林采青，楊申明，王振吉，李汝艷，木慧，許斌彬

（楚雄師范學(xué)院資源環(huán)境與化學(xué)學(xué)院，云南 楚雄 675000）

青葉膽（Swertia mileensis），又稱彌勒獐牙菜、肝炎草、走膽藥、小枯草等，為龍膽科獐牙菜屬植物青葉膽Swertia mileensis T.N.HoetW.L.Shih 的干燥全草[1]，主要分布于我國(guó)云南、西藏、四川等地。青葉膽有清肝利膽、清熱利濕的功效，在《云南中草藥》中記載：“清肝膽濕熱，除胃中伏火，治肝炎，尿路感染”。研究表明：青葉膽中齊墩果酸、苷類和酮類化合物在HBV、糖尿病、降血脂等方面具有良好的生理活性[2]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)青葉膽的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用等[3-5]方面，未見(jiàn)有關(guān)SMP 提取及活性方面研究。植物多酚是一類多羥基酚類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、防治心腦血管疾病等多種功效[6]，而且來(lái)源廣、毒性低，是許多新藥開(kāi)發(fā)的重要來(lái)源。因此，從植物中提取多酚并對(duì)其活性研究，對(duì)開(kāi)發(fā)利用植物多酚具有重要意義和價(jià)值。

本研究以青葉膽為材料，采用復(fù)合酶協(xié)同超聲輔助提取其多酚，研究了酶解溫度、酶解時(shí)間、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、復(fù)合酶用量（木瓜酶用量、纖維素酶用量）等對(duì)SMP 提取量的影響，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝條件；同時(shí)，對(duì)SMP 從清除DPPH 自由基、亞硝酸根離子的能力2 個(gè)方面來(lái)研究其抗氧化性，旨在為SMP 開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑 青葉膽產(chǎn)自云南楚雄，經(jīng)鑒定為龍膽科植物青葉膽（Swertia mileensis）的干燥全草；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98.0%）、福林酚（分析純）、纖維素酶、木瓜酶：北京縈萊寶科技有限公司；DPPH 自由基：梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；維生素C：西隴科學(xué)股份有限公司；無(wú)水對(duì)氨基苯磺酸鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠；N-1-萘乙二胺鹽酸鹽：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；其他所用試劑均為AR。

1.1.2 儀器與設(shè)備 UV-2100 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；SK8210HP 型超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；CP214C 型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 青葉膽材料處理 青葉膽→洗凈曬干→烘干（60 ℃）→粉碎→過(guò)60 目篩→青葉膽粉→石油醚（沸程30～60 ℃）浸泡12 h→索氏回流提取5 h（脫脂）→烘干（60 ℃）→得到去除色素和油脂的青葉膽干粉（備用）。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用Folin-Ciocalteu 法測(cè)定多酚含量[7]。以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程y=117.29x+0.014 9，線性回歸系數(shù)為R2=0.999 1。

1.2.3 SMP 提取量計(jì)算 多酚提取量計(jì)算公式為：

式中，Y 為樣品中多酚提取量（mg·g-1）；C 為待測(cè)液中多酚質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；V 為提取液的體積（mL）；N 為稀釋倍數(shù)；M 為青葉膽粉的質(zhì)量（g）。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 分別考察液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL·g-1，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%、70%、80%，酶解溫度20、30、40、50、60 ℃，酶解時(shí)間10、20、30、40、50、60 min，超聲功率200、250、300、350、400、450、500 W，復(fù)合酶用量（0%+6%、1%+5%、2%+4%、3%+3%、4%+2%、5%+1%、6%+0%，其中前者為木瓜酶，后者為纖維素酶），依次考察不同因素下各水平對(duì)SMP 提取量影響，以獲得復(fù)合酶協(xié)同超聲輔助提取SMP 的較佳水平。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)SMP 提取量影響較為顯著的酶解溫度、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、復(fù)合酶用量為自變量，SMP 提取量為因變量，設(shè)計(jì)4 因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化SMP 提取工藝參數(shù)，設(shè)計(jì)因素水平如表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平

1.2.6 抗氧化性測(cè)定 參考文獻(xiàn)[8-9]方法，稍作修改。取2.0 mL 不同質(zhì)量濃度（0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007 mg·mL-1）SMP 溶液和2.0 mLDPPH 溶液（0.2 mmol·L-1）放入試管中，避光放置30 min，在517 nm 處測(cè)定其吸光度記為A1；同樣方法測(cè)定2.0 mL 無(wú)水乙醇和2.0 mLDPPH 溶液混勻后的吸光度記為A2；2.0 mLDPPH 溶液加入2.0 mL 蒸餾水的吸光度記為A0。用維生素C 作對(duì)照，DPPH·清除率計(jì)算公式為：

參考文獻(xiàn)[10]方法，稍作修改。取不同質(zhì)量濃度（0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007 mg·mL-1）SMP4.0 mL 于具塞試管中，加入0.01 mg·mL-1亞硝酸鈉溶液4.0 mL，于37 ℃水浴中反應(yīng)30 min 后，加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液1.0 mL，靜置5 min。隨即加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液0.10 mL，加蒸餾水定容至25 mL，靜置15 min 后，于530 nm 下測(cè)吸光值記為A1。以4.0 mL 蒸餾水替代樣品測(cè)吸光記為A0，用維生素C 作對(duì)照。清除率計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比的影響 在復(fù)合酶用量6%（3%纖維素酶、3%木瓜酶）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲功率200 W、酶解溫度30 ℃、酶解時(shí)間30 min 的條件下，液料比對(duì)SMP 提取量影響見(jiàn)圖1。從圖1 可以看出，在液料比10∶1～35∶1mL·g-1范圍內(nèi)，隨著溶劑用量增大，SMP 提取量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)液料比為30∶1 mL·g-1時(shí)，SMP 提取量達(dá)到最大16.39 mg·g-1。這可能是液料比的增加使提取基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)部和外部的多酚物質(zhì)質(zhì)量濃度差增大，有利于多酚提取。當(dāng)?shù)毫媳瘸^(guò)30∶1 mL·g-1時(shí)，超聲空化能量密度的降低占了主導(dǎo)地位，對(duì)多酚提取不利[11]。因此，適宜的液料比在30:1 mL·g-1附近。

圖1 液料比對(duì)SMP 提取量的影響

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 在復(fù)合酶用量6%（3%纖維素酶、3%木瓜酶）、液料比25∶1mL·g-1、超聲功率200 W、酶解溫度30 ℃、酶解時(shí)間30 min 條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)SMP 提取量的影響見(jiàn)圖2。從圖2 可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～80%范圍內(nèi)，SMP 提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大提取量先增大后減小趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)SMP 提取量達(dá)最大為14.94 mg·g-1。這可能是一定濃度的溶劑能夠破壞酚類與多糖和蛋白質(zhì)之間的氫鍵和疏水作用力，使其提取量增加，而當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)導(dǎo)致其極性差異大反而使提取量減少[12]。因此，適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%附近。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)SMP 提取量的影響

2.1.3 酶解溫度的影響 在復(fù)合酶用量6%（3%纖維素酶、3%木瓜酶）、液料比25∶1 mL·g-1、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲功率200 W、酶解時(shí)間30 min 條件下，酶解溫度對(duì)SMP 提取量的影響見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，在酶解溫度40 ℃時(shí)，多酚提取量達(dá)到最大值15.35 mg·g-1，超過(guò)40 ℃以后，多酚提取量不再增加而有減小的趨勢(shì)，適宜的酶解溫度能促進(jìn)多酚物質(zhì)的充分溶解，但多酚物質(zhì)在高溫下不穩(wěn)定，易被氧化分解，過(guò)高的溫度反而使多酚提取量下降[13]。因此，適宜的酶解溫度在40 ℃附近。

圖3 酶解溫度對(duì)SMP 提取量的影響

2.1.4 超聲功率的影響 在復(fù)合酶用量6%（3%纖維素酶、3%木瓜酶）、液料比25∶1 mL·g-1、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、酶解溫度40 ℃、酶解時(shí)間30 min 條件下，超聲功率對(duì)SMP 提取量的影響見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，在超聲功率200～500 W 范圍內(nèi)，多酚的提取量呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)超聲功率增加至300W 時(shí)，提取量達(dá)到最大值14.60 mg·g-1，之后隨著超聲功率的增大，多酚提取率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因此，較佳超聲功率在300 W 附近。

圖4 超聲功率對(duì)SMP 提取量的影響

2.1.5 酶解時(shí)間的影響 在復(fù)合酶用量6%（3%纖維素酶、3%木瓜酶）、液料比25∶1 mL·g-1、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、酶解溫度40 ℃、超聲功率300 W 條件下，酶解時(shí)間對(duì)SMP 提取量的影響見(jiàn)圖5。從圖5可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚提取量反而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這可能是酶解時(shí)間越長(zhǎng)，乙醇和多酚間接觸時(shí)間越長(zhǎng)，有利于多酚的釋放，但時(shí)間太長(zhǎng)時(shí)，由于多酚不穩(wěn)定，加之在提取過(guò)程中氧氣的混入，會(huì)導(dǎo)致多酚氧化或分解，使多酚提取量下降[14-15]。因此，較佳酶解時(shí)間在50 min 附近。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)SMP 提取量的影響圖

2.1.6 復(fù)合酶（木瓜酶+纖維素酶）用量的影響 在復(fù)合酶用量6%（3%纖維素酶、3%木瓜酶）、液料比25∶1 mL·g-1、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、酶解溫度40 ℃、超聲功率300 W，酶解時(shí)間50 min 條件下，復(fù)合酶（木瓜酶+纖維素酶）用量對(duì)SMP 提取量的影響見(jiàn)圖6。從圖6 可以看出，SMP 的提取量與木瓜酶用量/纖維素酶用量的值成正比的關(guān)系，在木瓜酶用量/纖維素酶用量的值為2∶1 之后，多酚提取量呈下降趨勢(shì)。因此，適宜的復(fù)合酶用量用為木瓜酶用量4%、纖維素酶用量2%附近。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化SMP 的提取條件

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2。對(duì)表2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Design-Expert 8.0.5b 軟件進(jìn)行回歸擬合，得到SMP提取量Y 對(duì)自變量A、B、C 和D 的回歸方程為:Y=16.69+0.7211A+0.044 4B+0.131 4C+0.197 2D+0.074 6AB-0.389 0AC-0.218 5AD-0.005 3BC+0.330 4BD+0.067 14CD-0.883 7A2-0.721 1B2-0.345 5C2-0.385 4D2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

對(duì)回歸模型進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)與方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，回歸模型P＜0.000 1，說(shuō)明模型極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)P 值為0.327 1＞0.1，表示失擬項(xiàng)不顯著，即擬合良好。R2=0.977 5 與RAdj2=0.955 1 十分接近，說(shuō)明該模型準(zhǔn)確性好。因此，該模型可用于SMP 提取工藝優(yōu)化和預(yù)測(cè)。模型因素A、C、D、AC、AD、BD、CD、A2、B2、C2、D2極顯著。各因素對(duì)SMP 提取量的影響并非線性關(guān)系，由表3 中F值大小可知，各因素對(duì)SMP 提取量影響程度大小酶解溫度＞復(fù)合酶用量（木瓜酶+纖維素酶）＞液料比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)與方差分析

根據(jù)建立的模型，應(yīng)用Design-Expert 8.0.5b軟件可預(yù)測(cè)到SMP 最優(yōu)提取工藝參數(shù)為：酶解溫度40.45 ℃，酶解時(shí)間50 min，液料比34.88∶1 mL·g-1，乙醇體積分?jǐn)?shù)62.77%，超聲功率300 W，木瓜酶用量4.96%，纖維素酶用量1.04%，SMP 最大響應(yīng)值為17.01 mg·g-1。將優(yōu)化的提取條件進(jìn)行調(diào)整為酶解溫度40 ℃，酶解時(shí)間50 min，液料比35∶1 mL·g-1，乙醇體積分?jǐn)?shù)63%，超聲功率300 W，木瓜酶含量5%，纖維素酶含量1%。在該條件下進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，得到SMP 提取量為17.50 mg·g-1，與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差為2.88%。這說(shuō)明該模型優(yōu)化的工藝條件可作為一種有效提取SMP 的提取方法。

2.3 SMP 抗氧化性分析

2.3.1 清除DPPH·能力評(píng)價(jià) SMP 對(duì)DPPH·清除作用如圖7 所示。由圖7 可知，清除DPPH·能力隨著SMP 質(zhì)量濃度的增大而增大，在SMP 質(zhì)量濃度0.001～0.007 mg·mL-1范圍內(nèi)，當(dāng)SMP 質(zhì)量濃度為0.007 mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH·清除率為80.3%，與維生素C 清除率（93.7%）相比稍弱，但SMP 也表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除DPPH·的能力。

圖7 SMP 對(duì)DPPH·清除效果

圖8 SMP 對(duì)清除效果

3 討論與結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了復(fù)合酶協(xié)同超聲輔助提取SMP，最佳提取工藝條件為酶解溫度40 ℃，酶解時(shí)間50 min，液料比35∶1 mL·g-1，乙醇體積分?jǐn)?shù)63%，超聲功率300 W，復(fù)合酶用量6%（木瓜酶用量5%，纖維素酶用量1%），在該條件測(cè)得SMP 提取量為17.50 mg·g-1，與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差為2.88%。該試驗(yàn)優(yōu)化的提取工藝具有提取量高、提取溫度低、提取功率小等優(yōu)點(diǎn)，可作為一種有效提取SMP 的提取方法。

本研究結(jié)果表明，青葉膽中含有豐富的多酚類化合物，SMP 具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，相關(guān)研究結(jié)果對(duì)SMP 的提取及抗氧化活性成分的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。但本研究?jī)H對(duì)復(fù)合酶協(xié)同超聲輔助提取SMP 進(jìn)行抗氧化性測(cè)定，而采用復(fù)合酶協(xié)同超聲輔助提取是否會(huì)影響SMP 生物活性尚未知曉。因此，下一步的研究包含兩方面，一方面是對(duì)不同提取方法與生物活性間的關(guān)系進(jìn)行研究；另一方面是對(duì)SMP 進(jìn)一步分離、純化，探討發(fā)揮抗氧化活性的主要成分。