV感染導(dǎo)致GP73升高,此時GP73與APOE存在相互作用和共定位[11],但兩者之間的調(diào)控關(guān)系尚不明確。本研究結(jié)果顯示,GP73的改變不影響APOE的表達(dá),而APOE抑制GP73的表達(dá),該結(jié)果顯示兩者之間存在單向調(diào)控關(guān)系。已知APOE可以易位到細(xì)胞核,作為一個直接轉(zhuǎn)錄因子,參與營養(yǎng)支持,突觸功能,微管組裝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[1]。在發(fā)現(xiàn)APOE負(fù)調(diào)控GP73的基礎(chǔ)上,之后可以進(jìn)一步探究兩者之間調(diào)控的具體機(jī)制。

研究表明,APOE缺乏可上調(diào)AMPK/mTOR通路增強(qiáng)線粒體功能導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝[12],但目前并沒有相關(guān)的針對APOE缺失引起的非酒精性脂肪性肝乃至肝癌的靶向治療。此外,靶向APOE治療阿爾茲海默病的研究也尚未進(jìn)入臨床階段[8]。在本研究APOE下調(diào)GP73的基礎(chǔ)上,APOE降低引起的疾病可能通過靶向GP73治療。已知雷帕霉素可通過靶向mTOR抑制GP73的表達(dá)[6,13],因此其對Apoe敲低引起GP73高表達(dá)的細(xì)胞增殖有更好的抑制作用。雷帕霉素作為一種FDA批準(zhǔn)的藥物,可很快應(yīng)用于臨床試驗。本研究明確了APOE對GP73的負(fù)向調(diào)控,而抑制GP73可逆轉(zhuǎn)由Apoe敲低促進(jìn)的細(xì)胞增殖,可能是肝癌的一個病理機(jī)制和潛在的治療靶點(diǎn)。