董柏萍 王永生 呂靜靜 韓燕珍 袁鎖偉 梁 永 毛蕾蕾

曹縣人民醫(yī)院 1. 神經(jīng)內(nèi)科； 2. 神經(jīng)外科； 3. 病理科，山東 曹縣 274400； 4. 山東第一醫(yī)科大學（山東省醫(yī)學科學院）第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 泰安 271000

帕金森?。≒arkinson’s disease， PD）是世界上第二大神經(jīng)退行性疾病［1］。該疾病主要特征為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的變性缺失，導致紋狀體內(nèi)多巴胺含量的顯著減少，臨床表現(xiàn)主要為靜止性震顫、運動減少、肌肉強直及步態(tài)異常等。PD 的發(fā)病緩慢、病程較長，表現(xiàn)為疾病的進行性加重，嚴重影響患者的運動能力和生活質(zhì)量［2］。目前臨床上多采用擬多巴胺類藥物、多巴胺受體激動劑、單胺氧化酶抑制劑等進行PD 患者的控制治療，雖然這些藥物能夠在一定程度上緩解患者的臨床癥狀，但無法調(diào)控神經(jīng)元凋亡以及疾病的發(fā)展，同時還會伴隨一些精神方面的副作用［3-4］，因此亟需開發(fā)有效阻止PD進展的神經(jīng)保護藥物。

川陳皮素（nobiletin）是一種常見的O-甲基化類黃酮，是柑橘類食品中的一類多酚類化合物，具有抗氧化、抗癌、抗炎等一系列生物活性，此外在胰島素抵抗、肝保護、抗動脈粥樣硬化以及神經(jīng)營養(yǎng)等方面也發(fā)揮著重要作用。研究證實了川陳皮素在神經(jīng)保護方面的功效，Yasuda 等［5］證明了川陳皮素具有抑制腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護功能；Kimura等［6］則在阿爾茨海默病模型中證明了川陳皮素能夠顯著降低β-淀粉樣蛋白水平，從而抑制疾病的發(fā)展。Braidy 等［7］及Nakajima 等［8］分別對川陳皮素在PD 中潛在的神經(jīng)保護功能進行了闡述。然而，現(xiàn)階段對川陳皮素在PD 中發(fā)揮藥效的作用機制了解甚少，嚴重阻礙了對川陳皮素的藥物開發(fā)及PD治療的發(fā)展。

微小RNA（microRNAs， miRNAs）是一類不具有蛋白編碼功能的小RNAs，在機體中能夠調(diào)節(jié)多種細胞功能，如細胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲、分化和凋亡等［9］。研究表明，miRNAs 參與多種疾病的進展，并發(fā)揮調(diào)控甚至改善疾病的作用，其中作為人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達最為豐富的miRNAs 之一，miR-146a 被證實參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的調(diào)控［10］，例如，增加海馬體中miR-146a的表達可以改善阿爾茲海默病模型的認知障礙［11］，且miR-146a也被證實可影響硬化癥患者的易感性［12］。

本研究在建立PD 細胞和動物模型的基礎上，通過對miR-146a表達、神經(jīng)細胞活力及炎癥因子水平的檢測，結合小鼠的運動水平分析，探索miR-146a 介導川陳皮素對PD 的調(diào)控功能，為患者的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 PD細胞模型和動物模型的構建

神經(jīng)母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）購買于美國菌種保藏中心（ATCC），于添加了10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（Invitrogen， 美國）中進行培養(yǎng)，設置含有5% CO2培養(yǎng)箱為37 ℃。使用5 μmol/L 魚藤酮（Sigma，美國）誘導SH-SY5Y 細胞共24 h，用以構建PD細胞模型（PD模型組）。使用不同濃度的川陳皮素處理PD細胞12 h，分別獲得低劑量組（25 μmol/L）、中劑量組（50 μmol/L）和高劑量組（100 μmol/L）的PD細胞。同時以SH-SY5Y細胞作為對照組。

8周齡的雄性C57BL/6小鼠30只來自北京維通利華實驗動物有限公司，通過標準方法正常飼養(yǎng)，并將小鼠分為5 組，每組6 只。使用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶［MPTP；30 mg/（kg·d）］持續(xù)灌胃小鼠5 d建立PD小鼠模型［13-14］。同樣利用不同濃度的川陳皮素對小鼠進行處理，獲得低劑量組（25 μmol/L）、中劑量組（50 μmol/L）和高劑量組（100 μmol/L）的PD 小鼠模型。取PD 小鼠的血液和海馬組織樣本制作血清和腦組織勻漿，并在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細胞轉(zhuǎn)染和動物處理

將miR-NC、miR-146a 激動劑和miR-146a 抑制劑在Lipofectamine 3000 試劑的幫助下分別轉(zhuǎn)染到經(jīng)川陳皮素處理的PD 細胞模型中，得到高劑量+miR-NC 組、高劑量+miR-146a 激動劑組和高劑量+miR-146a抑制劑組。

利用側(cè)腦室置管術處理小鼠，待應激反應消失后，經(jīng)導管將miR-NC、miR-146a 激動劑、miR-146a抑制劑（10 μL）分別導入小鼠，連續(xù)進行5 d。給藥結束48 h后，利用MPTP經(jīng)上述方法構建PD小鼠模型，獲得高劑量+miR-NC組、高劑量+miR-146a激動劑組和高劑量+miR-146a抑制劑組小鼠模型。

1.3 熒光定量PCR實驗

按照說明書的要求，使用TRIZOL 試劑（Thermo，美國）提取樣本中的總RNA，并通過分光光度計測定RNA 的純度和濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT kit（Toyobo， 日本）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以獲得的cDNA 作為模板，使用SYBRGREEN qPCR 試劑盒（Vazyme，南京）配置反應體系，并在ABI 7500進行PCR反應，U6作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法計算miR-146a的相對表達量。

1.4 細胞增殖、凋亡檢測

接種細胞至96 孔細胞培養(yǎng)板，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，在每孔中每24 h 加入CCK-8 檢測試劑，孵育2 h 后，使用酶標儀檢測各細胞培養(yǎng)孔在450 nm處的吸光度值。

用流式細胞術檢測細胞凋亡情況，收集PD 細胞，徹底清洗后使用Annexin-FITC 和PI 進行雙染，最后通過流式細胞儀分析細胞的凋亡情況。

1.5 小鼠曠場試驗

將各組小鼠依次置于觀察箱中央，觀察并記錄小鼠5 min 內(nèi)的總運動距離、中央格停留時長及站立次數(shù)，期間禁止任何形式的人工干預，及時對觀察箱進行清潔，排除氣味等外部因素的影響。

1.6 炎癥因子的表達檢測

使用酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）試劑盒分別檢測小鼠模型血清和海馬組織勻漿中炎癥因子的表達水平，包括白介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0軟件處理和分析數(shù)據(jù)。計量資料用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。為保證實驗的準確性，每組實驗至少重復3 次。檢驗水準α= 0.05。

2 結 果

2.1 miR-146a的差異化表達及不同濃度川陳皮素對PD細胞活性的影響

以SH-SY5Y細胞作為對照組，經(jīng)實時熒光定量PCR（real time quantitative PCR， RT-qPCR）驗證發(fā)現(xiàn)，PD細胞模型中miR-146a表達升高，當不同濃度的川陳皮素介導后，隨著劑量的增加，miR-146a 的表達逐漸下降，且高劑量組對miR-146a 表達的影響最為顯著。CCK-8 試驗提示，PD 模型組細胞的增殖水平較對照組明顯下降，而川陳皮素的介導則會增加細胞的增殖水平。同樣地，細胞凋亡實驗證實了PD 模型組細胞凋亡率上調(diào)，而隨著川陳皮素劑量的增加，細胞凋亡率下降。詳見表1。

表1 不同濃度川陳皮素對細胞增殖和凋亡的影響

2.2 miR-146a激動劑和miR-146a抑制劑介導的川陳皮素對PD細胞的調(diào)控

分別將miR-NC、miR-146a 激動劑或miR-146a 抑制劑共轉(zhuǎn)染到高劑量川陳皮素處理過的PD模型組細胞中，成功構建高劑量+miR-NC組、高劑量+miR-146a激動劑組和高劑量+miR-146a抑制劑組，并采用RTqPCR檢測miR-146a的表達水平，高劑量+miR-146a激動劑組中miR-146a的表達明顯高于對照組，而高劑量+miR-146a 抑制劑組中miR-146a 的表達下降。與PD模型組相比，轉(zhuǎn)染高劑量+miR-146a激動劑后，細胞增殖能力下降，而轉(zhuǎn)染高劑量+miR-146a抑制劑后，細胞增殖能力升高，即miR-146a表達水平的增加會抑制PD細胞的增殖能力。miR-146a表達水平的增加會明顯增加細胞的凋亡率，詳見表2。

表2 高劑量川陳皮素參與下miR-146a對細胞增殖和凋亡的影響

2.3 異常表達miR-146a對小鼠運動能力的影響

探究異常表達miR-146a 介導川陳皮素對PD細胞的影響后，進一步構建PD 小鼠模型，并對小鼠的運動情況進行觀察和記錄（表3）。相比健康的對照組小鼠，PD 小鼠的活動距離明顯減少，停留時間增加，同時站立次數(shù)驟減。當加入川陳皮素后，隨著劑量的增加，發(fā)現(xiàn)小鼠的運動能力得到恢復，尤其是高劑量組小鼠，活動距離和站立次數(shù)明顯增加，同時中央格停留的時間相對減少。

表3 不同濃度川陳皮素處理的帕金森病小鼠曠場實驗

2.4 異常表達miR-146a 對PD 小鼠模型中炎癥因子的調(diào)控

進一步對小鼠血清和腦組織中的炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α 的表達水平進行檢測。相比健康對照組，PD小鼠模型組中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均升高；經(jīng)川陳皮素處理后，炎癥因子水平有所下降，且下降程度隨川陳皮素劑量的增加而顯著，高劑量組效果最明顯（表4）。

表4 不同濃度川陳皮素對帕金森病小鼠血清和組織中炎癥因子的調(diào)控

此外，經(jīng)miR-146a 激動劑和miR-146a 抑制劑介導后發(fā)現(xiàn)，miR-146a 的增加會導致PD 小鼠模型血清和組織中炎癥因子水平相對增加，而miR-146a的減少則會使PD小鼠模型血清和組織中炎癥因子水平相對下降（表5）。

表5 異常表達miR-146a對帕金森病小鼠血清和組織中炎癥因子的影響

3 討 論

PD嚴重影響患者的運動功能和生活質(zhì)量，目前臨床常用的治療藥物無法抑制PD 進展，且多伴副作用的發(fā)生，給患者造成了巨大的壓力［15］。

川陳皮素是一種天然的類黃酮，是一種有益的抗氧化劑，具有抗炎和抗癌活性［16］。研究表明，川陳皮素在腫瘤治療、糖尿病認知功能障礙、心腦血管疾病等方面有一定功效，同時在神經(jīng)保護方面也有大量研究［17-19］。Zheng 等［20］證明了川陳皮素通過調(diào)控AKT/mTOR 和TLR4/NF-κB 信號通路改善缺血性腦損傷。Bi等［21］證實，川陳皮素能夠緩解麻醉劑引起的認知功能障礙、神經(jīng)炎癥以及神經(jīng)元凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，川陳皮素的增加能顯著影響PD 模型組中miR-146a的表達以及細胞增殖和凋亡能力；在PD 小鼠模型中，川陳皮素能有效改善PD 小鼠的運動能力，幫助小鼠恢復正常的生存狀態(tài)，同時降低小鼠血清和組織中炎癥因子的表達水平。因此提示，川陳皮素對PD 的治療有積極的功效，對PD 患者可能起神經(jīng)保護作用。

文獻證實，miR-146a 參與腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病的調(diào)控［22-24］。在創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury， TBI）的治療研究中，通過構建TBI 患者和動物模型評估發(fā)現(xiàn)，miR-146a 在TBI小鼠的大腦和血清中均上調(diào)。miR-146a 處理可減輕TBI對小鼠大腦的影響，改善小鼠的神經(jīng)功能［25］。類似地， miR-146a激動劑和miR-146a抑制劑介導高劑量川陳皮素處理的PD細胞模型發(fā)現(xiàn)，miR-146a激動劑會抑制細胞活性，增加細胞凋亡數(shù)量；miR-146a抑制劑的作用則相反。miR-146a 抑制劑的介導會使PD小鼠模型血清和組織中炎癥因子顯著下降，減輕癥狀。上述研究表明，miR-146a介導川陳皮素對PD 模型有明顯的治療功效，具有更具體、更深入的臨床研究價值。

文獻證實，SH-SY5Y 細胞經(jīng)魚藤酮誘導后，RT-qPCR 檢測發(fā)現(xiàn)miR-146a 在細胞中上調(diào)表達［26］，這與本研究結果一致。此外，在Guo 等［27］探究南蛇藤醇對PD 的保護機制中也發(fā)現(xiàn)miR-146a上調(diào)表達。在相關神經(jīng)退行性疾病的研究中了解到包括miR-146a、miR-155 和miR-21 在內(nèi)的一些miRNAs 炎癥調(diào)節(jié)因子在多發(fā)性硬化癥患者的病變中也被發(fā)現(xiàn)為過表達［28-29］。在類風濕關節(jié)炎患者血清中miR-146a 表達同樣呈上調(diào)趨勢［30］。然而，miR-146a的表達情況還存在一些爭議，也有研究表明miR-146a在PD患者中表達下調(diào)［31-32］。因此，在后續(xù)的研究中還需要進一步擴大樣本量以驗證本研究的結論。

綜上，miR-146a在PD細胞模型中明顯高表達，川陳皮素的參與能有效提高PD 細胞的增殖水平，減少細胞凋亡，并且在一定程度上恢復PD 小鼠的運動能力。異常表達miR-146a 通過介導川陳皮素對PD 細胞活力和炎癥因子起調(diào)控作用，是后續(xù)研究PD有潛力的治療靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖