紀(jì) 翔,林 謙,徐江林,周 鹍,劉 靜,逯金金,高 群

射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)又稱舒張性心力衰竭(diastolic heart failure,DHF),其病理機(jī)制與舒張期心室主動(dòng)松弛性和被動(dòng)順應(yīng)性受損有關(guān)[1]?！吨袊难芙】蹬c疾病報(bào)告2019概要》[2]指出,我國約有890萬例心力衰竭病人,其中接近50%的心力衰竭病人是射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭。射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭病人生活質(zhì)量下降,發(fā)病率、死亡率高,給社會(huì)、經(jīng)濟(jì)帶來巨大負(fù)擔(dān)[3]。但是射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的發(fā)病機(jī)制、有效治療尚未明確,是目前心力衰竭研究的難點(diǎn)[4]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭病機(jī)以“氣虛為本”,黨參(DS)是補(bǔ)氣的代表藥物之一,在慢性心力衰竭的治療中能有效地改善病人的癥狀,提高病人的生活質(zhì)量。現(xiàn)代藥理研究表明,黨參具有保護(hù)心肌細(xì)胞、改善心肌能量代謝、抗心肌細(xì)胞氧化、改善心功能、抗凝等作用[5-6]。但是目前黨參對(duì)射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的作用機(jī)制尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種新興的藥物研究方法,可以全面、系統(tǒng)地探索藥物與疾病的關(guān)系,為研究中藥復(fù)雜的分子機(jī)制提供了有力的工具[7]。本研究將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究黨參對(duì)射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 黨參有效成分篩選及潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[8]檢索黨參的活性成分。設(shè)置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30%、化合物類藥性(drug-likeness,DL)>0.18。將有效成分2D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)[9]數(shù)據(jù)庫,預(yù)測(cè)黨參潛在靶點(diǎn)。

1.2 射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)的收集 以射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭和舒張性心力衰竭為關(guān)鍵詞,分別檢索DisGeNET(http://www.disgenet.org/)和GeneCards(https://www.genecards.org/)[10-11]數(shù)據(jù)庫,獲取射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 黨參治療射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的共同靶點(diǎn) 通過在線軟件作圖工具Interacti Venn構(gòu)建韋恩圖,獲得黨參-射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的共同靶點(diǎn)。

1.4 黨參-有效成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape 3.7.2軟件,構(gòu)建“黨參-有效成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),黨參、有效成分和潛在靶點(diǎn)以“節(jié)點(diǎn)”顯示,節(jié)點(diǎn)間的相互作用以“邊”顯示。使用Cytoscape軟件中的Network Analyzer插件計(jì)算Degree值,篩選黨參的核心成分。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將黨參-射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭共同靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)[12],設(shè)置置信度>0.7,隱藏網(wǎng)絡(luò)中無關(guān)聯(lián)的節(jié)點(diǎn),將結(jié)果文件保存為tsv格式,導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件,使用其cytoHubba插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,篩選黨參治療射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6 基因本體(gene ontology,GO)功能與京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析 將黨參-射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的共同靶點(diǎn)輸入Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/gp/index.html)[13]進(jìn)行GO功能與KEGG通路富集分析。GO 功能分析可獲得生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能,用于描述基因靶點(diǎn)的功能;KEGG通路富集分析可獲得黨參-射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭共同靶點(diǎn)所富集的信號(hào)通路。

1.7 分子對(duì)接 將獲得的核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,獲得對(duì)接親和力以反映分子間的結(jié)合穩(wěn)固性。使用AutoDockTools進(jìn)行分子處理,AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接,PyMol2.4.0進(jìn)行可視化[14-15]。

2 結(jié) 果

2.1 黨參的有效成分以及潛在靶點(diǎn) 經(jīng)過OB、DL篩選以及剔除無靶點(diǎn)成分,共獲得黨參有效成分16個(gè)(見表1)。通過Swiss Target Prediction預(yù)測(cè),刪除重復(fù)值后獲得黨參的潛在靶點(diǎn)385個(gè)。

表1 黨參有效成分基本信息

2.2 射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn) 以舒張性心力衰竭、射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭為關(guān)鍵詞檢索GeneCards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫,收集靶點(diǎn)并去除重復(fù)值后獲得射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)1 001個(gè)。

2.3 黨參-射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭共同靶點(diǎn) 將385個(gè)黨參潛在靶點(diǎn)和1 001個(gè)射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)輸入在線軟件作圖工具,繪制韋恩圖獲得黨參-射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭共同靶點(diǎn)116個(gè)。詳見圖1。

圖1 黨參-射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭共同靶點(diǎn)的韋恩圖

2.4 黨參-有效成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及黨參核心成分的篩選 將黨參的16個(gè)有效成分及385個(gè)靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.7.2軟件,獲得黨參-有效成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(見圖2)。使用Network Analyzer插件計(jì)算Degree值,Degree值提示成分與作用靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)個(gè)數(shù),Degree值越大表明該成分越重要,Degree值排名前3位的成分為黨參的核心成分,分別是7-甲氧基-2-甲基異黃酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone,Degree=108)、木犀草素(Luteolin,Degree=105)和11-羥基蘭金斷腸草堿(11-Hydroxyrankinidine,Degree=100)。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及黨參治療射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 將黨參-射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭共同靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫,設(shè)置置信度>0.7獲得PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖3)。使用cytoHubba插件根據(jù)Degree值對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,獲得5個(gè)黨參治療射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的關(guān)鍵靶點(diǎn),分別是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)1、原癌基因酪氨酸蛋白激酶(SRC)、蛋白激酶B1(AKT1)、MAPK3、表皮生長因子受體(EGFR),詳見表2。

圖3 黨參治療射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選(A為黨參-射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭PPI網(wǎng)絡(luò)圖;B為黨參治療射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的關(guān)鍵靶點(diǎn)圖)

表2 黨參治療射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的關(guān)鍵靶點(diǎn)信息

2.6 GO功能和KEGG通路富集分析

2.6.1 GO功能富集分析結(jié)果 生物學(xué)過程主要集中在:MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的正調(diào)控(positive regulation of MAPK cascade),循環(huán)系統(tǒng)過程(circulatory system process),激素水平的調(diào)節(jié)(regulation of hormone levels),調(diào)節(jié)離子傳輸(regulation of ion transport),細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)(cellular response to nitrogen compound)等。細(xì)胞組分主要集中在膜筏(membrane raft)、受體復(fù)合體(receptor complex)、突觸前膜的固有成分(intrinsic component of presynaptic membrane)、初級(jí)內(nèi)體(early endosome)和細(xì)胞頂端(apical part of cell)等。分子功能主要集中在:腎上腺素受體活性(adrenergic receptor activity),蛋白激酶活性(protein kinase activity),輔因子結(jié)合(cofactor binding),激素結(jié)合(hormone binding)和激酶結(jié)合(kinase binding)等。詳見圖4～圖6。

圖4 GO功能富集分析排名前20位的生物學(xué)過程

圖5 GO功能富集分析排名前20位的細(xì)胞組分

圖6 GO功能富集分析排名前20位的分子功能

2.6.2 KEGG通路富集分析結(jié)果 通路主要富集于癌癥(pathways in cancer)、環(huán)磷酸鳥苷/蛋白激酶信號(hào)通路(cGMP/PKG signaling pathway)、內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance)、神經(jīng)活性配體/受體相互作用(neuroactive ligand/receptor interaction)和血清素能突觸(serotonergic synapse)等。詳見圖7。

2.7 分子對(duì)接分析 將排名前3位的核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,獲得的平均對(duì)接親和力為-36.4 kJ/mol(見表3,對(duì)接親和力越小,表明配體與受體蛋白的結(jié)合越穩(wěn)定)。AKT1與11-hydroxyrankinidine分子對(duì)接結(jié)果最佳(見圖8)。

表3 分子對(duì)接結(jié)果

圖8 AKT1與11-Hydroxyrankinidine分子對(duì)接模式圖

3 討 論

根據(jù)射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭胸悶、氣短、唇紫、下肢水腫等癥狀體征,可將其歸于中醫(yī)“心悸”“喘證”“水腫”等范疇,病位在心,《內(nèi)經(jīng)》有言:“心主血脈”,血液的正常運(yùn)行需要心氣的鼓動(dòng),心氣不足會(huì)致氣血運(yùn)行不暢,瘀血內(nèi)阻,因此氣虛為本貫穿始終,瘀、水為標(biāo)是該病的主要病機(jī)[16]?！侗静輳男隆纷钤缬涊d了黨參的作用:“補(bǔ)中益氣,和脾胃除煩渴”,作為一種藥食兩用的藥物,黨參具有多種現(xiàn)代藥理作用[17],可明顯改善病人的心力衰竭癥狀[18-21];既往研究顯示,黨參能改善心力衰竭小鼠心肌細(xì)胞電生理重構(gòu)[22];增加黨參等益氣藥的比例,能更好地改善大鼠心室舒縮功能[23];單用或聯(lián)合運(yùn)用黨參、黃芪可糾正細(xì)胞能量代謝重構(gòu),提高鈣瞬變峰值,縮短回落時(shí)間,從而改善心功能[24-25]。在目前無切實(shí)有效的治療藥物的情況下,從中醫(yī)角度探索治療射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的方法具有一定意義[26],本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了黨參在射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭治療中的潛在機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示,通過TCMSP平臺(tái),設(shè)置OB和DL值篩選以及剔除無靶點(diǎn)成分,確定了16個(gè)黨參有效成分,通過構(gòu)建黨參-有效成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)最終確定了黨參治療射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的3個(gè)核心成分,分別是7-甲氧基-2-甲基異黃酮、木犀草素、11-羥基蘭金斷腸草堿。7-甲氧基-2-甲基異黃酮和木犀草素都屬于黃酮類化合物[27],黃酮類化合物能抑制腫瘤、炎癥,預(yù)防心血管疾病[28],增加一氧化氮(NO)的含量,減少活性氧(ROS)和促炎細(xì)胞因子的水平,從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[29]。氧自由基對(duì)心臟重構(gòu)具有重要作用,活性氧簇會(huì)加速心力衰竭的發(fā)展[30],木犀草素不僅能通過調(diào)控心肌細(xì)胞內(nèi)過量氧自由基的生成,逆轉(zhuǎn)線粒體DNA損傷,還可以通過調(diào)節(jié)MAPK途徑減少脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激,從而延緩心力衰竭[31-32]。在改善心肌重構(gòu)方面,其能恢復(fù)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化因子β1和結(jié)締組織生長因子(CTGF)基因的表達(dá),防治心肌纖維化和肥大[33],研究表示,心肌纖維化和細(xì)胞外膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)的變化與射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的嚴(yán)重程度有關(guān)系[34]。肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶(SERCA2a)的表達(dá)在心臟舒縮過程中發(fā)揮重要作用[35],木犀草素能改變SERCA2a的表達(dá)、活性和穩(wěn)定性,同時(shí)激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路,調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡、代謝等,調(diào)節(jié)Ca2+循環(huán),改善心肌細(xì)胞的收縮和舒張功能[36]。上述證據(jù)證明,黃酮類化合物可能是黨參治療射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的有效成分。

對(duì)116個(gè)藥物與疾病的共同靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析獲得5個(gè)黨參治療射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的關(guān)鍵靶點(diǎn),分別是:MAPK1、SRC、AKT1、MAPK3、EGFR。MAPK1、MAPK3是MAPK家族中的成員,是許多生物信號(hào)的結(jié)合點(diǎn)。目前認(rèn)為MAPK通路主要由細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2、Jun氨基末端激酶(JNK)、p38、ERK5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組成,通過激活3級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng),可以引起各種細(xì)胞增殖、遷移、分化、自噬和炎癥反應(yīng)等,與慢性心力衰竭等多種心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[37-38]。抑制MAPK3磷酸化,可以減少心肌纖維化、炎癥反應(yīng),從而抑制心肌細(xì)胞中凋亡分子FasL誘導(dǎo)的擴(kuò)張型心肌病和充血性心力衰竭的發(fā)展[39]。SRC是非受體酪氨酸激酶中的一種原癌基因,在多種細(xì)胞類型中廣泛表達(dá),SRC可在慢性壓力負(fù)荷超載和急性機(jī)械牽張的情況下被激活[40-41],磷酸化的SRC與PI3K/AKT、MAPKs介導(dǎo)的炎癥通路有關(guān)[42]。EGFR屬于酪氨酸激酶受體家族,經(jīng)過活化的EGFR可激活下游PI3K/AKT和MAPK促進(jìn)細(xì)胞增殖[43]?；谕贩治?黨參治療射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的通路主要與癌癥(pathways in cancer)、環(huán)磷酸鳥苷/蛋白激酶信號(hào)通路(cGMP/PKG signaling pathway)、內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance)、神經(jīng)活性配體/受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)和血清素能突觸(serotonergic synapse)有關(guān)。冠狀動(dòng)脈微血管內(nèi)皮炎癥引起NO的生物利用度和PKG的活性降低,致心肌細(xì)胞和間質(zhì)纖維化,造成心肌肥大的發(fā)展,可能是射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的機(jī)制之一[44]。cGMP/PKG信號(hào)通路可能通過調(diào)節(jié)不同的生物學(xué)功能參與射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的發(fā)病機(jī)制,很多射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭病人存在心室病理性肥大,伴有間質(zhì)纖維化和舒張期心室肌硬化,在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)PKG刺激具有有效的抗纖維化作用,并且對(duì)壓力超負(fù)荷肥大心臟起到明顯的保護(hù)作用[45-46]。實(shí)驗(yàn)表明,黨參組的紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板的數(shù)量明顯升高,而NO參與了此機(jī)制,其可使血管擴(kuò)張、cGMP含量增加,從而維持動(dòng)脈基礎(chǔ)張力[47]。結(jié)合GO分析結(jié)果,黨參治療射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的作用可能是通過介導(dǎo)cGMP/PKG、MAPK、PI3K/AKT等信號(hào)通路抑制炎癥、凋亡,調(diào)節(jié)代謝等多種生物學(xué)過程的整體調(diào)控發(fā)揮作用的。

綜上所述,本研究結(jié)果表明黨參可能通過作用于多個(gè)靶點(diǎn),調(diào)節(jié)多條通路,抑制炎癥反應(yīng),改善代謝,從而達(dá)到防治射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的目的,采用分子對(duì)接的方法對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證,黨參的核心成分能與其最佳結(jié)合,其可靠性獲得驗(yàn)證,為深入探討黨參治療射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的作用機(jī)制提供了科學(xué)的思路,并為下一步的臨床和基礎(chǔ)研究提供方向。