盧源達,鐘巧芳,王 波,張敦宇,殷富有,王玲仙,程在全,陳 玲

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所,云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室,農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室,云南 昆明 650205;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院,云南 昆明 650224)

稻黃單胞桿菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)可在水稻的各個生長階段進行為害,是造成水稻白葉枯病(Bacterial blight,BB)的元兇。一般情況下,該病害能致使水稻產(chǎn)量減少10%～20%,環(huán)境適宜時,可致水稻減產(chǎn)一半或絕收[1-2]。Xoo的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion systems,T3SSs)能夠分泌轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)子(Translation activator-like effector,TALE)和非類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)子(Non-translation activator-like effector,non-TALE)[3-4],當(dāng)效應(yīng)子進入水稻細胞后會激活或抑制水稻的免疫系統(tǒng),進而導(dǎo)致水稻抗、感差異的表型產(chǎn)生[5],其中TALEs是其主要的致病因子。與此同時,Xoo菌株能夠在短時間內(nèi)不斷變異出強致病性的菌株,進而分泌出新的效應(yīng)子來攻破水稻產(chǎn)生的抗性[6]。然而,在水稻與Xoo的博弈中,水稻也進化出許多白葉枯病抗性基因(Xa),如:NLR、SWEET、TFIIAγ和Executor類的抗性基因[7-8]。

水稻是世界上一半人口以上的口糧作物。中國又是世界第一大水稻種植國,在長江以南的稻作區(qū)水稻白葉枯病頻頻發(fā)生,其余稻作區(qū)近年也有抬頭趨勢[9]。在水稻生產(chǎn)中,常使用化學(xué)防治的方法來防治水稻白葉枯病,其方法具有治標(biāo)不治本的特點,并且極易造成環(huán)境污染。長期的育種實踐證明,利用抗源(抗性基因R)培育抗性品種來防治水稻白葉枯病效果最佳。然而,野生稻被譽為植物中的大熊貓,優(yōu)良性狀刻在基因里。目前,已發(fā)現(xiàn)的抗白葉枯病基因約有1/4來自野生稻。其中,Xa23(Chr.11)、Xa30(Chr.11)、Xa47(t)a(Chr.11)供體材料是普通野生稻 (O.rufipogon),Xa45(t)(Chr.4)供體材料是一年生普通野生稻(O.nivara),Xa29(Chr.1)供體材料是藥用野生稻(O.officinalis),xa32(Chr.12)供體材料是疣粒野生稻(O.meyeriana),還有Xa21(Chr.11)、Xa27(Chr.6)、Xa35(Chr.11)、Xa32(Chr.11)、Xa36(Chr.11)、xa41(Chr.11)等基因的供體材料來源于其他野生稻[10-12]。由此可見,野生稻中蘊含眾多白葉枯病抗性基因。

相較于其他野生稻,普通野生稻與栽培稻關(guān)系最近,其蘊含的R基因更容易運用到栽培稻中[13]。元江普通野生稻(后續(xù)簡稱“YP”)作為亞洲栽培稻起源中心之一,蘊含寶貴的基因庫,對其進行發(fā)掘和利用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重大意義。因此,利用YP創(chuàng)制種質(zhì)資源,進而應(yīng)對不同Xoo生理小種的危害。本研究以元江普通野生稻、合系35及其滲入系后代L214和G252為研究材料,利用10個已報道并已克隆的抗水稻白葉枯病基因?qū)┰嚥牧线M行功能標(biāo)記篩選、同源克隆、序列分析和實時熒光定量PCR(qRT-PCR),進而明確這些材料中是否含有這些R基因的抗性同源基因,也為進一步的挖掘利用元江普通野生稻及其滲入系后代種質(zhì)資源中的R基因奠定理論基礎(chǔ)并提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選用元江普通野生稻(♂)、HX35(♀)、滲入系BC2F16材料L214(IL)和G252(IL)用于后期的DNA和RNA提取以及接菌鑒定;含有目標(biāo)基因的IRBB1(Xa1)、IRBB3(Xa3/Xa26)、IRBB4(Xa4)、IRBB5(xa5)、IRBB7(Xa7)、IRBB10(Xa10)、IRBB13(xa13)、IRBB21(Xa21)、海南文昌普通野生稻(Xa23)、IRBB27(Xa27)用于后續(xù)基因鑒定的陽性對照材料;IR24(不含已克隆的白葉枯病抗性基因)用于后續(xù)基因鑒定的陰性對照材料。

1.2 水稻材料抗性鑒定

所有水稻材料(YP、HX35、L214、G252)均種植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所的人工氣候室(光照16 h,黑暗10 h,溫度23～28 ℃,相對濕度60%～100%)。采用劍葉剪葉的方法,對生長至孕穗期的供試水稻材料接9個不同生理小種的菌株(菌株信息詳見表1),接種后溫室培養(yǎng)條件下觀察記錄[14]。待病情穩(wěn)定后15～21 d對其進行病害調(diào)查。抗性評價參照Yang等[15]的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行:病斑長度小于等于5 cm為抗病(R),>5 cm為感病(S)。

表1 9個Xoo菌株來源信息Tab.1 9 Xoo strains information sources

1.3 抗性同源基因檢測

采用CTAB法提取植物基因組總DNA[16]。選用10個已克隆白葉枯病抗性基因的功能標(biāo)記對YP、HX35、L214、G252進行分子鑒定。Xa1、Xa3/Xa26、Xa4、xa5、Xa7、Xa10、xa13、Xa21、Xa23、Xa27等10個基因的功能標(biāo)記參照Zhao等[17]2021年已報道的序列。從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下載Xa7、Xa10、Xa23基因的序列,并設(shè)計特異性引物克隆基因。具體引物信息見表2 。采用高保真酶2×Phanta@ Max Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司,P525)進行PCR擴增,PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按其說明書進行。PCR擴增后取5 μL PCR產(chǎn)物使用1%～3%瓊脂糖凝膠電泳(膠的濃度根據(jù)目的片段大小而定)中檢測,用凝膠成像系統(tǒng)拍照,剩余PCR反應(yīng)產(chǎn)物送昆明擎科生物科技有限公司進行測序。測序結(jié)果利用BioXM 2.7.1進行分析。

表2 本試驗用到的引物Tab.2 Primers used in this experiment

1.4 接菌誘導(dǎo)處理

取YP、HX35、L214、G252的種子至培養(yǎng)皿中進行保濕萌芽處理。待其萌發(fā)轉(zhuǎn)至溫室(28 ℃光照12 h/23 ℃黑暗8 h,濕度90%)中培養(yǎng)至水稻分蘗后期,進行接菌(PXO99A菌株)處理,于 0,24,48,72,96 h 對葉片進行取樣,用液氮進行速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.5 Quantitative Real-time PCR

使用 Eastep?Super RNA LS1040 提取試劑盒(Promega)進行基因組總RNA提取。利用HiScript? Ⅲ RT SuperMix for qPCR(南京諾唯贊生物科技有限公司,P323-01)試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用 NCBI 在線引物設(shè)計工具,根據(jù)抗病基因的CDS序列,設(shè)計基因表達引物,具體擴增引物信息見表2。以Actin1作為內(nèi)參基因,參照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司,Q711)進行反應(yīng)體系的配比, qRT-PCR 擴增,擴增程序為:95 ℃預(yù)變性 30 s;95 ℃ 8 s,60 ℃ 30 s,40 個循環(huán)。使用 2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量,利用 Excel 和SPSS整理和分析數(shù)據(jù),使用 GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 元江普通野生稻及2份滲入系后代對白葉枯病的抗性鑒定

用中國的1～7、9號生理小種代表菌株及菲律賓6號生理小種代表菌株P(guān)XO99A,在水稻分蘗后期進行接種,接種后15～21 d,以6 cm為抗感分界,結(jié)果顯示,YP、L214和G252對供試的9個菌株表現(xiàn)出高抗且病斑度均小于2 cm,滲入系母本HX35則表現(xiàn)出高感且病斑長度均超過10 cm(圖 1)。

圖1 接種不同Xoo生理小種的表型Fig.1 Phenotypes of different Xoo races inoculated

2.2 元江普通野生稻及2份滲入系后代白葉枯病抗性基因的鑒定

利用10個已經(jīng)克隆的水稻白葉枯病抗性基因(Xa1、Xa3/Xa26、Xa4、xa5、Xa7、Xa10、xa13、Xa21、Xa23和Xa27)的功能標(biāo)記對YP、HX35、L214和G252進行檢測,由表3和圖2可知,YP中能擴增到Xa7、Xa10抗病條帶,大小依次為275,540 bp;HX35能擴增到760 bp的Xa23抗病條帶;L214均不含任何抗病條帶;G252能擴增到275 bp的Xa7抗病條帶和760 bp的Xa23抗病條帶。為了進一步明確含有抗病功能標(biāo)記材料中是否存在假陽性標(biāo)記,根據(jù)Xa7、Xa10、Xa23基因的序列,設(shè)計特異性引物進行克隆相應(yīng)基因,結(jié)果顯示,YP中能擴增到Xa10的同源片段卻不能擴增到Xa7和Xa23的同源片段;HX35、L214和G252中能擴增到Xa23的同源片段卻不能擴增到Xa7和Xa10的同源片段(圖2)。

表3 抗白葉枯病基因的等位標(biāo)記/同源片段情況Tab.3 The presence of allelic markers/fragments of BB resistance genes

O.rufipogon.海南文昌普通野生稻。O.rufipogon.Hainan Wenchang common wild rice.圖2 白葉枯病抗性基因的PCR鑒定Fig.2 Identification of resistance genes to bacterial blight by PCR

2.3 元江普通野生稻及2份滲入系中抗病同源基因的序列分析

將YP中的Xa10抗病同源片段序列與IRBB10中的Xa10基因序列進行比對,結(jié)果顯示,兩者的CDS區(qū)域序列一致但EBEAvrXa10位點序列差異較大,鑒于隱性xa10基因的序列尚無報道,因此,可認(rèn)為YP中含有Xa10的同源基因(圖3)。Xa23與xa23的序列差異主要是在啟動子區(qū)域,兩者CDS區(qū)域序列一致。將含有抗病同源片段的3份供試材料HX35、L214、G252中的Xa23與已公布的Xa23(CBB23)/xa23(JG30)啟動子序列比對,結(jié)果顯示,供試材料與感病基因xa23的EBEAvrXa23序列一致,因此,可以認(rèn)為HX35、L214、G252中含有感病基因xa23。值得注意的是HX35中的XA23與JG30中XA23的第4位和第56位氨基酸序列存在差異(圖4,5)。

紅色框區(qū)域的核苷酸序列分別代表Xa10基因啟動子的EBEAvrXa10位點序列。The nucleotide sequences in the red box region represent the EBEAvrXa10 locus sequence of the Xa10 gene promoter,respectively.圖3 Xa10 (YP)與Xa10 (IRBB10)的序列比對Fig.3 Sequence alignment of Xa10 (YP)and Xa10 (IRBB10)

紅色框區(qū)域的核苷酸序列分別代表Xa23基因啟動子的EBEAvrXa23位點序列。The nucleotide sequences in the red box region represent the EBEAvrXa23 locus sequence of the Xa23 gene promoter,respectively.圖4 Xa23同源基因序列比對Fig.4 Represents the sequence alignment of Xa23 homologous allele

紅色背景代表氨基酸序列的差異。Red background represents the difference of amino acid sequence.圖5 XA23蛋白序列比對Fig.5 XA23 protein sequence alignment

2.4 抗病同源基因的表達分析

為了進一步驗證Xa10、Xa23是否在供試材料中發(fā)揮功能,于孕穗期對供試材料接PXO99A進行 5 個不同時間點脅迫處理,結(jié)果顯示,在5個時間段目標(biāo)基因皆未上調(diào)表達(圖 6)。值得注意的是,YP、HX35、L214、G252中的免疫激活標(biāo)志基因OsPR1a和OsPR10皆在0～48 h上調(diào)表達,48 h后逐漸下調(diào)表達(圖6)。

內(nèi)參基因Actin1;不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The internal reference gene Actin1;Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05).圖6 PXO99A 處理后Xa10和Xa23的表達分析Fig.6 Expression analysis of Xa10 and Xa23 under PXO99A treatment

3 結(jié)論與討論

元江普通野生稻與自然環(huán)境協(xié)同進化,但未有馴化痕跡[18-19]。本研究利用中國的8個不同生理小種和1個菲律賓生理小種接種元江普通野生稻及創(chuàng)制的滲入系后代L214和G252,發(fā)現(xiàn)YP、L214和G252對所有菌株表現(xiàn)出抗性。介于YP和現(xiàn)代栽培稻存在一定的生殖隔離,直接運用起來會有一定的困難,然而創(chuàng)制的滲入系后代可以突破這一難題。L214和G252擁有YP的血脈的同時還擁有對Xoo的廣譜抗性,這些種質(zhì)資源可用于后續(xù)的基因挖掘和抗病育種。

植物和病原菌這場軍備賽從未停歇過,水稻和黃單胞桿菌的互作符合經(jīng)典的基因?qū)蚣僬f。應(yīng)對不同致病性的Xoo生理小種出現(xiàn),水稻也不斷進化出新的R基因[20]。Xa7、Xa10、Xa23皆是Executor類的抗性基因,擁有較寬的抗菌譜[21]。本研究利用分子標(biāo)記鑒定結(jié)合同源克隆的方法,發(fā)現(xiàn)HX35中含有Xa23的抗病同源片段,但其對所有供試菌株表現(xiàn)出感病,進一步的序列分析發(fā)現(xiàn),HX35中的Xa23與xa23啟動子的EBEAvrXa23序列一致,由此說明HX35中的Xa23是一個隱性感病基因。YP的分子標(biāo)記檢測結(jié)果顯示,其可能含有Xa7、Xa10、Xa23的抗性同源基因,進一步的同源克隆發(fā)現(xiàn)其并未擴增到Xa7和Xa23,說明YP中不含有Xa7和Xa23。盡管YP分子標(biāo)記和同源克隆皆檢測到Xa10,但序列分析發(fā)現(xiàn)EBEAvrXa10位點核苷酸序列差異較大,不能判定YP中的Xa10是抗性基因,還有待進一步研究。值得注意的是滲入系后代L214在分子檢測鑒定時并未檢測到任何抗病同源片段,但其卻對所有的供試菌株表現(xiàn)出抗性,說明該材料可能含有新基因。類似的是,滲入系后代G252中雖然分子標(biāo)記檢測到Xa7,但進一步的同源克隆卻未克隆到Xa7,說明其不含有該基因。由此可見,Xa7、Xa10、Xa23基因的功能分子標(biāo)記有待進一步的開發(fā)與利用。

Xa10、Xa23在水稻體內(nèi)的表達受到Xoo體內(nèi)對應(yīng)的AvrXa10、AvrXa23蛋白的誘導(dǎo)表達,本研究用到的PXO99A菌株正好滿足誘導(dǎo)表達的菌株要求[6,22]。結(jié)果顯示,YP中的Xa10,HX35、L214、G252中的Xa23,均未受到PXO99A的誘導(dǎo)而表達。為證明誘導(dǎo)表達的成功,本研究利用2個免疫激活的標(biāo)志基因OsPR1a和OsPR10來指示,結(jié)果顯示YP、HX35、L214、G252的免疫反應(yīng)皆被激活,由此說明這些基因在供試材料中不發(fā)揮功能,也在一定程度上說明了YP、L214和G252中可能含有新的R基因。