郭勝微， 邊思文， 丁建文， 張曉辰， 楊興， 杜錦*， 向春陽(yáng)*

（1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300392； 2.天津中天潤(rùn)農(nóng)科技有限公司，天津 300000）

糯玉米是玉米第9 號(hào)染色體wx基因發(fā)生隱性突變后，直鏈淀粉含量顯著降低的特殊類型玉米[1]。與普通玉米相比，糯玉米胚乳中均為支鏈淀粉，具有獨(dú)特的口感和豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可用于鮮食、輕工業(yè)等[2]。據(jù)中國(guó)種子協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)糯玉米種植面積已由21 世紀(jì)初的不足7 萬(wàn)hm2發(fā)展至80萬(wàn)hm2左右[3]。

低溫脅迫是一種常見(jiàn)的非生物脅迫。受環(huán)境影響，全球氣溫波動(dòng)較大，對(duì)世界各國(guó)作物生產(chǎn)均造成嚴(yán)重的損失和危害[4-5]。玉米是典型的喜溫C4作物，各生長(zhǎng)階段對(duì)低溫都很敏感，最適宜的萌發(fā)溫度為25 ℃，若溫度過(guò)低則會(huì)降低種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和活力指數(shù)等，干擾種子正常萌發(fā)[6]。此外，低溫會(huì)造成活性氧大量積累[7]，引發(fā)代謝紊亂[8]，造成出苗率差、生長(zhǎng)緩慢、生育期延遲等現(xiàn)象，影響作物的品質(zhì)和產(chǎn)量[9]。我國(guó)東北及華北地區(qū)糯玉米種植面積大，品種繁多，為了獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益，種植者更傾向于早春提前播種，這樣會(huì)造成糯玉米的萌發(fā)期正值氣溫較低的時(shí)節(jié)，容易遭受倒春寒影響，因此耐低溫糯玉米品種的篩選尤為重要。

當(dāng)前對(duì)糯玉米萌發(fā)期耐低溫評(píng)價(jià)并沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但單一指標(biāo)無(wú)法全面展示糯玉米種質(zhì)特性，不能準(zhǔn)確反映糯玉米耐低溫能力，因此，利用不同分析方式對(duì)多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)以得到客觀準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)信息尤為重要。當(dāng)前利用率較高的綜合評(píng)價(jià)方法主要有主成分分析法[10]、隸屬函數(shù)法[11]、灰色關(guān)聯(lián)分析法[12]和聚類分析等[13]。劉杰等[14]利用主成分分析法對(duì)81 個(gè)玉米品種萌發(fā)期耐冷性進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，并結(jié)合聚類分析將其按耐冷性強(qiáng)弱分為5 類。褚力嘉等[15]結(jié)合主成分分析法、隸屬函數(shù)法和聚類分析法，將13 個(gè)測(cè)定指標(biāo)轉(zhuǎn)化為3 個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)，將20 份玉米材料按萌發(fā)期耐冷性強(qiáng)弱劃分為3 大類。這種綜合評(píng)價(jià)方法結(jié)合多種分析方式，能夠更好地反映種質(zhì)的特性。前人對(duì)普通玉米萌發(fā)期耐低溫能力的研究較為廣泛，但關(guān)于糯玉米耐低溫綜合評(píng)價(jià)方面的報(bào)道還比較少，因此，本研究以48 個(gè)糯玉米品種為試驗(yàn)材料，以萌發(fā)期各指標(biāo)的相對(duì)值作為耐低溫評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)主成分分析法、隸屬函數(shù)法和聚類分析等對(duì)各糯玉米品種的耐低溫能力做出準(zhǔn)確鑒定和評(píng)價(jià)，以期為耐低溫糯玉米的篩選和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)在天津農(nóng)學(xué)院種子實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，選用48個(gè)糯玉米品種作為供試材料（表1）。

表1 48個(gè)供試糯玉米品種Table 1 48 tested waxy maize varieties

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用低溫發(fā)芽試驗(yàn)，糯玉米種子用1.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒20 min，蒸餾水沖洗3 次。隨機(jī)取100 粒種子均勻擺放于發(fā)芽盒中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)，每個(gè)品種4 次重復(fù)，恒溫培養(yǎng)。其中，低溫處理組于12 ℃低溫培養(yǎng)20 d；對(duì)照組于25 ℃培養(yǎng)7 d，每天記錄發(fā)芽種子數(shù)。發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

測(cè)定項(xiàng)目包括發(fā)芽勢(shì)（germination energy，GE）、發(fā)芽率（germination rate，GR）、活力指數(shù)（vigor index，Ⅵ）、苗長(zhǎng)（seedling length，SL）、根長(zhǎng)（root length，RL）、根表面積（root surface area，RSA）、根體積（root volume，RV）、根系數(shù)（roots number，RN）、苗干重（seedling dry weight，SDW）和根干重（root dry weight，RDW）。

每天測(cè)定種子的發(fā)芽數(shù)，發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)為胚根≥種子長(zhǎng)、胚芽≥1/2 種子長(zhǎng)。發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的計(jì)算方法參見(jiàn)《種子學(xué)》[16]。其中處理組發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的測(cè)定時(shí)間分別為第16天和第20天；對(duì)照組發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的測(cè)定時(shí)間分別為第4天和第7天。

選取有代表性的幼苗10 株，采用刻度尺測(cè)量苗長(zhǎng)（cm），取平均值；采用WinRHIZO 根系分析系統(tǒng)測(cè)定根長(zhǎng)(cm)、根表面積(cm2)、根體積(cm3)和根系數(shù)(根)；將幼苗和根分別于烘箱105 ℃殺青30 min，80 ℃持續(xù)烘干至恒重，測(cè)定苗干重(g)和根干重(g)。

采用測(cè)定指標(biāo)的相對(duì)值表示耐低溫系數(shù)(low temperature tolerance coefficient，LTTC)，計(jì)算公式如下。

1.4 耐低溫綜合評(píng)價(jià)

為減小不同方法間的差異對(duì)整體評(píng)價(jià)結(jié)果的影響，通過(guò)主成分分析法、隸屬函數(shù)法和聚類分析對(duì)糯玉米品種的耐低溫能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。首先利用主成分分析法確定主成分個(gè)數(shù)，將各指標(biāo)轉(zhuǎn)化為可以代表多個(gè)指標(biāo)表達(dá)信息的綜合指標(biāo)；再利用隸屬函數(shù)法計(jì)算綜合評(píng)價(jià)值（D值），對(duì)48 個(gè)糯玉米品種的耐低溫能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，并進(jìn)行聚類分析。

其中，Xj表示第j個(gè)綜合指標(biāo)；Xmin表示第j個(gè)綜合指標(biāo)最小值；Xmax表示第j個(gè)綜合指標(biāo)最大值；Pj為某主成分j的貢獻(xiàn)率。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Excel 2021 和SPSS 25. 0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理和統(tǒng)計(jì)分析，利用Origin 2021 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 48個(gè)糯玉米品種耐低溫指標(biāo)的相關(guān)分析

對(duì)10 個(gè)指標(biāo)的相對(duì)值進(jìn)行相關(guān)性分析，如圖1 所示。10 個(gè)指標(biāo)間均呈正相關(guān)，除相對(duì)根系數(shù)與相對(duì)發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)苗干重間相關(guān)不顯著外，其余指標(biāo)間均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

圖1 低溫脅迫下48個(gè)糯玉米品種各指標(biāo)相關(guān)性Fig. 1 Correlation of indexes of 48 waxy maize varieties under chilling stress

2.2 48個(gè)糯玉米品種耐低溫主成分分析

糯玉米萌發(fā)期的耐低溫能力是復(fù)雜的數(shù)量性狀[17]，受多種因子調(diào)控，單一的指標(biāo)無(wú)法準(zhǔn)確反映各品種間的差異性。為了更全面地分析糯玉米品種地耐低溫性，采用主成分分析法進(jìn)一步評(píng)價(jià)。對(duì)測(cè)定的10 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行抽樣適合性檢驗(yàn)（Kaiser-Meyer-Olkin，KMO）和巴利特球體檢驗(yàn)（Bartlett test），結(jié)果（表2）表明，KMO 為0.726（＞0.6），顯著性為0.000（＜0.05），因此拒絕巴利特球體檢驗(yàn)的零假設(shè)。

表2 KMO和Bartlett適合性檢驗(yàn)Table 2 KMO and Bartlett compatibility test

各項(xiàng)指標(biāo)間關(guān)聯(lián)程度較高，適合采用主成分分析法，以特征值大于1 為原則，提取出2 個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到79.183%（表3）。第1 主成分的特征值為6.477，貢獻(xiàn)率為64.766%，代表的主要指標(biāo)包括相對(duì)根干重、相對(duì)根表面積、相對(duì)根體積、相對(duì)根長(zhǎng)和相對(duì)苗長(zhǎng)，可反映低溫脅迫下糯玉米的根系生長(zhǎng)狀態(tài)；第2 主成分的特征值為1.442，貢獻(xiàn)率為14.417%，代表的主要指標(biāo)包括相對(duì)苗干重、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)根系數(shù)和相對(duì)發(fā)芽勢(shì)，可反映低溫脅迫下糯玉米的萌發(fā)情況，其中相對(duì)根系數(shù)對(duì)第2 主成分的影響為負(fù)向。

設(shè)相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)苗長(zhǎng)、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)根表面積、相對(duì)根體積、相對(duì)根系數(shù)、相對(duì)苗干重和相對(duì)根干重依次為X1～X10，根據(jù)表3 主成分特征向量，可得出2 個(gè)主成分的得分表達(dá)式。

根據(jù)Y1和Y2，可得出糯玉米耐低溫綜合得分模型。

綜合得分Y代表了糯玉米的耐低溫能力，Y值越大說(shuō)明該品種糯玉米的耐低溫能力越強(qiáng)。

2.3 48個(gè)糯玉米品種耐低溫隸屬函數(shù)綜合分析

結(jié)合隸屬函數(shù)法進(jìn)一步對(duì)糯玉米耐低溫進(jìn)行綜合分析。將2 個(gè)主成分的綜合評(píng)價(jià)值，根據(jù)公式（2）（3）和（4）計(jì)算2 個(gè)主成分下的隸屬函數(shù)值U1、U2及權(quán)重和綜合評(píng)價(jià)值（D值）。如表4 所示，2 個(gè)主成分下的權(quán)重分別為0.818 和0.182。對(duì)于第1 主成分來(lái)說(shuō)，‘潤(rùn)彩糯686'的隸屬函數(shù)值最大，‘潤(rùn)糯597'的隸屬函數(shù)值最小，說(shuō)明在第1 主成分下，‘潤(rùn)彩糯686'表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐低溫能力，而‘潤(rùn)糯597'的耐低溫能力較弱。對(duì)于第2 主成來(lái)說(shuō)，‘景坡82'的隸屬函數(shù)值最大，‘潤(rùn)糯622'的隸屬函數(shù)值最小，說(shuō)明在第2主成分下，‘景坡82'表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐低溫能力，‘潤(rùn)糯622'的耐低溫能力較弱。計(jì)算48 個(gè)糯玉米品種的D值，結(jié)果（表4）表明，耐低溫能力較強(qiáng)的5個(gè)糯玉米品種依次為‘潤(rùn)彩糯686'‘景坡82'‘潤(rùn)糯175'‘潤(rùn)糯605'‘天貴糯932'；對(duì)低溫較為敏感的5個(gè)糯玉米品種依次為‘潤(rùn)糯597'‘津糯72'‘津糯69'‘華耐甜糯358'‘津糯711'。

表4 48個(gè)糯玉米品種耐低溫主成分得分、權(quán)重、隸屬函數(shù)值、D值Table 4 Principal component score， weight， membership function value and D value of low temperature tolerance of 48 waxy maize varieties 續(xù)表Continued

表4 48個(gè)糯玉米品種耐低溫主成分得分、權(quán)重、隸屬函數(shù)值、D值Table 4 Principal component score， weight， membership function value and D value of low temperature tolerance of 48 waxy maize varieties 續(xù)表Continued

表4 48個(gè)糯玉米品種耐低溫主成分得分、權(quán)重、隸屬函數(shù)值、D值Table 4 Principal component score， weight， membership function value and D value of low temperature tolerance of 48 waxy maize varieties

2.4 48個(gè)糯玉米品種耐低溫聚類分析

根據(jù)48 個(gè)糯玉米品種的D值采用系統(tǒng)分類法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果（圖2）表明，在歐氏距離為5 時(shí)，48 個(gè)糯玉米品種被劃分成耐低溫型、較耐低溫型、低溫較敏感型和低溫敏感型4 個(gè)類群。其中耐低溫型有5 個(gè)糯玉米品種，占測(cè)定品種的10.42%，包括‘潤(rùn)彩糯686'‘景坡82'‘潤(rùn)糯175'‘潤(rùn)糯605'和‘天貴糯932'，D值變化范圍為0.938～0.757；較耐低溫型有22 個(gè)糯玉米品種，占測(cè)定品種的45.83%，包括‘景糯307'‘潤(rùn)黑糯729'‘潤(rùn)黑糯829'‘潤(rùn)甜糯70'和‘潤(rùn)甜糯828'等，D值變化范圍為0.709～0.505；低溫較敏感型有12個(gè)糯玉米品種，占測(cè)定品種的25%，包括‘潤(rùn)潤(rùn)糯73'‘潤(rùn)糯197'‘景頗556'‘津糯215'和‘景甜糯1248'等，D值變化范圍在0.491～0.356；低溫敏感糯玉米品種有9 個(gè)，占測(cè)定品種的18.75%，包括‘潤(rùn)糯1704'‘潤(rùn)甜糯907'‘津糯69'‘津糯72'和‘潤(rùn)糯597'等，D值變化范圍在0.323～0.128。

圖2 48個(gè)糯玉米品種耐低溫聚類分析圖Fig. 2 Cluster analysis of low temperature tolerance of 48 waxy maize varieties

2.5 評(píng)價(jià)耐低溫糯玉米品種的回歸模型

為更快捷地評(píng)價(jià)糯玉米品種的耐低溫能力，利用回歸分析對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行篩選，建立糯玉米耐低溫評(píng)價(jià)的數(shù)學(xué)模型。將10 個(gè)性狀的耐低溫系數(shù)作為自變量， 耐低溫綜合評(píng)價(jià)值D值作為因變量，進(jìn)行逐步回歸分析，最終建立回歸方程。

方程決定系數(shù)R2=0.995，代表回歸方程可以很好地反映糯玉米的耐低溫能力。在同一條件下，只需測(cè)定不同基因型糯玉米的相對(duì)根干重（RRDW）、相對(duì)苗長(zhǎng)（RSL）、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)（RGE）、相對(duì)發(fā)芽率（RGR）、相對(duì)苗干重（RSDW）和相對(duì)根表面積（RRSA） 6個(gè)指標(biāo)，利用方程便可估算出D值大小，對(duì)糯玉米品種耐低溫能力進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。

3 討論

萌發(fā)期是糯玉米對(duì)低溫脅迫十分敏感的階段[18]，低溫脅迫會(huì)降低種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)，出現(xiàn)種子萌發(fā)和出苗緩慢、幼苗活力減弱等不良影響[19]。前人對(duì)普通玉米低溫脅迫的一些研究將處理組溫度設(shè)置為10 ℃[14,20]，Mohamed 等[21]采用日間溫度為10 ℃、夜間溫度為4 ℃對(duì)玉米進(jìn)行處理，結(jié)果表明ZmPgb1.1的過(guò)表達(dá)會(huì)減弱玉米低溫脅迫期間活性氧（reactive oxygen species，ROS）誘導(dǎo)的損傷，調(diào)節(jié)玉米對(duì)低溫脅迫的抗性。但本研究室通過(guò)前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10 ℃低溫脅迫下很多糯玉米品種出現(xiàn)不萌發(fā)或萌發(fā)后死亡的現(xiàn)象，說(shuō)明糯玉米品種在萌發(fā)期對(duì)低溫脅迫較普通玉米更加敏感。因此本試驗(yàn)設(shè)置12 ℃為低溫脅迫溫度。不同糯玉米品種本身的遺傳特性不同，各品種的耐低溫能力存在差異[22]，隨著糯玉米育種的快速發(fā)展，我國(guó)已積累大量的糯玉米種質(zhì)資源，為簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確地分析篩選出在萌發(fā)期耐低溫較強(qiáng)的糯玉米種質(zhì)，客觀系統(tǒng)的耐低溫評(píng)價(jià)體系尤為重要。

前人對(duì)不同作物萌發(fā)期耐低溫評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇雖有不同，但主要集中在發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等種子萌發(fā)指標(biāo)[23-24]，對(duì)根系指標(biāo)鮮有關(guān)注。實(shí)際上根系性狀與作物耐低溫能力密切相關(guān)，Zhao 等[25]通過(guò)綜合脂質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，探討了低溫脅迫下玉米幼苗根系膜脂代謝的變化，結(jié)果表明磷脂酰膽堿作為根系膜脂的主要成分，低溫脅迫下其含量降低了10%左右；Hund 等[26]研究表明，低溫脅迫下根的長(zhǎng)度和直徑呈負(fù)相關(guān)，與發(fā)芽指數(shù)也呈負(fù)相關(guān)。以上研究表明根系性狀與低溫脅迫密切相關(guān)，因此，本研究在萌發(fā)指標(biāo)的基礎(chǔ)上增加了根系性狀，且主成分分析也表明第1 主成分即為根系生長(zhǎng)因子，是糯玉米耐低溫鑒定指標(biāo)的重要組分。為了更客觀地評(píng)價(jià)作物抗逆性，前人一般采用多個(gè)指標(biāo)作為綜合指標(biāo)后對(duì)材料作出評(píng)價(jià)，避免單一指標(biāo)的局限性。張隴艷等[27]研究認(rèn)為，棉花耐低溫評(píng)價(jià)應(yīng)以芽鮮重、芽干重、活力指數(shù)、平均發(fā)芽速度和平均發(fā)芽時(shí)間作為測(cè)定指標(biāo)；王麗艷等[28]認(rèn)為對(duì)水稻萌發(fā)期的耐低溫評(píng)價(jià)應(yīng)以發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、株高、根干重、根表面積和根體積作為測(cè)定指標(biāo)；而黃賀等[23]認(rèn)為單項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)價(jià)結(jié)果同隸屬函數(shù)法得到的耐低溫綜合評(píng)價(jià)結(jié)果相統(tǒng)一。綜上所述，前人對(duì)不同作物萌發(fā)期的耐低溫評(píng)價(jià)最優(yōu)指標(biāo)存在差異，說(shuō)明不同作物間對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)存在一定差異。本研究通過(guò)對(duì)糯玉米萌發(fā)期的10 個(gè)耐低溫相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，提取出2 個(gè)主成分，將其命名為根系生長(zhǎng)因子和種子萌發(fā)因子；再通過(guò)回歸分析對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行篩選，得糯玉米耐低溫評(píng)價(jià)模型（公式8）：即相同條件下測(cè)定糯玉米的相對(duì)根干重（RRDW）、相對(duì)苗長(zhǎng)（RSL）、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)（RGE）、相對(duì)發(fā)芽率（RGR）、相對(duì)苗干重（RSDW）和相對(duì)根表面積（RRSA）6個(gè)指標(biāo)，然后將其代入方程，即可對(duì)糯玉米的耐低溫能力做出預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)。

主成分分析法有降維和簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的作用，同時(shí)可避免人為主觀因素的影響[29]。隸屬函數(shù)法利用模糊數(shù)學(xué)的原理，以運(yùn)算后的綜合評(píng)價(jià)值對(duì)測(cè)定材料進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，極大限度地減小誤差[30-31]。合理聯(lián)合多種方法對(duì)指標(biāo)分析，從而盡可能地消除差異，提高數(shù)據(jù)表達(dá)的準(zhǔn)確性和客觀性[32]。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者對(duì)不同作物在各類非生物脅迫下的抗性進(jìn)行了鑒定與評(píng)價(jià)，吳奇等[33]利用主成分分析和聚類分析，將54 份高粱品種按抗旱性強(qiáng)弱分為4 類；李紅宇等[34]結(jié)合主成分分析、隸屬函數(shù)分析、回歸分析和聚類分析等多種方法，對(duì)50 份北方粳稻品種的耐鹽堿性進(jìn)行評(píng)價(jià)。目前對(duì)作物抗性的鑒定評(píng)價(jià)體系并未統(tǒng)一，總體來(lái)看分析方式已從單一的分析逐步發(fā)展為利用多種分析方法的綜合評(píng)價(jià)，降低了單一評(píng)價(jià)的片面性和差異性，其鑒定評(píng)價(jià)結(jié)果也更為客觀準(zhǔn)確。