柚皮素基于Th1/Th2軸對(duì)妊娠高血壓大鼠癥狀的改善

臧密密,付雪蓮,李格琳

1.滄州市人民醫(yī)院妊娠糖尿病科,滄州 061000;2.滄州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,滄州 061000;3.滄州市人民醫(yī)院產(chǎn)科,滄州 061000

妊娠期高血壓疾病是妊娠晚期的一種并發(fā)癥,也是一種常見(jiàn)妊娠相關(guān)疾病,包括妊娠高血壓(pregnancy induced hypertension,PIH)、慢性高血壓、子癇和先兆子癇[1]。PIH是孕婦、胎兒以及新生兒發(fā)病和死亡的主要原因之一,PIH發(fā)病率為7%～12%,高于世界平均發(fā)病率,嚴(yán)重影響臨床環(huán)境中母體和胎兒的預(yù)期壽命[2]。已有研究證實(shí),PIH可改變胎兒脈管系統(tǒng)和心臟結(jié)構(gòu)發(fā)育,并在后續(xù)生活中誘導(dǎo)后代血壓升高[3]。柚皮素是4′,5,7-三羥基黃烷酮,為一種天然黃烷酮,廣泛存在于柚子、橙子等柑橘類水果中,因其廣泛的生物活性備受關(guān)注[4]。研究表明,柚皮素具有多種顯著藥理特性,如抗癌、抗糖尿病及對(duì)肝腎胃、心臟和神經(jīng)的保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)作用[5]。柚皮素的多類有效活性含多種基本分子機(jī)制,涉及不同疾病多個(gè)水平細(xì)胞信號(hào)通路融合,因此,柚皮素在治療不同疾病方面具有巨大潛力[6]。本研究通過(guò)建立PIH模型,研究柚皮素對(duì)PIH大鼠及子代生長(zhǎng)的影響,為柚皮素有關(guān)藥物開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供新方向。

1 儀器與材料

1.1 儀器

多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific有限公司;化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Fluor Chem FC3)購(gòu)自美國(guó)Protein Simple公司。

1.2 試藥

柚皮素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,貨號(hào)480-41-1)購(gòu)自武漢恒和達(dá)生物醫(yī)藥有限公司;硝苯地平片(國(guó)藥準(zhǔn)字H44023986)購(gòu)自廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司;干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ,貨號(hào)SBJ-R0041)、白細(xì)胞介素12(interleukin-12,IL-12,貨號(hào)SBJ-R0658)及白細(xì)胞介素10(interleukin-10,IL-10,貨號(hào)SBJ-R0095)ELISA試劑盒,均購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司;白細(xì)胞介素33(interleukin-33,IL-33,貨號(hào)ab236714))ELISA試劑盒、兔抗鼠Th1淋巴細(xì)胞趨化因子C-X-C-基元受體3(Chemokine C-X-C-primitive receptor 3,CXCR3,貨號(hào)ab288437)、C-C趨化因子受體5(CC-chemokine receptor 5,CCR5)多抗(貨號(hào)ab65850)、Th2淋巴細(xì)胞C-趨化因子C受體類型3(C-chemokine C receptor type 3,CCR3)多抗(貨號(hào)ab32512),均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

80只SPF級(jí)SD雌性大鼠和40只雄性大鼠,體質(zhì)量為180～220 g,8周齡,購(gòu)自南通藥明康德醫(yī)藥科技有限公司,許可證號(hào)為SCXK(蘇)2019-0008,室內(nèi)溫度24 ℃±1 ℃,空氣相對(duì)濕度為55%±5%,光照晝夜交替循環(huán)12 h,飼養(yǎng)1周。

2 方法

2.1 建模與分組

60只雌性大鼠經(jīng)高脂高糖飲食喂養(yǎng)4周后,與雄性大鼠合籠過(guò)夜(雌雄比例2∶1),次日,顯微鏡觀察雌性大鼠陰道處出現(xiàn)精子或黏液栓現(xiàn)象,即妊娠成功,記為妊娠第1天,取妊娠成功51只雌性大鼠,妊娠15 d后開(kāi)始靜脈注射亞硝基左旋精氨酸甲酯(80 mg·kg-1·d-1),持續(xù)15 d,誘導(dǎo)建立妊娠期高血壓PIH模型[7-8]。妊娠30 d后用無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓監(jiān)測(cè)器測(cè)量血壓,其收縮壓超過(guò)原基礎(chǔ)血壓30 mmHg、舒張壓超過(guò)原基礎(chǔ)血壓15 mmHg,即造模成功[9]。取建模成功的43只大鼠,隨機(jī)剔除3只后分為模型組、柚皮素低劑量組、柚皮素高劑量組和陽(yáng)性藥物組,每組各10只。剩余雌性大鼠正常飲食和妊娠,成功妊娠13只,隨機(jī)剔除3只后為對(duì)照組,于妊娠15 d后靜脈注射等體積生理鹽水,每日1次,持續(xù)15 d。

2.2 干預(yù)方法

建模成功后,依據(jù)參考文獻(xiàn)[10]用量,柚皮素低、高劑量組和陽(yáng)性藥物組灌胃給藥分別為50 、100 mg·kg-1柚皮素溶液及50 mg·kg-1硝苯地平溶液,對(duì)照組和模型組灌胃等體積生理鹽水0.5 mL,每日1次,共計(jì)6周。

2.3 常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)

末次給藥后24 h,通過(guò)代謝籠收集大鼠次日8點(diǎn)至第2天8點(diǎn)24 h尿液,量杯計(jì)算總尿量,混勻后離心(4 000 r·min-1,10 min,4 ℃),取上清10 mL,用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定24 h尿蛋白(24 h UTP),留尿結(jié)束2 h后,無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓監(jiān)測(cè)器測(cè)定大鼠尾動(dòng)脈靜息血壓值。

2.4 血清炎性因子檢測(cè)

常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)束后,取大鼠腹部主動(dòng)脈血,離心取上清(3 000 r·min-1,10 min),ELISA法檢測(cè)血清IFN-γ、IL-12、IL-10及IL-33含量。設(shè)置對(duì)照品孔和樣本孔,對(duì)照品孔加不同質(zhì)量濃度對(duì)照品100 μL,樣本孔先加5倍稀釋的上清液100 μL,后于各孔加入HRP標(biāo)記的抗體,37 ℃溫育1 h,洗板,加入底物A、B避光孵育15 min,50 μL終止液終止反應(yīng),酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大鼠血清IFN-γ、IL-12、IL-10及IL-33含量。

2.5 觀測(cè)仔鼠體質(zhì)量、產(chǎn)仔數(shù)量及死亡率

大鼠妊娠期結(jié)束后,記錄生產(chǎn)的仔鼠數(shù)量和體質(zhì)量,并計(jì)算其死亡率。

2.6 腎組織CXCR3等指數(shù)水平檢測(cè)

處死大鼠,無(wú)菌摘取腎組織,勻漿,Trizol法提RNA,測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)、質(zhì)量濃度,逆轉(zhuǎn)錄得cDNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系:Taq聚合酶1.6 μL ,上下游引物各0.6 μL,模板cDNA 1 μL, 雙蒸水16.2 μL,擴(kuò)增條件為預(yù)變性(95 ℃,30 s)、變性(95 ℃,5 s)、退火(59 ℃,30 s),共40個(gè)循環(huán),加熔解曲線,降溫(50 ℃,30 s)。以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照,檢測(cè)CXCR3、CCR5、CCR3 mRNA水平,數(shù)據(jù)分析用2-△△Ct法,重復(fù)多次,取Ct均值。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.7 腎組織CXCR3等蛋白水平檢測(cè)

處死大鼠,取腎組織,加RIPA裂解緩沖液,離心取上清(7 000 r·min-1,10 min,離心半徑為20 cm),蛋白BCA試劑盒測(cè)定總蛋白質(zhì)量濃度,加熱變性蛋白,統(tǒng)一蛋白上樣量,用SDS-PAGE凝膠電泳將待測(cè)蛋白樣品電泳分離(100 V,80 min),轉(zhuǎn)至PVDF(250 mA),用體積分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶磷酸鹽緩沖液封閉(2 h),將樣品與CXCR3(1∶250)、CCR5(1∶250)、CCR3(1∶250)一抗4 ℃過(guò)夜孵育,TBST緩沖液洗膜,加二抗HRP標(biāo)記IgG室溫孵育(1∶2 000,2 h),洗膜,曝光,顯影。Image J軟件測(cè)樣品與GAPDH條帶灰度值。計(jì)算目標(biāo)(CXCR3、CCR5及CCR3)蛋白相對(duì)表達(dá)水平,即目標(biāo)條帶與GAPDH條帶灰度比值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 常規(guī)指標(biāo)水平

雌性大鼠24 h UTP、收縮壓及舒張壓組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組24 h UTP、收縮壓及舒張壓升高(P<0.05);與模型組比較,柚皮素低、高劑量組、陽(yáng)性藥物組24 h UTP、收縮壓及舒張壓降低(P<0.05);與柚皮素低劑量組比較,柚皮素高劑量組、陽(yáng)性藥物組24 h UTP、收縮壓及舒張壓降低,且陽(yáng)性藥物組低于柚皮素高劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 常規(guī)指標(biāo)水平比較

3.2 血清相關(guān)炎性因子水平

血清IFN-γ、IL-12、IL-10及IL-33水平組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組血清IFN-γ、IL-12升高,IL-10、IL-33水平降低(P<0.05);與模型組比較,柚皮素低劑量、高劑量組、陽(yáng)性藥物組血清IL-10、IL-33水平升高,IFN-γ、IL-12水平降低(P<0.05);與柚皮素低劑量組比較,柚皮素高劑量組、陽(yáng)性藥物組血清IL-10、IL-33水平升高,IFN-γ、IL-12水平降低(P<0.05);與柚皮素高劑量組比較,陽(yáng)性藥物組血清IL-10、IL-33水平升高,IFN-γ、IL-12水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 血清IFN-γ、IL-12、IL-10及IL-33水平比較

3.3 仔鼠出生數(shù)量和體質(zhì)量及死亡率

仔鼠出生數(shù)量和體質(zhì)量及死亡率組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組仔鼠出生數(shù)量和體質(zhì)量增加、死亡率升高(P<0.05);與模型組比較,柚皮素低劑量、高劑量組及陽(yáng)性藥物組仔鼠出生數(shù)量和體質(zhì)量減少、死亡率降低(P<0.05);與柚皮素低劑量組比較,柚皮素高劑量組、陽(yáng)性藥物組血清仔鼠出生數(shù)量和體質(zhì)量減少、死亡率降低,且陽(yáng)性藥物組低于柚皮素高劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 仔鼠出生數(shù)量、體質(zhì)量及死亡率比較

3.4 腎組織相關(guān)因子mRNA水平

腎組織CXCR3、CCR5及CCR3 mRNA水平組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組CXCR3、CCR5 mRNA水平升高,CCR3 mRNA水平降低(P<0.05);與模型組比較,柚皮素低劑量、高劑量組及陽(yáng)性藥物組CCR3 mRNA水平升高,CXCR3、CCR5 mRNA水平降低(P<0.05);與柚皮素低劑量組比較,柚皮素高劑量組、陽(yáng)性藥物組CCR3 mRNA水平升高,CXCR3、CCR5 mRNA水平降低(P<0.05);與柚皮素高劑量組比較,陽(yáng)性藥物組CCR3 mRNA水平升高,CXCR3、CCR5 mRNA水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 腎組織CXCR3、CCR5、CCR3 mRNA水平比較

3.5 腎組織相關(guān)蛋白水平

腎組織CXCR3、CCR5及CCR3蛋白水平組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組CXCR3、CCR5蛋白水平升高,CCR3蛋白水平降低(P<0.05);與模型組比較,柚皮素低、高劑量組、陽(yáng)性藥物組CCR3蛋白水平升高,CXCR3、CCR5蛋白水平降低(P<0.05);與柚皮素低劑量組比較,柚皮素高劑量組、陽(yáng)性藥物組CCR3蛋白水平升高,CXCR3、CCR5蛋白水平降低(P<0.05);與柚皮素高劑量組比較,陽(yáng)性藥物組CCR3蛋白水平升高,CXCR3、CCR5蛋白水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表6、圖1。

表6 腎組織CXCR3、CCR5及CCR3蛋白水平比較

注:A.對(duì)照組;B.模型組;C.柚皮素低劑量組;D.柚皮素高劑量組;E.陽(yáng)性藥物組。

4 討論

PIH是一種典型的以妊娠后半期新發(fā)高血壓為特征的疾病,是各種生理病理變化中最常見(jiàn)的不利于子宮環(huán)境的疾病之一[11]。目前,胰島素抵抗、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)功能障礙、炎癥、肥胖引起神經(jīng)體液和腎臟機(jī)制相互作用已被認(rèn)為是PIH的促成因素,但其機(jī)制尚不明確[2]。

妊娠期的正常細(xì)胞環(huán)境包括來(lái)自先天免疫和適應(yīng)性免疫的促炎和抗炎成分[12],與以Th2和Treg細(xì)胞反應(yīng)和細(xì)胞因子譜占主導(dǎo)地位的Th2型免疫狀態(tài)為特征的正常妊娠相反,PIH由于Th1型免疫和促炎細(xì)胞因子而占優(yōu)勢(shì)[13],當(dāng)機(jī)體免疫功能受損、Th1/Th2平衡狀態(tài)被打破時(shí),會(huì)導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞失衡引起妊娠期相關(guān)疾病發(fā)生[14-15]。Th1驅(qū)動(dòng)反應(yīng)由Th1淋巴細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子介導(dǎo),如IL-12、IFN-γ和腫瘤壞死因子-α;而Th2驅(qū)動(dòng)反應(yīng)由抗炎細(xì)胞因子介導(dǎo),如IL-4、1L-10和1L-33等,可用于評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)[16-17]。本研究結(jié)果表明,與模型組比較,柚皮素各劑量組血清IL-10、IL-33水平升高,24 h UTP、收縮壓、舒張壓指標(biāo)、血清IFN-γ、IL-12水平、仔鼠死亡率降低,仔鼠出生數(shù)量和體質(zhì)量減少,表明用柚皮素進(jìn)行干預(yù)后,可有效調(diào)節(jié)PIH大鼠血壓,減輕炎性反應(yīng),緩解對(duì)子代生長(zhǎng)影響,修復(fù)Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡。

Th1/Th2失衡已被認(rèn)為是自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制之一[18]。研究發(fā)現(xiàn),趨化因子受體CXCR3和CCR5主要在Th1型淋巴細(xì)胞上表達(dá),而CCR3受體則在Th2型淋巴細(xì)胞上表達(dá),且CXCR3、CCR5和CCR3已作為區(qū)分Th1/Th2型淋巴細(xì)胞標(biāo)記,這些受體與趨化細(xì)胞因子相結(jié)合,在許多生理病理過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[19]。已有研究表明,由T細(xì)胞亞群功能失調(diào)性失衡介導(dǎo)的免疫疾病可能與免疫血小板減少癥改變有關(guān),此外,Th1/Th2趨化因子受體異常表達(dá)可能在肝硬化和脾功能亢進(jìn)的脾免疫疾病中發(fā)揮作用,這反過(guò)來(lái)又可以解釋外周血細(xì)胞減少癥,因此,Th1/Th2趨化因子受體的異常表達(dá)可能在自身免疫疾病中發(fā)揮作用[20]。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,柚皮素低劑量組、柚皮素高劑量組腎組織CCR3 mRNA和蛋白水平升高,CXCR3、CCR5 mRNA和蛋白水平降低,表明柚皮素可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2軸關(guān)鍵分子表達(dá)減輕PIH疾病,降低機(jī)體自身免疫功能損傷。

綜上所述,柚皮素能夠調(diào)節(jié)血壓,改善PIH大鼠炎性反應(yīng)和機(jī)體免疫功能損傷,調(diào)控Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡,其作用機(jī)制可能與Th1/Th2軸激活有關(guān),可為臨床治療PIH提供參考。