電子束對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)粒棘球蚴及其p38 mRNA 表達(dá)的影響

楊麗萍 路鵬霏 周 欽 古麗米來(lái)·玉素甫 吾日古麗·巴吾東 毛 睿

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心（烏魯木齊 830000）

棘球蚴病俗稱(chēng)包蟲(chóng)病，是由棘球蚴絳蟲(chóng)的中絳期幼蟲(chóng)寄生于人體及其余動(dòng)物所引起的一種人畜共患性疾?。?］。據(jù)估計(jì)因棘球蚴病導(dǎo)致全球畜牧業(yè)每年損失約20億美元，人類(lèi)因棘球蚴病的死亡率為2%～4%［2］。手術(shù)是治療細(xì)粒棘球蚴病的首選方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)率極高。近幾年，國(guó)內(nèi)外對(duì)甲苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑［3］等藥物的治療療效、藥理學(xué)等方面都做了深入的研究［4-6］。其臨床療效不甚理想，治愈率只有30%。因外科手術(shù)清除難度大、高復(fù)發(fā)率及藥物療效欠佳，對(duì)于棘球蚴病的治療仍需尋求新的方式。目前已證實(shí)放射治療對(duì)棘球蚴有明顯的殺傷作用，且放射療法的安全性相對(duì)較高，并有獨(dú)特的形態(tài)學(xué)和結(jié)構(gòu)組織的改變［7-9］。

放射治療主要分為外照射和近距離放射治療兩種技術(shù)，外照射包括低能X線、電子束，有研究證實(shí)X線對(duì)棘球蚴病的治療有效［10］，由于電子束對(duì)較表淺組織的照射有更高的控制率，有更好的劑量分布，且目前暫無(wú)電子束照射棘球蚴的相關(guān)研究，所以本研究采用電子束進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)粒棘球蚴原頭蚴中有相應(yīng)的p38基因信號(hào)通路，p38基因是由Brewster等［11］研究發(fā)現(xiàn)，它與寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)、繁殖信號(hào)傳遞過(guò)程密切相關(guān)［12-16］，且在棘球蚴中較高表達(dá)［17-20］，已有結(jié)論證實(shí)p38抑制劑可抑制體外培養(yǎng)的棘球蚴生長(zhǎng)［21-22］，Gelmedin等提到［23］應(yīng)用基因抑制劑處理，可將體外培養(yǎng)的棘球蚴的p38基因信號(hào)通路阻斷，并使蟲(chóng)體死亡率明顯升高；Schiff 等［24］發(fā)現(xiàn)p38的基因有助于放療后的細(xì)胞修復(fù)，證實(shí)p38基因可能會(huì)減弱放療療效。本研究通過(guò)電子束照射棘球蚴，觀察蟲(chóng)體大體結(jié)構(gòu)、死亡率的變化并檢測(cè)其中p38基因的表達(dá)情況，進(jìn)一步了解電子束對(duì)于棘球蚴的殺傷作用及p38基因在其中的作用機(jī)制，以期探索包蟲(chóng)病潛在治療靶點(diǎn)，提供新的治療路徑。

1 材料與方法

1.1 棘球蚴來(lái)源

本研究用于體外培養(yǎng)的棘球蚴來(lái)自自然感染棘球蚴的綿羊肝臟，由新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市畜牧站提供。研究方案通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查（倫理學(xué)審批號(hào)：IACUC-20141021002）。

1.2 主要試劑

磷酸鹽緩沖液（PBS）；培養(yǎng)'基：RPMI 1640培養(yǎng)基、含有100 U/mL的青霉素及100 μg/mL鏈霉素的雙抗、胎牛血清；含有1%胃蛋白酶的消化液；0.1%的亞甲基藍(lán)染色劑；Trizol；氯仿；異丙醇；DEPC水；無(wú)水乙醇等。

1.3 原頭蚴分離

抽取羊肝包囊內(nèi)液體至50 mL培養(yǎng)管中，將棘球蚴沉淀置于消化液中，并于37 ℃水浴30 min，每隔5 min觀察消化情況，無(wú)明顯可見(jiàn)囊皮，停止胃蛋白酶消化過(guò)程，消化完畢后檢測(cè)原頭蚴的活性。

1.4 原頭蚴活性觀察及計(jì)數(shù)

吸取1 μL蟲(chóng)體至EP管中，進(jìn)行染色，用PBS沖洗染液，用光鏡觀察原頭蚴活性、數(shù)量等，重復(fù)4～5次得均值，以此估算蟲(chóng)體總數(shù)。

1.5 原頭蚴體外培養(yǎng)

將含有胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、100 IU/mL的青鏈霉素雙抗的培養(yǎng)液稀釋細(xì)粒棘球蚴原頭蚴至2 000粒/mL，移置于培養(yǎng)瓶中，共分為同等的3瓶，在37 ℃、含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，需每2～3天更換一次更換培養(yǎng)液，注意實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，細(xì)粒棘球蚴原頭蚴的培養(yǎng)時(shí)間不宜超過(guò)3 d。

1.6 原頭蚴電子束照射

用0 Gy、30 Gy、60 Gy的6 兆電子束（6 MeV）分別對(duì)各分組培養(yǎng)瓶進(jìn)行1次放射，將放射后的培養(yǎng)瓶繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)3 d、14 d，以上實(shí)驗(yàn)步驟共進(jìn)行3～4次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 原頭蚴RNA的提取

準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需試劑及實(shí)驗(yàn)設(shè)備，按照RNA提取步驟進(jìn)行RNA的提取。

1.8 逆轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR及檢測(cè)原頭蚴p38基因表達(dá)

mRNA的逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：按照TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作；進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，引物序列見(jiàn)表2。

表2 p38 基因qRT-PCR引物序列信息

用cDNA作為模板，按照德國(guó)QIAGEN公司的QuantiNova SYBR Green PCR Kit（Perfect Real Time）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定p38 基因的表達(dá)，并以β-actin作為內(nèi)參，反應(yīng)體系為20 μL，見(jiàn)表3。

表3 p38基因qRT-PCR反應(yīng)體系

每個(gè)樣本設(shè)置三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，包括 1 次陰性對(duì)照，反應(yīng)條件按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置。計(jì)算過(guò)程：選擇每個(gè)孔的Ct值，依照相對(duì)定量公式 2-△△Ct，即△Ct=Ct（p38）-Ct（β-actin），△△Ct=△Ct（實(shí)驗(yàn)組）-△Ct（對(duì)照組），統(tǒng)計(jì)分析選擇單因素方差分析，得出p38基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Prism 8.0與SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有實(shí)驗(yàn)需要包含不得少于3次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），蟲(chóng)體死亡率的比較采用χ2檢驗(yàn)，qRT-PCR測(cè)得mRNA表達(dá)量的比較采用方差分析和SNK法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 電子束照射對(duì)原頭蚴的狀態(tài)及形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

相同劑量電子束照射的蟲(chóng)體結(jié)構(gòu)在不同天數(shù)（3 d、14 d）時(shí)無(wú)明顯差異，0 Gy組蟲(chóng)體活性基本正常，形態(tài)結(jié)果未見(jiàn)明顯改變；30 Gy照射劑量分組中部分蟲(chóng)體活力減弱，育囊減少，部分囊壁變薄、塌陷；60 Gy照射劑量分組中蟲(chóng)體體積縮小明顯，正常形態(tài)消失，多呈不規(guī)則球形、勾突脫離、頭節(jié)裂解、吸盤(pán)扭曲（見(jiàn)圖1）。

圖1 光鏡下觀察各組細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.2 電子束照射對(duì)原頭蚴死亡率的影響

經(jīng)卡方檢驗(yàn)證實(shí)部分分組死亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較，見(jiàn)表1。

表1 單純照射組細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)死亡率差異情況

培養(yǎng)3 d、14 d時(shí)0 Gy組30 Gy、60 Gy組細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的死亡率有差異（P＜0.012 5）；30 Gy與60 Gy組的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)死亡率也有差異（P＜0.012 5）；相同照射劑量下培養(yǎng)3 d與培養(yǎng)14 d時(shí)的死亡率未見(jiàn)差異（P＞0.012 5）。

2.3 電子束照射對(duì)原頭蚴p38 mRNA表達(dá)的影響

經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)，在照射組細(xì)粒棘球蚴原頭蚴中的60 Gy組培養(yǎng)3 d時(shí)p38 mRNA表達(dá)其相對(duì)表達(dá)為：31.05±0.30，60 Gy組培養(yǎng)14 d時(shí)p38 mRNA表達(dá)其相對(duì)表達(dá)為：32.11±0.32，本研究證實(shí)照射組細(xì)粒棘球蚴原頭蚴中的電子束劑量為60 Gy組的p38mRNA的相對(duì)表達(dá)水平高于0 Gy及30 Gy組的相對(duì)表達(dá)水平（P ＜0.05），且培養(yǎng)3 d與14 d無(wú)差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)經(jīng)照射后qRT-PCR 測(cè)得mRNA 表達(dá)結(jié)果與平均死亡率對(duì)照

3 討 論

棘球蚴病是一種全球流行的動(dòng)物源性寄生蟲(chóng)?。?5］，寄生于人及某些動(dòng)物等中間宿主中引起囊性棘球蚴病，如果不及時(shí)治療，90%的病例會(huì)在診斷后10～15年內(nèi)死亡［26］。全世界每年估計(jì)有超過(guò)18 000例新病例，其中91%發(fā)生在中國(guó)［27］。棘球蚴病的治療選擇很少，手術(shù)治療主要在感染的早期階段，可進(jìn)行預(yù)防性抗寄生蟲(chóng)藥物治療［28］，外科手術(shù)及新型藥物治療都已經(jīng)有了極大的突破［29］，但外科手術(shù)后的高復(fù)發(fā)率未得到有效解決，藥物治療中的耐藥機(jī)制的產(chǎn)生還未明確，因此我們對(duì)于細(xì)粒棘球蚴病的治療還在探尋更多、更新的治療方式。

本研究顯示，照射組在相同照射劑量下的連續(xù)培養(yǎng)3 d、14 d蟲(chóng)體結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異，0 Gy組蟲(chóng)體形態(tài)飽滿，勾突、頭節(jié)、吸盤(pán)清晰可見(jiàn)，大部分有活動(dòng)性且不被藍(lán)染著色；30 Gy照射劑量分組表現(xiàn)為部分蟲(chóng)體正常形態(tài)消失，部分藍(lán)染，活力減弱，育囊減少，部分囊壁變薄、塌陷、曲折斷裂；60 Gy照射劑量分組中鏡下觀察發(fā)現(xiàn)藍(lán)染著色細(xì)胞布滿大部分視野，蟲(chóng)體正常形態(tài)消失，體積縮小明顯呈不規(guī)則球形、吸盤(pán)扭曲、頭節(jié)裂解，勾突脫離，棘球蚴囊壁可見(jiàn)毛刺狀破裂、塌陷，觀察60 Gy照射劑量分組中細(xì)粒棘球蚴原頭蚴細(xì)胞質(zhì)散亂，腫脹變粗、擁擠。由此證實(shí)照射劑量為30 Gy、60 Gy的電子束對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭蚴均有殺傷作用，但60 Gy組殺傷作用更加明顯，而照射后培養(yǎng)天數(shù)的延長(zhǎng)并不會(huì)影響蟲(chóng)體死亡率的變化。

本研究發(fā)現(xiàn)，p38基因在受電子束照射的細(xì)粒棘球蚴原頭蚴中呈不同程度的表達(dá)水平，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)證實(shí)p38基因在60 Gy照射劑量分組中的相對(duì)表達(dá)水平高于0 Gy組及30 Gy組的相對(duì)表達(dá)水平，表明照射劑量的不同可能影響p38基因的表達(dá)變化。p38基因存在于所有真核生物中，其結(jié)構(gòu)和調(diào)控特征從微生物到人類(lèi)都是保守的，與其他MAPK 家族成員不同，p38基因通常不主動(dòng)進(jìn)行有絲分裂，而是被細(xì)胞異常微環(huán)境及炎癥信號(hào)激活，其編碼的蛋白質(zhì)將信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核，以響應(yīng)各種外源性和內(nèi)源性刺激［30］。這與細(xì)粒棘球蚴接受電子束照射刺激后引起p38基因不同程度表達(dá)的理論相一致。p38基因信號(hào)通路的傳導(dǎo)引起相關(guān)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，可以起到抑制放射線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［31］。本研究顯示經(jīng)電子束的照射使蟲(chóng)體的死亡率升高、p38基因的表達(dá)增加，但p38基因的放療抑制作用可能不足以完全抵抗電子束對(duì)蟲(chóng)體的殺傷作用，從而使電子束引起蟲(chóng)體的生長(zhǎng)阻滯，從而促進(jìn)了棘球蚴蟲(chóng)體的死亡，并且在60 Gy照射劑量下蟲(chóng)體死亡率最高、p38基因的表達(dá)最高，這也為后期包蟲(chóng)病的放射治療的劑量選擇提供一定的理論參考。

綜上所述，電子束治療包蟲(chóng)病的研究目前仍處于初級(jí)階段，后期將進(jìn)一步從機(jī)制出發(fā)，深入研究電子束致棘球蚴中p38基因信號(hào)通路調(diào)控變化的作用機(jī)制，為包蟲(chóng)病的放射治療提供更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論支持。