李本強,劉惠莉,劉佳佳,陶 潔,程靖華,石 迎,喬長濤,沈曉暉*

(1 上海市農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所∕上海市農業(yè)遺傳育種重點實驗室,上海 201106;2 上海市種豬工程技術中心,上海 201106;3 上海海洋大學,上海 201306)

豬薩佩羅病毒(Porcine sapelovirus,PSV)屬小RNA 病毒科,是微球形、無囊膜、單股正鏈RNA 病毒的一種,為腸道病毒屬II 群、豬腸道病毒8 型[1]。 通過對腸道病毒基因組及進化關系進一步研究,TSENG等[2]將該病毒劃為薩佩羅病毒屬。 PSV 基因組為單股正鏈RNA,全長約7 400 bp,包含1 個大的開放閱讀框架,編碼1 個多聚蛋白前體,在5’端有一個Vpg 區(qū),3’末端連有Poly A 結構[3-4]。

PSV 于20 世紀60 年代在英國首先發(fā)現[5],隨后在北美、日本、澳大利亞等地先后出現[6-10]。 PSV在飼養(yǎng)豬群中感染率很高,多呈散發(fā),不同年齡的豬均有易感性[4,11],幼齡豬易感性較強,病豬、康復豬和隱性感染豬為主要傳染源。 感染PSV 后可導致豬腸道、呼吸道、生殖器官疾病以及腦脊髓炎等多系統綜合征[12-13],還可能呈現亞臨床感染。 但無論其以何種形式爆發(fā),都會給養(yǎng)豬業(yè)帶來潛在威脅。 目前對PSV 的研究主要集中于病原分離與鑒定、基因組與結構蛋白分析方面。 本研究通過監(jiān)測上海地區(qū)豬場PSV 感染情況,并對其中2 個PSV 分離株進行全基因組測定與分析,旨在進一步明確PSV 在腹瀉疫情中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

于2016—2020 年從上海地區(qū)11 個豬場采集具有腹瀉癥狀的豬糞便樣品1 446 份,用PBS 液將樣品按照1∶10 的比例稀釋,-80 ℃冰箱凍存。

1.1.2 主要試劑及儀器

Trizol、M-MLV RNA 聚合酶、PCR 試劑及pMD-18T 載體等均購自TaKaRa 公司;5’RACE kit 試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司;pEASY-Blunt Zero Cloning Kit、DNA 凝膠回收試劑盒、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell 購自北京全式金生物公司;Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase購自諾唯贊生物公司。

PCR 儀和核酸電泳儀為美國Bio-Rad 公司生產。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理及總RNA 的提取

將-80 ℃保存的樣品漩渦震蕩5 min,取250 μL 溶液,采用Trizol 法提取總RNA,具體操作方法按照TaKaRa 產品說明書進行。

1.2.2 引物的設計及合成

根據Genbank 中HQ875059、KJ821021、KJ821020 和KX574284 序列,在3D 保守區(qū)域設計1 對PSV 特異檢測引物(PSV-F:5’-GATGTGGCGCATGCTCTT-3’,PSV-R:5’-TGCTGCCTCCTGTGTTGTTAT-3’),擴增片段長度約為624 bp[14]。 采用實驗室已公布的引物用于擴增PSV 全基因組序列,引物序列由鉑尚生物技術(上海)有限公司合成。

1.2.3 臨床樣品的RT-PCR 檢測

以提取的樣品RNA 為模板,按照Reverse Transcriptase M-MLV 的說明書進行反轉錄,合成cDNA。RT-PCR 反應體系為:cDNA 1 μL,10 × PCR mix 2 μL,PSV-F(0. 5 μmol∕L)和PSV-R(0. 5 μmol∕L)各0.5 μL,用水補至20 μL;反應程序為:94 ℃4 min;94 ℃30 s;52 ℃30 s;72 ℃35 s,30 個循環(huán);72 ℃8 min;4 ℃結束反應。

1.2.4 病毒的增殖及鑒定

選取生長狀態(tài)良好的PK15 細胞,胰酶消化后鋪于6 孔板中。 第2 天,棄去細胞上清,用PBS 洗滌2遍,加入含0.5 μg∕mL 胰酶的DMEM 病毒培養(yǎng)液;吸附2 h 后,棄去上清,加入含胰酶的DMEM 培養(yǎng)液。置于37 ℃培養(yǎng)箱,觀察細胞病變情況,若無病變,則5 d 后收毒;凍融2 次后,重復上述過程,進行病毒的連續(xù)傳代培養(yǎng)。 不同代次的細胞培養(yǎng)物各取250 μL,進行RT-PCR 檢測,驗證病毒傳代成功與否。

1.2.5 間接免疫熒光檢測

將傳至第5 代的PSV 接種PK15 細胞,吸附1 h 后,吸掉病毒液,用DMEM 洗滌2 次。 加入含有0.5 μg∕mL TPCK 的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)72 h 后,棄去細胞上清,PBST 洗1 遍,70%乙醇冰上固定15 min;PBST 洗3 遍并甩干,加入1∶1 000 稀釋的PSV 單抗,37 ℃濕盒中孵育1 h;重復洗滌,加入1∶3 000稀釋的FITC 標記羊抗鼠IgG,37 ℃孵育30 min;洗滌后,置于倒置熒光顯微鏡(Axio Observer)下觀察。

1.2.6 PSV 全基因組序列擴增及序列分析

取第5 代PSV 的病毒液,擴增全基因組序列。 反應體系參照Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 說明書進行PCR 反應。 反應程序:94 ℃4 min;94 ℃30 s,52 ℃30 s,72 ℃60 s,35 個循環(huán);72 ℃8 min;4 ℃結束反應。

PSV 的5’末端序列擴增采用5’RACE 方法進行[15]。 將目的片段與pEASY-Blunt Zero Cloning Kit 載體進行連接,隨后用Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell 進行克隆,挑取陽性重組質粒進行測序。

采用Lasergene 分析軟件對各測定片段進行拼接,獲得PSV 全基因組序列并進行基因分析,利用MEGA 6.0軟件制作進化樹。

2 結果與分析

2.1 PSV 流行情況調查

對2016—2020 年采集的1 416 份糞便樣品進行RTPCR 檢測,結果顯示,共有256 份PSV 陽性樣品,總陽性率 為 17.7%。 各 年 PSV 陽 性 率 分 別 為 18.26%(65∕356)、3.03% (3∕99)、18.72% (44∕235)、21.58%(126∕584)和10.47%(18∕172)(圖1),表明PSV 在豬群中普遍存在。

圖1 豬群中PSV 的年度流行情況Fig.1 Prevalence trends of PSV infection in pig herds

2.2 PSV 病毒分離

將PCR 檢測為陽性的PSV 樣品接種PK15 細胞,連續(xù)傳5 代后,2 株PSV 上出現細胞病變。 PCR 檢測顯示其第1 代次、第2 代次的擴增條帶都較弱,從第3 代開始,病毒增殖比較穩(wěn)定。 將成功分離的2 株PSV 毒株分別命名為CM2019008 和CM2019337(圖2)。

圖2 分離株的PCR 鑒定Fig.2 PCR identification of the isolated strain

2.3 病毒間接免疫熒光鑒定

將第5 代的CM2019008 和CM2019337 病毒分別接種于PK15 細胞,間接免疫熒光檢測顯示,2 株分離病毒均能與PSV 自制單抗發(fā)生免疫反應,出現特異性綠色熒光(圖3),表明這兩個毒株在PK15 細胞上增殖成功。

圖3 PSV 分離株的間接免疫熒光檢測(200 ×)Fig.3 Indirect immunofluscent test of PSV isolates(200 ×)

2.4 PSV 基因組遺傳分析

2.4.1 PSV 全基因組的遺傳進化分析

利用Mega 6.0 軟件對2 株PSV 和國內外其他代表性毒株進行全基因組遺傳進化分析。 結果表明,分離株CM2019337 與上海PSV 株MN685785.1 進化關系最近,分離株CM2019008 與SHPD202150 在中國PSV 的一個大的分支上。 中國PSV 分離株與日本2 株PSV 分離株同處一個大的分支上,遺傳進化關系最為接近(圖4)。

圖4 PSV 全基因組序列構建的系統進化樹Fig.4 The phylogenetic tree constructed based on the whole gene sequence of PSV

進一步利用DNAStar 軟件對上述毒株的核苷酸相似性進行分析,發(fā)現CM2019008 和CM2019337 的核苷酸相似性為94.8%,其次是MN685785.1,兩者核苷酸相似性為94.4%;CM2019337 和MN685785.1的核苷酸相似性為99.5%,其次是JX286666.1,核苷酸相似性為89.8%。 中國的PSV 毒株與韓國PSV 毒株核苷酸相似性為87%—88.5%,與歐洲PSV 毒株核苷酸相似性為84.9%—87.3%(圖5)。

圖5 蛋白編碼區(qū)序列相似性比較Fig.5 Homology comparison of sequence in protein coding region

2.4.2 分離株蛋白編碼區(qū)的重組分析

在SimPlot 3.5.1 軟件中CM2019008 和CM2019337 作為獨立的重組事件進行標準相似節(jié)點分析以查找有無重組事件的發(fā)生,結果所示,CM2019008 和CM2019337 分離株在VP1、VP2 和VP3 區(qū)域與HeBO4核苷酸序列高度相似,而在3D 區(qū)域與ISU-SHIC 高度相似(圖6A)。 利用RDP、Chimaera、Bootscan、3Seq、Maxchi、Phylpro、GENECONV、LARD 及SISCAN 九種算法對重組毒株進行分析以尋找重組毒株的潛在斷裂點。 Bootscan 分析結果所示,CM2019008 和CM2019337 分離株在3D 區(qū)域存在重組斷點(6B)。 利用鄰接法構建重組毒株的進化樹,結果如圖6C 所示,CM2019008 和CM2019337 分離株的重組區(qū)域位于4 696—5 945 bp 處。

圖6 潛在重組毒株多聚蛋白重組事件Fig.6 Recombinant events identified according to the polyprotein gene of potential recombinant strains

2.4.3 分離株VP1 基因的氨基酸序列分析

采用MegAlign 和GeneDoc 2.7 軟件對VP1 基因對應的氨基酸序列進行分析,結果如圖7 所示。 與PSV 經典株相比,CM2019008 共存在6 個氨基酸位點的突變,分別為第28、88、98、223、229、271 位,且突變位點多集中在VP1 氨基酸的兩端序列;CM2019337 共存在5 個氨基酸位點的突變,分別為第28、94、95、218、236 位。 CM2019008 和CM2019337 中間氨基酸99—217 位點相對保守。

圖7 PSV VP1 基因氨基酸突變位點的分析Fig.7 Analysis of amino acid mutation sites of PSV VP1 gene

2.4.4 VP1 蛋白的潛在糖基化位點和抗原表位的分析

運用在線分析軟件NetNGlyc 1.0 Server 和GeneDoc 2.7 對VP1 蛋白的潛在糖基化位點進行分析,結果表明所有PSV 分離株和參考株都含有潛在NSTS 糖基化位點,且都含173 位潛在糖基化位點。 其中分離株CM2019008 和CM2019337 分別含有1 個和2 個潛在糖基化位點;日本PSV 分離株LC326556.1 含有2 個糖基化位點,德國PSV 分離株LT900497.1 和法國PSV 分離株MH513612.1 分別含有2 個和1 個糖基化位點。

采用在線分析軟件BepiPred 1.0 Server 和DNAStar Protean 對分離株VP1 蛋白的抗原表位進行分析,發(fā)現中國分離株CM2019008 和CM2019337 與中國已有的分離株及國外分離株的抗原表位差異不大,抗原表位均勻分散在整個VP1 蛋白分子表面。

3 結論與討論

本研究利用RT-PCR 方法對上海地區(qū)腹瀉豬群中PSV 的攜帶情況進行檢測,發(fā)現PSV 總體陽性率為17.7%,與Lan 等[16]在中國華東地區(qū)豬糞便中17.2%的PSV 檢出率、Chen 等[17]在中國華南地區(qū)豬糞便中18.21%的PSV 檢出率、Li 等[18]在四川地區(qū)豬糞便中20.4%的PSV 檢出率相近。 表明PSV 在上海地區(qū)豬場普遍存在。

本研究從陽性樣品中分離得到兩株PSV。 對兩株PSV 全基因組序列進行分析,發(fā)現其與日本部分流行PSV 毒株之間親緣關系最近,與韓國的分離株親緣關系較遠。 我國的PSV 分離株呈簇聚集在同一分支中,說明我國的流行毒株可能存在獨立進化。 核苷酸相似性分析發(fā)現PSV 分離株與韓國PSV 毒株核苷酸相似性為87%—88.5%,與歐洲PSV 毒株核苷酸相似性為84.9%—87.3%。 病毒突變和重組是病毒進化的主要方式,在進化過程中扮演著至關重要的角色。 本研究發(fā)現,CM2019008 和CM2019337 分離株的重組區(qū)域位于4 696—5 945 bp 處,此區(qū)域編碼病毒特異性RNA 聚合酶,具有合成病毒RNA 能力。

VP1 衣殼蛋白是PSV 最外部的蛋白,是誘導機體產生中和抗體的主要蛋白質,也是誘導豬場產生體液免疫應答的主要成分。 目前,關于VP1 基因的氨基酸突變對生物學特性的意義還未見報道。 本研究對PSV 分離株和已報道的PSV 毒株進行了序列分析,發(fā)現PSV 分離株VP1 基因的氨基酸較少發(fā)生突變,同時整個VP1 基因的氨基酸序列未發(fā)現插入和缺失現象,該結果對病毒防治具有指導意義。

蛋白質糖基化修飾與很多重要的功能蛋白或酶相關,特別是與蛋白質的空間構想、生物活性、運輸和定位密切相關,參與很多復雜的生理生化反應,如:分子識別、細胞通信、信號轉導等,因此糖基化位點分析對研究病毒機制具有十分重要的意義[19]。 本研究發(fā)現分離株PSV 和參考PSV 都含有潛在NSTS 糖基化位點,其中分離株CM2019008 和法國分離株MH513612.1 含有1 個潛在糖基化位點,CM2019337 和日本LC326556.1 及德國分離株LT900497.1 含有2 個潛在糖基化位點。 而所有的PSV 都含有173 NSTS 糖基化位點。 通過對分離株VP1 蛋白的抗原表位分析,發(fā)現分離株CM2019008 和CM2019337 與中國目前已有的分離株及國外分離株的抗原表位差異不大,這可能是VP1 蛋白保持良好抗原性的重要原因之一,研究結果對進一步研究PSV 高感染率及分子機制具有指導意義。