劉 英,程敏菊,魏鵬輝

1.開(kāi)灤總醫(yī)院心內(nèi)科,唐山 063000;2.邢臺(tái)市人民醫(yī)院心臟內(nèi)科,邢臺(tái) 054000;3.華北醫(yī)療集團(tuán)峰峰總醫(yī)院心內(nèi)科,邯鄲 056000

冠心病(coronary heart disease, CHD)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病,也稱缺血性心臟病[1]。冠心病主要由心臟自身供血不足或冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引起的血管管內(nèi)狹窄,其極易形成斑塊或阻塞血管,引發(fā)心肌細(xì)胞缺血、缺氧、死亡等[2-3]。川芎嗪(tetramethylpyrazine, TMP)是由川芎中分離出的有效成分之一,臨床上常用于治療哮喘、高血壓、血栓等疾病[4-5]。本研究旨在通過(guò)建立CHD大鼠模型,探討TMP對(duì)CHD大鼠心肌損傷的影響及其可能的作用機(jī)制,為T(mén)MP藥物開(kāi)發(fā)及冠心病臨床治療提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax M5, 美國(guó)Molecular Devices公司)。

1.2 試藥

1.3 動(dòng)物

65只7周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠,體質(zhì)量210～230 g。動(dòng)物來(lái)源于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(豫)2017-0001。所有實(shí)驗(yàn)大鼠購(gòu)回后先在動(dòng)物室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,飼養(yǎng)環(huán)境內(nèi)所有飼養(yǎng)設(shè)備均經(jīng)過(guò)高壓、高溫滅菌,飼養(yǎng)環(huán)境室內(nèi)溫度調(diào)節(jié)范圍為22 ℃～24 ℃,濕度調(diào)節(jié)范圍為45%～55%,每隔8 h進(jìn)行1次換氣,保持空氣潔凈,環(huán)境光暗周期為光照12 h、黑暗12 h,適應(yīng)期間給予普通飼養(yǎng)且自由飲水,每周更換墊料并消毒3次。

2 方法

2.1 CHD大鼠模型的建立

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)選取50只大鼠給予高脂飲食(配方各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù):基礎(chǔ)飼料70%,豬油10%,蔗糖10%,膽固醇1.5%,奶粉3.5%,纖維素5%)飼養(yǎng)8周,并在8周后,每天上午同一時(shí)段腹腔注射30 μg·kg-1垂體后葉素,連續(xù)3 d,建立CHD大鼠模型[6]。末次給藥后,采集大鼠尾靜脈血液,用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀測(cè)定大鼠各項(xiàng)血脂水平,若大鼠TC、TG水平呈倍數(shù)增加,且LDL-C水平明顯上升,則視為建模成功[7]。

2.2 分組與給藥

2.3 樣本檢測(cè)

2.3.1樣本采集 各組大鼠給藥4周后,禁食12 h,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,開(kāi)腹,采集大鼠腹主動(dòng)脈血液。血液靜置4 h,以3 000 r·min-1、離心半徑為12 cm高速離心機(jī)離心15 min,分離血清,液氮凍存。采血結(jié)束后,冰上剝離大鼠心臟組織,生理鹽水沖洗后,切取一部分組織,按1∶9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水,充分研磨后置于高速離心機(jī)離心15 min,取上清液制備10 g·L-1組織勻漿樣品。再剪取左側(cè)冠狀面中部的心肌組織,用預(yù)冷的生理鹽水多次沖洗,再用4 g·mL-1多聚甲醛液固定24 h,備用,其余組織裝入無(wú)菌凍存管內(nèi),-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2炎癥因子檢測(cè) 取出分離好的血清和ELISA試劑盒,試劑盒恢復(fù)至室溫后開(kāi)始檢測(cè),按照TNF-α、IL-1β和IL-6試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,加待測(cè)樣品20 μL于測(cè)定孔和空白孔、雙蒸水20 μL于對(duì)照孔、酶工作液20 μL于對(duì)照孔和測(cè)定孔、酶稀釋液20 μL于空白孔、底物應(yīng)用液200 μL于各孔,覆膜37 ℃孵育20 min,重復(fù)2次。加入終止液50 μL,終止反應(yīng)。根據(jù)對(duì)照品梯度質(zhì)量濃度結(jié)果建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣本質(zhì)量濃度。

2.3.3心損標(biāo)記因子檢測(cè) 將分離好的血清和ELISA試劑盒從冰箱內(nèi)取出,將試劑盒放置室內(nèi)30 min,恢復(fù)至室溫后開(kāi)始檢測(cè),按照試劑盒說(shuō)明方法測(cè)定血清中Mb、CK和CK-MB的含量。先將板孔分為空白孔、樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)孔,加入稀釋好的待檢樣品10 μL、稀釋液40 μL,封膜37 ℃孵育30 min,棄液清洗,加入酶標(biāo)液50 μL,封膜37 ℃孵育30 min,棄液清洗,加入顯色工作液A與工作液B,至呈現(xiàn)顏色梯度時(shí)加入50 μL終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)各孔A值,根據(jù)對(duì)照品質(zhì)量濃度曲線計(jì)算樣品質(zhì)量濃度。

2.3.4氧化應(yīng)激因子檢測(cè) 取制備好的組織勻漿樣品,按照MDA、GSH-Px和SOD試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,加入0.1 mL裂解液制備上清液。取適量對(duì)照品加入蒸餾水分別稀釋至1、2、5、10、20、50 μmol·L-1制備檢測(cè)工作液用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。再取0.1 mL裂解液加入空白EP管作為對(duì)照,其他管內(nèi)分別加入不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品,添加待測(cè)樣品0.1 mL、檢測(cè)工作液0.2 mL。待工作液與樣品充分混合后,置于水浴鍋60 ℃ 15 min,水浴結(jié)束后冷卻至室溫,以12 000 r·min-1離心10 min,離心半徑12 cm。取上清液200 μL,加入板孔中,于酶標(biāo)儀532 nm處檢測(cè)其吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品質(zhì)量濃度。

2.3.5HE染色觀察 取出經(jīng)甲醛固定24 h的心肌組織,流水沖洗去除固定液,不同梯度乙醇溶液進(jìn)行脫蠟脫水,浸入軟蠟、硬蠟各10 min,包埋完成后放入-20 ℃的冰箱內(nèi)20 min,取出,恢復(fù)至室溫,切片厚度為4 μm,置于37 ℃烤箱過(guò)夜,60 ℃烤箱內(nèi)60 min,切片脫蠟脫水,蘇木精染色液染色2 min,鹽酸乙醇分化5 s,流水返藍(lán)10 min,伊紅溶液染色1 min,蒸餾水清洗3次,中性樹(shù)脂封片。陰涼處晾干,將心肌組織切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍片。

2.3.6AMPK、Nrf-2和HO-1 mRNA表達(dá) 取備用心肌組織加入裂解液1 mL,研磨30 s,用TRIzol沉淀法從心肌組織中分離出總RNA,取1 μL RNA樣品測(cè)定吸光值和質(zhì)量濃度進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,配制PCR反應(yīng)體系為T(mén)ap酶0.4 μL,2×Rrel-time PCR Master Mix 10 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 5.6 μL。引物序列為AMPK:上游(5′-GTGGAGT-CCTGAACGGCTAG-3′),下游(5′-GTGCAGGCTTAACGAATTCG-3′);Nrf-2:上游(5′-GCGTAACCTTTCAGGCGTCT-3′),下游(5′-CTTCCGAAGT-CCAGATCGAT-3′);HO-1:上游(5′-AACAGATGTTTCAACAGCAC-3′),下游(5′-GGGTTGATGGCACTGTTGAG-3′);GAPDH:上游(5′-TTGCCTAGAACTGACGGAGA-3′),下游(5′-GAAATACGGTGATTCCATGG-3′)。PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃ 10 min,94 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán),繪制熔解曲線,以ΔCt值和2-△△CT進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)算待測(cè)樣品目的基因相對(duì)定量。

2.3.7AMPK、Nrf-2和HO-1蛋白表達(dá) 取備用心肌組織與預(yù)冷的PBS緩沖液混勻,離心提取總蛋白,用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。取蛋白樣品于EP管中,加入5×loding buffer于100 ℃水浴鍋5 min,冷卻后進(jìn)行蛋白凝膠電泳,恒壓80 V電泳30 min,120 V電泳120 min,至溴酚藍(lán)剛跑出即停。轉(zhuǎn)至PVDF膜,在室溫內(nèi)于牛奶封閉液60 min,TBST洗膜加入1∶2 000稀釋一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜5 min×3次,加入1∶5 000稀釋二抗,孵育2 h,TBST洗膜5 min×3次。配制ECL顯色劑,加入ECL顯色劑充分浸泡,暗室曝光顯影。進(jìn)行凝膠圖像分析,對(duì)目的條帶光密度值進(jìn)行分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 炎癥因子比較

與對(duì)照組比較,模型組TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高(P<0.05)。與模型組比,3組大鼠3項(xiàng)數(shù)值降低(P<0.05)。與TMP低劑量組比,TMP高劑量組和西藥組大鼠3項(xiàng)數(shù)值降低(P<0.05)。TMP高劑量組大鼠3項(xiàng)數(shù)值與西藥組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

3.2 心損標(biāo)記因子比較

與對(duì)照組比較,模型組Mb、CK和CK-MB水平升高(P<0.05)。與模型組比較,3組大鼠3項(xiàng)數(shù)值降低(P<0.05)。與TMP低劑量組比較,TMP高劑量組和西藥組大鼠3項(xiàng)數(shù)值降低(P<0.05)。TMP高劑量組大鼠3項(xiàng)數(shù)值與西藥組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心損標(biāo)記因子水平比較

3.3 氧化應(yīng)激因子比較

與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清MDA水平升高,GSH-Px和SOD水平降低(P<0.05)。與模型組比較,3組大鼠MDA水平降低,GSH-Px和SOD水平升高(P<0.05)。與TMP低劑量組比較,TMP高劑量組和西藥組大鼠MDA水平降低,GSH-Px和SOD水平升高(P<0.05)。TMP高劑量組大鼠3項(xiàng)數(shù)值與西藥組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激因子水平比較

3.4 心肌組織HE染色比較

對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞邊界清晰,染色均勻。心肌纖維結(jié)構(gòu)完整,未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),存在少量間質(zhì)。模型組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)異常,細(xì)胞邊界模糊,染色不均。心肌纖維排列散亂無(wú)序,間質(zhì)出現(xiàn)水腫變性的現(xiàn)象,且存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。TMP低劑量、高劑量組和西藥組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)異?，F(xiàn)象得到改善,染色均勻,界限清晰,細(xì)胞水腫變性現(xiàn)象減少,心肌纖維排列整齊,結(jié)構(gòu)完整,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象顯著減少。見(jiàn)圖1。

注:A.對(duì)照組;B.模型組;C.TMP低劑量組;D.TMP高劑量組;E.西藥組。

3.5 AMPK、Nrf-2和HO-1 mRNA比較

與對(duì)照組比較,模型組Nrf-2和HO-1 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。與模型組比較,3組大鼠Nrf-2和HO-1 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)。與TMP低劑量組比較,TMP高劑量組和西藥組大鼠Nrf-2和HO-1 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)。TMP高劑量組大鼠3項(xiàng)數(shù)值與西藥組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠AMPK、Nrf-2、HO-1 mRNA水平比較

3.6 AMPK、Nrf-2和HO-1蛋白比較

與對(duì)照組比較,模型組p-AMPK、Nrf-2和HO-1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。與模型組比較,3組大鼠3項(xiàng)數(shù)值升高(P<0.05)。與TMP低劑量組比較,TMP高劑量組和西藥組大鼠3項(xiàng)數(shù)值升高(P<0.05)。TMP高劑量組大鼠3項(xiàng)數(shù)值與西藥組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表5、圖2。

表5 各組大鼠AMPK、Nrf-2、HO-1蛋白水平比較

注:A.對(duì)照組;B.模型組;C.TMP低劑量組;D.TMP高劑量組;E.西藥組。

4 討論

TMP是一種提取自川芎的生物堿單體,現(xiàn)代藥理研究表明,TMP具有廣泛的藥理活性,如抗炎、抗氧化、降血脂、改善血流流變學(xué)以及抑制血小板聚集等作用[10-12]。高脂飲食聯(lián)合后腔注射垂體后葉素法是近年研究心血管疾病的經(jīng)典誘導(dǎo)物質(zhì),因其操作簡(jiǎn)單、病理進(jìn)程與人類心肌缺血疾病類似,被廣泛應(yīng)用于心血管疾病研究以及相應(yīng)藥物開(kāi)發(fā)[13]。故本研究用高脂飲食聯(lián)合后腔注射垂體后葉素法建立CHD大鼠模型,從分子機(jī)制上探討TMP對(duì)大鼠心肌損傷的改善作用,探究其可能的作用機(jī)制。結(jié)果顯示,模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、Mb、CK、CK-MB和MDA水平升高,GSH-Px和SOD水平降低,提示模型組大鼠心損嚴(yán)重且伴有炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng),在給予TMP和西藥的干預(yù)下均表現(xiàn)出TNF-α、IL-1β、IL-6、Mb、CK、CK-MB和MDA水平降低,GSH-Px和SOD升高,炎癥因子水平降低且抗氧化因子水平升高,心肌損傷標(biāo)記物水平也隨之降低,提示TMP和西藥均在一定程度上緩解心肌損傷;此外,心肌組織HE染色結(jié)果也表現(xiàn)出形態(tài)異?，F(xiàn)象得到改善,細(xì)胞水腫變性現(xiàn)象減少,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象顯著減少。

AMPK是一種在真核生物細(xì)胞中廣泛表達(dá)且高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[14],對(duì)炎癥和氧化應(yīng)激具有重要調(diào)節(jié)作用,可提高AMPK活性[15]、降低ROS水平、增加SOD生成[16],增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[17]。研究表明,AMPK/Nrf 2/HO-1信號(hào)通路不僅是機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)通路之一,還與炎性反應(yīng)相關(guān)[18],激活Nrf 2表達(dá)可協(xié)調(diào)炎癥細(xì)胞募集,調(diào)控抗炎基因表達(dá)[19],在氧化還原反應(yīng)和抗炎反應(yīng)之間提供一個(gè)接口,發(fā)揮抗氧化損傷和抗炎反應(yīng)等作用[20]。在本研究中,TMP各劑量組和西藥組AMPK、Nrf-2和HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平較模型組大鼠均顯著升高,結(jié)合大鼠血清中炎性因子和抗氧化因子水平變化,TMP可激活A(yù)MPK/Nrf 2/HO-1信號(hào)通路,對(duì)CHD大鼠心肌損傷有積極影響。

綜上所述,TMP能夠調(diào)整血清中炎性因子和抗氧化因子水平,改善大鼠心肌損傷,其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/Nrf 2/HO-1信號(hào)通路發(fā)揮抗炎抗氧化作用的,可為臨床治療ALD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。