田 琴 邵成艷 段涵寧 楊晨璇,4 李 璐*
(1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院,昆明 650224;2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,昆明 650224 ;3.西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院,昆明650224;4.中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所,昆明 650201)
堇菜屬(Viola)是堇菜科(Violaceae)最大的一個(gè)屬,有525~600 余種,為世界廣布屬,幾乎廣泛生長(zhǎng)在世界無(wú)霜區(qū)[1]。它起源于安第斯山脈,分布于世界溫帶地區(qū)以及熱帶亞熱帶的高海拔山區(qū),集中在歐洲的阿爾卑斯山和地中海、亞洲的喜馬拉雅和東亞地區(qū),以及南美洲的安第斯山脈和巴塔哥尼亞等地[1-3]。該屬為多年生草本植物,部分種類具有較高觀賞價(jià)值[1-4],如:著名的三色堇(V.tricolor)和七星蓮(V.diffusa),也有一些藥用植物,如:紫花地?。╒.philippica)和荁(V.moupinensis)。
長(zhǎng)期以來(lái),由于物種多、分布廣、生態(tài)型明顯、兼具開(kāi)放花和閉鎖花,且普遍具有自然雜交現(xiàn)象,堇菜屬的物種鑒定和屬下分類系統(tǒng)爭(zhēng)議較大。1823年,Gingins[5]根據(jù)柱頭形態(tài)把堇菜屬分為5個(gè)組。1925年,Becker[6]基于雌蕊的超微結(jié)構(gòu)后把它細(xì)分為14 組28 亞組及7 系。緊接著,Clausen[7-10]在此基礎(chǔ)上,不斷擴(kuò)充修訂該分類系統(tǒng),明確指出花瓣顏色、雌蕊形態(tài)、染色體數(shù)目及地理分布類型等都是屬下分組的重要依據(jù)。1996 年,Ballard[11]根據(jù)形態(tài)學(xué)、染色體數(shù)目和自然雜交現(xiàn)象等提出堇菜屬可以分為8 個(gè)組,并具相應(yīng)的地理分布格局,同時(shí)指出哪些組是存疑類群。近年來(lái),分子系統(tǒng)學(xué)為探討堇菜屬的分類學(xué)系統(tǒng)提供了新證據(jù)。Ballard 等[1]選擇了堇菜屬下大部分組的44 個(gè)代表種為材料,基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄組間隔區(qū)序列(ITS 序列)構(gòu)建了分子系統(tǒng)樹(shù),證實(shí)該屬起源于南美安第斯山脈,揭示了屬下分組類群并非單系。基于8個(gè)葉綠體基因片段構(gòu)建的韓國(guó)堇菜屬分子系統(tǒng)學(xué)表明,該地區(qū)的二裂柱頭堇菜組和須毛柱頭堇菜組(sectionsDischidium&Chamaemelanium)為單系,而其他組為并系,建議根據(jù)形態(tài)特征在組下進(jìn)一步細(xì)分[12]。同樣地,中國(guó)堇菜屬分類系統(tǒng)也存在類似問(wèn)題。我國(guó)堇菜屬先記錄有111種,分為4亞屬14組[2],后被修訂為96種(含35個(gè)中國(guó)特有種),分為5 亞屬,但未進(jìn)一步分組[3]。目前,我國(guó)堇菜屬的分子系統(tǒng)學(xué)研究資料不多,主要是基于ITS片段構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹(shù),并結(jié)合形態(tài)學(xué)證據(jù)展開(kāi)討論,認(rèn)為中國(guó)堇菜屬不宜分為4個(gè)亞屬,堇菜亞屬不是單系,討論了部分組間的親緣關(guān)系及形態(tài)特征演化趨勢(shì)[13-14]。
現(xiàn)有資料表明,堇菜屬的葉表皮細(xì)胞形態(tài)、毛被特征、氣孔類型、葉和葉柄的橫切面解剖結(jié)構(gòu)等在種間差異顯著,為近似種的劃分和屬內(nèi)組間分類提供了形態(tài)學(xué)證據(jù),但大部分研究集中在伊朗[15-17]、北美[18]和夏威夷地區(qū)[19]、澳大利亞[20-21]、我國(guó)東北及東部地區(qū)的一些種類[22-25]。這些研究說(shuō)明對(duì)于種類較多、分布廣,且分類困難的堇菜屬,以某個(gè)地域的分布物種為研究對(duì)象,不斷積累資料,對(duì)于全面理解其分類系統(tǒng)是有幫助的。云南是中國(guó)堇菜屬物種最豐富的地區(qū),占了全國(guó)近一半以上的種類,約有56 種及4 變種[26],但該地區(qū)的相關(guān)研究資料較少。野外調(diào)查中,作者發(fā)現(xiàn)云南常見(jiàn)的一些堇菜屬植物的花形態(tài)較為相似,容易混淆,也常被列為鑒定困難的近似種,包括產(chǎn)于滇西北開(kāi)黃花的灰葉堇菜(V.delavayi)和雙花堇菜(V.biflora),在滇中地區(qū)開(kāi)紫花的紫花地丁、早開(kāi)堇菜(V.prionantha)和香堇菜(V.odorata)等。同時(shí),筆者觀察到葉型在這些常見(jiàn)種間變化明顯,可用于物種鑒定,值得深入研究。例如,卵形葉最常見(jiàn),見(jiàn)于紫花地丁、早開(kāi)堇菜、香堇菜、七星蓮和灰葉堇菜,但前4 種被放置在堇菜亞屬(subgen.Viola),而灰葉堇菜為二裂花柱亞屬(subgen.Dischidium)。腎形葉、戟形葉和三裂葉等葉型較為少見(jiàn),分別見(jiàn)于雙花堇菜、長(zhǎng)萼堇菜(V.inconspicua)和南山堇菜(V.chaerophylloides),在當(dāng)?shù)剌啦藢倮镂锓N辨識(shí)度較高。
綜上所述,本研究選取上述云南常見(jiàn)的8種堇菜屬植物為研究對(duì)象(見(jiàn)表1),采納中國(guó)堇菜屬分為4亞屬14組的分類系統(tǒng)[2],通過(guò)醋酸離析法和石蠟切片技術(shù),在顯微鏡下觀察其葉表皮形態(tài)、葉片和葉柄橫切面解剖結(jié)構(gòu),比較種間的葉形態(tài)差異,為該屬的物種分類提供新資料。
表1 8種堇菜屬植物的基本信息[2]Table 1 Data of eight Viola species observed[2]
8 種堇菜屬植物(見(jiàn)表1)采集于2020—2021年春夏花期。野外觀察拍照記錄植株、花和葉片的形態(tài)特征,采集成熟葉片固定于50%乙醇,常溫保存。其中,灰葉堇菜和雙花堇菜屬于二裂花柱亞屬的短距堇菜組,分別采自大理市雞足山和麗江市黑龍?zhí)豆珗@。其余6 種代表了堇菜亞屬的4個(gè)組,均采自昆明植物園。值得說(shuō)明的是,灰葉堇菜為中國(guó)特有種(僅分布于云南、貴州和四川),香堇菜為國(guó)外引種栽培多年的觀賞植物,其余6種皆為北半球廣布種,在云南均有分布,生長(zhǎng)在溫帶和亞熱帶地區(qū)的林緣、灌木、草地和溪邊等[2]。
2.2.1 醋酸離析法觀察葉表皮形態(tài)
取固定后的葉片,沿中脈取1 cm×1 cm 的小塊,置于盛有適量解離液(V(30%過(guò)氧化氫)∶V(醋酸)=1∶1)[27]的小坩堝中。在烘箱中60 ℃加熱3~5 h,待葉表皮與葉肉組織分離后取出(必要時(shí)可用毛筆清除葉肉殘留組織),清水漂洗2~3 次后,置于潔凈的載玻片上并滴1~2 滴1%番紅染液,染色1~3 min。蓋上蓋玻片,洗去浮色,制作成臨時(shí)裝片,在尼康顯微鏡(DM750,日本)下觀察拍照。觀察上、下葉表皮的毛被類型、表皮細(xì)胞和氣孔類型及密度,利用Image J 軟件測(cè)量它們的大小,隨機(jī)測(cè)量記錄30 個(gè)數(shù)據(jù),求平均值。其中,氣孔指數(shù)=氣孔數(shù)量/(氣孔數(shù)量+葉表皮細(xì)胞數(shù)量)。專業(yè)術(shù)語(yǔ)參照文獻(xiàn)[28]。
2.2.2 石蠟切片法觀察葉中脈和葉柄橫切面結(jié)構(gòu)
取固定后的葉片,沿中脈處取葉片小塊(0.5 cm×0.5 cm)和距葉柄基部約1 cm 處截取0.5 cm 長(zhǎng)的葉柄段,每個(gè)物種各取5份樣品。樣品經(jīng)酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、常規(guī)石蠟切片(手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī),Leica RM2125 RTS,德國(guó)),切片厚度為8 μm。切片烘干后,經(jīng)番紅-固綠染色,加拿大樹(shù)脂膠封片,晾干后,在光學(xué)顯微鏡(Leica DM 750,德國(guó))下觀察葉片和葉柄橫切面特征,包括上、下表皮層、維管束輪廓、葉肉和柵欄組織等;利用Image J軟件測(cè)量它們的數(shù)據(jù)。
8 種堇菜屬植物在開(kāi)花期時(shí)的植株形態(tài)特征差異明顯,包括生長(zhǎng)習(xí)性、葉型及花形態(tài)等(圖版Ⅰ)。首先,生長(zhǎng)習(xí)性包括1年生和多年生草本,前者出現(xiàn)在七星蓮(圖版Ⅰ:6),后者出現(xiàn)在其余7個(gè)種。其次,成熟葉片幾乎光滑無(wú)毛,葉形態(tài)在種間變化明顯,可分為4 種:卵形葉(Ovate-shaped)、腎形葉(Reniform-shaped)、戟形葉(Hastate-shaped)和三全裂葉(Tri-lobed)。其中,卵形葉最普遍,出現(xiàn)在4 種:灰葉堇菜(圖版Ⅰ:2)、紫花地丁(圖版Ⅰ:5)、早開(kāi)堇菜(圖版Ⅰ:4)和香堇菜(圖版Ⅰ:7)。相反,腎形葉、戟形葉和三全裂較為獨(dú)特,分別見(jiàn)于雙花堇菜(圖版Ⅰ:1)、長(zhǎng)萼堇菜(圖版Ⅰ:3)和南山堇菜(圖版Ⅰ:8)。再次,花色變異在組間有一定規(guī)律,可分為黃花、紫花和白花。黃花出現(xiàn)在二裂花柱亞屬的雙花堇菜和灰葉堇菜(圖版Ⅰ:1~2);紫花出現(xiàn)在堇菜亞屬的3組4種,包括長(zhǎng)萼堇菜(圖版Ⅰ:3)、早開(kāi)堇菜(圖版Ⅰ:4)、紫花地?。▓D版Ⅰ:5)、七星蓮(圖版Ⅰ:6)和香堇菜(圖版Ⅰ:7);而白花僅出現(xiàn)在南山堇菜(圖版Ⅰ:8)。
圖版Ⅰ 8種堇菜屬植物的植株形態(tài)1.雙花堇菜;2.灰葉堇菜;3.長(zhǎng)萼堇菜;4.早開(kāi)堇菜;5.紫花地??;6.七星蓮;7.香堇菜;8.南山堇菜Plate Ⅰ Plant morphology of eight Viola species1.Viola biflora;2.V.delavayi;3.V.inconspicua;4.V.prionantha;5.V.philippica;6.V.diffusa;7.V.odorata;8.V.chaerophylloides
3.2.1 毛被特征
肉眼觀察下,8種植物在開(kāi)花期成熟葉片幾乎光滑無(wú)毛。但在顯微鏡下,除雙花堇菜、長(zhǎng)萼堇菜和香堇菜3 種的葉下表皮無(wú)毛外,其余5 種的葉片上下表皮均觀察到長(zhǎng)度不等、分布在葉緣和葉脈上的單列-單細(xì)胞-毛狀體(uniseriately singlecelled trichome)(圖版Ⅱ)。毛狀體的長(zhǎng)度在同種植物葉上下表皮的變化不大,但在種間差異明顯,最長(zhǎng)的出現(xiàn)在灰葉堇菜的上(903.69 μm)、下表皮(676.39 μm),最短的出現(xiàn)在南山堇菜的上(62.86 μm)、下表皮(136.94 μm)。根據(jù)長(zhǎng)度,葉表皮毛被可分為三類:短柱狀毛、中柱狀毛和長(zhǎng)柱狀毛。第一類短柱狀毛,是指毛狀體長(zhǎng)度小于150 μm,見(jiàn)于2 個(gè)種,包括南山堇菜的上、下表皮,密集在葉脈及葉緣(圖版Ⅱ:1~2)和香堇菜的上表皮(67.14 μm)的葉緣處(圖版Ⅱ:3)。第2類中柱狀毛,是指毛狀體長(zhǎng)度在150~300 μm,見(jiàn)于3種植物,包括雙花堇菜和長(zhǎng)萼堇菜的上表皮(分別為249.45、177.61 μm),前者密集分布于葉緣細(xì)齒處(圖版Ⅱ:5),后者均勻分布(圖版Ⅱ:6),以及紫花地丁的上(219.61 μm)、下表皮(162.88 μm),集中分布于葉緣及葉脈(圖版Ⅱ:4)。第3 類長(zhǎng)柱狀毛,是指毛狀體長(zhǎng)度大于300 μm,見(jiàn)于3 種,包括七星蓮的上(310.82 μm)、下表皮(630.46 μm)(圖版Ⅱ:8),灰葉堇菜的上(903.69 μm)、下表皮(676.39 μm)(圖版Ⅱ:9)。但早開(kāi)堇菜的上下表皮的毛被長(zhǎng)度略有差異,下表皮為中柱狀毛(201.49 μm),上表皮為長(zhǎng)柱狀毛(311.89 μm)(圖版Ⅱ:7),密集分布在葉脈及葉緣。
圖版Ⅱ 8種堇菜屬植物的3類葉表皮毛被類型1~3.短柱狀毛(1,2.南山堇菜(中脈,葉緣);3.香堇菜);4~6.中柱狀毛(4.紫花地?。?.雙花堇菜;6長(zhǎng)萼堇菜);7~9.長(zhǎng)柱狀毛(7.早開(kāi)堇菜;8.七星蓮;9.灰葉堇菜)Plate Ⅱ Three types of leaf trichome in eight Viola species1-3.Short-column trichome(1-2.V.chaerophylloides(midrib,ridge);3.V.odorata);4-6.Medium-column trichome(4.V.philippica;5.V.biflora;6.V.inconspicua);7-9.Long-column trichome(7.V.prionantha;8.V.diffusa;9.V.delavayi)
3.2.2 葉表皮細(xì)胞和氣孔特征
在顯微鏡下(圖版Ⅲ,表2),同種植物葉表皮的上表皮細(xì)胞比下表皮細(xì)胞大,形態(tài)和垂周壁樣式多為不規(guī)則形-淺波狀或深波狀,只有雙花堇菜的為多邊形-平直弓形(圖版Ⅲ:1~2)。同種植物的上下表皮細(xì)胞在4 個(gè)種里相同,其余4 個(gè)種不同。相同的出現(xiàn)在包括雙花堇菜在內(nèi)的4種:長(zhǎng)萼堇菜的為不規(guī)則淺波狀(圖版Ⅲ:9~10),紫花地丁和七星蓮為不規(guī)則深波狀(圖版Ⅲ:11~12,13~14)。不同的見(jiàn)于另4種:早開(kāi)堇菜和南山堇菜的上表皮為淺波狀(圖版Ⅲ:3,15),下表皮為深波狀(圖版Ⅲ:4);香堇菜和灰葉堇菜的上表皮為多邊形和平直-弓形(圖版Ⅲ:5,7),下表皮為不規(guī)則型和深波狀(圖版Ⅲ:6,8)。
表2 8種堇菜屬植物的葉表皮形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of leaf epidermis in eight Viola species
8種植物均具不等型氣孔,在灰葉堇菜和七星蓮里還觀察到少量的平列型和橫列型(圖版Ⅲ:7~8,13~14)。它們的氣孔主要分布于葉下表皮,密度較高,為密集型氣孔。除長(zhǎng)萼堇菜和南山堇菜外,其余6 種的上表皮也觀察到少量氣孔,但密度較低為稀疏型。氣孔有2種,除了長(zhǎng)萼堇菜和香堇菜的氣孔為近圓形(長(zhǎng)寬比為1.04~1.20)外,其余6種都為橢圓形(長(zhǎng)寬比為1.20~1.50)。
圖版Ⅲ 8種堇菜屬植物的葉表皮特征1~2.雙花堇菜(上表皮,下表皮);3~4.早開(kāi)堇菜(上表皮,下表皮);5~6.香堇菜(上表皮,下表皮);7~8.灰葉堇菜(上表皮,下表皮);9~10.長(zhǎng)萼堇菜(上表皮,下表皮);11~12.紫花地?。ㄉ媳砥?,下表皮);13~14.七星蓮(上表皮,下表皮);15.南山堇菜(上表皮)Plate Ⅲ Morphological characteristics of leaf epidermis in eight Viola species1, 2.Viola biflora(Adaxial epidermis,Abaxial epidermis);3, 4.V.prionantha(Adaxial epidermis,Abaxial epidermis);5, 6.V.odorata(Adaxial epidermis,Abaxial epidermis);7, 8.V.delavayi(Adaxial epidermis,Abaxial epidermis);9, 10.V.inconspicua(Adaxial epidermis,Abaxial epidermis);11, 12.V.philippica(Adaxial epidermis,Abaxial epidermis);13, 14.V.diffusa(Adaxial epidermis,Abaxial epidermis);15.V.chaerophylloides(Adaxial epidermis)
8種植物的葉中脈橫切面均由角質(zhì)層、上下表皮層、柵欄組織、葉肉細(xì)胞和維管束組成(圖版Ⅳ)。其中,上表皮細(xì)胞比下表皮的大,柵欄組織普遍分化不明顯,部分物種存在方形晶狀體,分布于柵欄和薄壁細(xì)胞之間,以雙花堇菜最明顯(圖版Ⅳ:6),香堇菜(圖版Ⅳ:1)和灰葉堇菜的零星可見(jiàn)(圖版Ⅳ:5)。結(jié)果表明,葉中脈處的表皮突起和葉片厚度在種間差異明顯(表3)。首先,葉中脈橫切面主維管束處的上下表皮突起,來(lái)源于表皮下多了1層細(xì)胞形態(tài)相似的次生表皮細(xì)胞,由于種內(nèi)和種間的上下表皮細(xì)胞大小不同,故形成大小相似的均等型和大小不同的不等型突起。前者指上下表皮突起微微向外隆起,大小形態(tài)一致、近似對(duì)稱(圖版Ⅳ:1~4),出現(xiàn)在4 種:香堇菜(圖版Ⅳ:1)、紫花地?。▓D版Ⅳ:2)、長(zhǎng)萼堇菜(圖版Ⅳ:3)和七星蓮(圖版Ⅳ:4)中。后者指上下表皮突起輪廓形態(tài)大小不一,見(jiàn)于另4種:灰葉堇菜(圖版Ⅳ:5)、雙花堇菜(圖版Ⅳ:6)、早開(kāi)堇菜(圖版Ⅳ:7)和南山堇菜(圖版Ⅳ:8)。再次,葉片厚度在種間也有差異,分為厚葉型(>200 μm)和薄葉型(≤200 μm),前者見(jiàn)于3個(gè)種:雙花堇菜(267.81 μm)、紫花地?。?18.76 μm)和南山堇菜(208.76 μm);后者出現(xiàn)在5種:灰葉堇菜(109.84 μm)、長(zhǎng)萼堇菜(158.35 μm)、早開(kāi)堇菜(143.45 μm)、七星蓮(151.66 μm)、香堇菜(195.88 μm)。其中葉片最厚的見(jiàn)于雙花堇菜,最薄的出現(xiàn)在灰葉堇菜,兩者厚度相差近2.5倍。
圖版Ⅳ 8種堇菜屬植物葉片主脈的橫切面解剖特征1~4.均等型(1.香堇菜;2.紫花地丁;3.長(zhǎng)萼堇菜;4.七星蓮);5~8.不等型(5.灰葉堇菜;6.雙花堇菜;7.早開(kāi)堇菜;8.南山堇菜);C.晶體;E.表皮;Ph.韌皮部;Pp.柵欄組織;Sp:海綿組織;T.毛被;Xy.木質(zhì)部Plate Ⅳ Cross sections of leaf midrib in eight Viola species1-4.Equa(l1.Viola odorata;2.V.philippica;3.V.inconspicua;4.V.diffusa);5-8.Unequal(5.V.delavayi;6.V.biflora;7.V.prionantha;8.V.chaerophylloides);C.Crystal;E.Epidermis;Ph.Phloem;Pp.Palisade parenchyma;Sp.Spongy parenchyma;T.Trichome;Xy.Xylem
8種植物的葉柄橫切面均由表皮層、厚角組織和維管束組織構(gòu)成(圖版Ⅴ)。表皮細(xì)胞較小、排列整齊,構(gòu)成閉合結(jié)構(gòu),外壁有薄角質(zhì)層。表皮內(nèi)有4~10 層薄壁細(xì)胞構(gòu)成的厚角組織,細(xì)胞大小不一、排列疏松,有明顯胞間隙。主維管束位于中央,其形態(tài)與葉柄橫切面形態(tài)相似。葉柄兩側(cè)近軸面有明顯延伸生長(zhǎng)的突起,構(gòu)成帶有1對(duì)側(cè)生維管束的側(cè)翼。比較分析結(jié)果表明,葉柄橫切面輪廓、兩側(cè)近軸面的側(cè)翼突起、主維管束形態(tài)和側(cè)生維管束在同種植物里有一定的相關(guān)性,但在種間區(qū)別較大。葉柄橫切面形態(tài)輪廓在8個(gè)種間差異明顯,可分為3 類(表3):橢圓形、近圓形和圓形。橢圓形,指橫切面較薄,其輪廓與主維管束的都呈橢圓狀,近軸面表皮平直或中央微隆,無(wú)凹陷,遠(yuǎn)軸面為半弧形曲線;葉柄兩側(cè)外緣處帶1對(duì)具次生維管束的延伸側(cè)翼(圖版Ⅴ:1~4);見(jiàn)于長(zhǎng)萼堇菜、七星蓮、早開(kāi)堇菜和紫花地丁4 種。近圓形,指橫切面較厚、近餅狀,輪廓與主維管束的呈近圓形或深U 型(圖版Ⅴ:6~8),近軸面兩側(cè)有1 對(duì)具側(cè)生維管束的側(cè)翼突起,與中央的突起構(gòu)成了帶有1 對(duì)側(cè)翼的3 個(gè)脊?fàn)盥∑穑▓D版Ⅴ:6~8),見(jiàn)于灰葉堇菜、南山堇菜和香堇菜等3 種。圓形,指葉柄橫切面厚,近軸面兩側(cè)有次生維管束不明顯的側(cè)翼突起,中央隆起呈短弧形,與遠(yuǎn)軸面的長(zhǎng)弧形連接成帶1 對(duì)側(cè)翼圓周,與中央的圓形維管束構(gòu)成同心圓或環(huán)形,只見(jiàn)于雙花堇菜(圖版Ⅴ:5)。較為特別的是,該種的主維管束形態(tài)完整,呈閉合環(huán)狀,但韌皮部細(xì)胞出現(xiàn)分化,將其平分為4瓣,具有染色較淺的髓部。
表3 8種堇菜屬植物葉中脈和葉柄的橫切面解剖特征Table 3 Cross-sectional anatomical features of leaf and petiole in eight Viola species
本研究觀察的云南常見(jiàn)8種堇菜屬植物,分別來(lái)自2 亞屬5 組[2],包括二裂花柱亞屬的短距堇菜組(灰葉堇菜和雙花堇菜)和堇菜亞屬的4組,即合生托葉組(Sect.Adnatae)(長(zhǎng)萼堇菜、紫花地丁、早開(kāi)堇菜)、蔓莖堇菜組(Sect.Diffusae)(七星蓮)、裂葉堇菜組(Sect.Pinnatae)(南山堇菜)、堇菜組(Sect.Viola)(香堇菜)。圍繞著堇菜屬存在的組間分類和物種鑒定困難,本研究討論了它們的葉形態(tài)和解剖特征的分類學(xué)意義。
長(zhǎng)期以來(lái),堇菜屬的組和亞組的劃分依據(jù)主要是花形態(tài)特征變異,尤其是柱頭和花柱特征是主要的分類學(xué)依據(jù)[8]。在野外,堇菜屬的花柱是否彎曲、柱頭孔大小和位置等有分類學(xué)意義的顯微特征不容易觀察,導(dǎo)致了物種鑒定相對(duì)困難[3-4]。為此,本研究討論了云南8種常見(jiàn)植物的葉形態(tài)分類學(xué)意義。首先,雙花堇菜和灰葉堇菜均見(jiàn)于海拔2 000 m 以上的高山草地,花期相同,均為黃花,屬于二裂柱頭亞屬的短距組,野外不易區(qū)別,兩者僅在葉形態(tài)區(qū)別明顯。雙花堇菜的葉型多為寬卵形或腎形,其基部為深心形或心形;灰葉堇菜的葉片為三角狀寬卵形,其葉基為淺心形或截型。其次,堇菜亞屬的合生托葉組的3種(長(zhǎng)萼堇菜、紫花地丁和早開(kāi)堇菜),由于同具紫花、葉型相似,常被列為近似種,甚至合并為紫花地丁一個(gè)種[2,24]。但在野外,長(zhǎng)萼堇菜為寬卵形葉,葉緣具粗齒、葉基心形、葉尖明顯;早開(kāi)堇菜寬卵形葉,近橢圓形,葉緣具細(xì)齒、葉基弧心形,葉尖不顯著;紫花地丁葉片為狹卵型,僅長(zhǎng)披針形,足以和前2 種區(qū)別。因此,這3 個(gè)種不宜合并,支持前人的觀點(diǎn)[2]。此外,深裂葉片和腎形葉在云南常見(jiàn)的堇菜屬里較為少見(jiàn),在當(dāng)?shù)乜梢宰鳛槲锓N鑒定依據(jù)。深裂葉片是南山堇菜所在的裂葉堇菜組的主要分類學(xué)依據(jù),稀不裂[2-3]。該組在我國(guó)有8 種,大部分都分布在東北,云南只有1 種,為羽裂堇菜(V.forrestiana),分布在滇西北和藏東南高山草地,但該種的葉片為三角狀卵形或狹卵型,只在葉緣處有羽狀淺裂[26]。同時(shí),在國(guó)產(chǎn)的裂葉堇菜組的8 個(gè)種里,南山堇菜的三深裂葉片且開(kāi)白花的形態(tài)特征也較為獨(dú)特[2-3]。因此,對(duì)于云南常見(jiàn)堇菜屬植物的物種鑒定而言,看到三深裂的羽狀裂片葉,就可以將其初步判斷為南山堇菜。腎形葉見(jiàn)于堇菜組的香堇菜,雖分布在歐洲、北非和西亞等地,但由于具有較高觀賞價(jià)值,被廣為栽培,其腎形葉或近圓形葉在園藝堇菜植物里也較為獨(dú)特且少見(jiàn)。因此,腎形葉是香堇菜的物種鑒別特征之一。當(dāng)然,葉型在物種多樣性較高的堇菜屬里變異較大,部分種類由于生境不同而產(chǎn)生了不同的變型或亞種,值得進(jìn)一步研究。但在部分地域范圍內(nèi)、具明顯地理分布格局的堇菜屬區(qū)系范圍,種間的葉型變化可作為云南常見(jiàn)種或近似種的鑒定依據(jù)之一[26]。
圖版V 8種堇菜屬植物葉柄橫切面解剖特征1~4.橢圓形(1.長(zhǎng)萼堇菜;2.紫花地??;3.早開(kāi)堇菜;4.七星蓮);5.近圓形(雙花堇菜);6~8.深U 形(6.灰葉堇菜;7.南山堇菜;8.香堇菜);E.表皮;Lvb.側(cè)生維管束;Pi.髓部;Ph.韌皮部;Xy.木質(zhì)部Plate V Cross section of leaf petiole in eight Viola species1-4.Elliptica(l1.V.inconspicua;2.V.philippica;3.V.prionantha;4.V.diffusa);5.Orbicula(rV.biflora);6-8.Deep-U shape(6.V.delavayi;7.V.chaerophylloides;8.V.odorata);E.Epidermis;Lvb.Lateral vascular bundle;Ph.Phloem;Pi.Pith;Xy.Xylem
關(guān)于堇菜屬毛被特征的分類學(xué)意義,研究資料較少。早期研究表明,堇菜屬的葉毛被類型為簡(jiǎn)單的單細(xì)胞毛或單列毛,并指出在葉緣有鋸齒的種類里,其葉緣處的毛被為粗糙的腺體毛[29]。后來(lái)的研究也陸續(xù)證實(shí)了堇菜屬的葉表皮毛普遍為單細(xì)胞毛,上下表皮毛被的有無(wú)及其分布特征都用于物種鑒定。例如,南京產(chǎn)的紫花堇菜(V.grypoceras)和球果堇菜(V.collina)的下表皮都密被單細(xì)胞毛[30];東北產(chǎn)的27種堇菜屬植物里,除香堇菜為2 細(xì)胞單列毛外,其余26 種都為單細(xì)胞毛[25];伊朗產(chǎn)的3 個(gè)近緣種(香堇菜、白花堇菜V.alba&V.sintenisii)也都具有單細(xì)胞毛[16]。本研究觀察的8種植物的葉表皮毛被類型都為單細(xì)胞毛,沒(méi)有觀察到單列毛,也未在葉緣有鋸齒的種類里看到葉緣處的有腺體毛。值得注意的是,伊朗產(chǎn)的香堇菜單細(xì)胞毛只分布在上表皮,被列為區(qū)分近似種的鑒定依據(jù)[16]。該種的毛被特征與本研究觀察的云南產(chǎn)的香堇菜一致。如上所述,單列毛在堇菜屬里較為少見(jiàn),只在堇菜組的球果堇菜觀察到2細(xì)胞單列毛[24],目前尚未有其他類型的單列毛的資料。有意思的是,球果堇菜產(chǎn)自東北的植株有2 細(xì)胞單列毛,但長(zhǎng)在南京的個(gè)體,其毛被為單細(xì)胞長(zhǎng)柱狀毛,且較為密集[30]。此外,香堇菜也屬于堇菜組,但無(wú)論是產(chǎn)自伊朗或生長(zhǎng)在云南的植株,其毛被都為單細(xì)胞毛。顯然,毛被類型在堇菜屬的分類學(xué)意義,需要更多新資料佐證。
如上所述,堇菜屬的毛被類型和分布在種間差異明顯,可作為物種劃定依據(jù)。然而,毛被長(zhǎng)度在種間的變化和分類學(xué)意義,鮮有人關(guān)注。遼東地區(qū)的15種堇菜屬植物的毛被長(zhǎng)度在種間差異明顯[31],但缺乏深入研究的數(shù)據(jù)。本研究觀察到毛被長(zhǎng)度在8種植物里區(qū)別明顯,將其分為3 類,即:短柱狀毛、中柱狀毛和長(zhǎng)柔毛。其中,最容易鑒別的是短柱狀毛,其長(zhǎng)度僅為60 μm 左右,基部寬、頂部銳,狀如寬短刺或盾鱗片,長(zhǎng)度不及中柱狀毛和長(zhǎng)柱狀毛的十分之一,而后者為基部寬而頂部尖的長(zhǎng)單細(xì)胞毛。短柱狀毛較少,僅見(jiàn)于具腎形葉的香堇菜(堇菜組)和具羽狀深裂葉的南山堇菜(裂葉堇菜組)。其次,中柱狀毛集中出現(xiàn)在堇菜亞屬的合生托葉組的3 個(gè)種,而蔓莖堇菜組(七星蓮)上表皮為長(zhǎng)柱狀毛,下表皮為中柱狀毛。這意味著長(zhǎng)柱狀毛也許可以作為合生托葉組的分類學(xué)依據(jù)之一。同樣地,二裂柱頭堇菜亞屬的灰葉堇菜和雙花堇菜各具長(zhǎng)柱狀毛和中柱狀毛,兩類毛被的長(zhǎng)度相差近4 倍,較容易區(qū)別。因此,毛被長(zhǎng)度在種間的差異,可以作為物種鑒定依據(jù)。
首先,堇菜屬的葉表皮細(xì)胞形態(tài)和垂周壁樣式在種間差異明顯,多數(shù)為不規(guī)則型和淺波狀或深波狀,少數(shù)為多邊形和平直-弓形[24,29]。本研究觀察的8種植物,表皮細(xì)胞不規(guī)則型帶波狀垂周壁的出現(xiàn)在堇菜亞屬的3 組5 種(南山堇菜除外),多邊形和平直-弓形表皮細(xì)胞見(jiàn)于3 種,即二裂柱頭亞屬的雙花堇菜、灰葉堇菜和南山堇菜。目前,關(guān)于葉表皮細(xì)胞類型的分類學(xué)意義,僅見(jiàn)于近似種間的劃分[25]。本研究觀察的近似種,如雙花堇菜和灰葉堇菜雖然在葉型上區(qū)別明顯,但葉表皮細(xì)胞形態(tài)差異也可將其分開(kāi),即:雖然它們的上表皮都為多邊形,但后者的下表皮為不規(guī)則深波狀,可以將2種分開(kāi)。在長(zhǎng)萼堇菜、紫花地丁和早開(kāi)堇菜這3個(gè)近似種的鑒定里,前者上下表皮為淺波狀與后2 種的深波狀區(qū)別明顯。紫花地丁的上下表皮皆為深波狀,但早開(kāi)堇菜的上表皮為淺波,下表皮為深波,也可作為鑒定參考依據(jù)。
其次,堇菜屬的氣孔普遍見(jiàn)于上下表皮,下表皮比上表皮常見(jiàn),氣孔呈橢圓形,或近圓形,氣孔器類型普遍為不等型或橫列型等[15,29,30]。本研究觀察的8 種植物,除了南山堇菜的上表皮無(wú)氣孔外,其余上下表皮都有不等型氣孔,在灰葉堇菜和七星蓮還兼具平列型、橫列型或不等型。除長(zhǎng)萼堇菜和香堇菜的氣孔為圓形外,其余6種都為橢圓形。顯然氣孔形態(tài)在種內(nèi)比較穩(wěn)定,在種間差異明顯,可用于物種劃分。例如,根據(jù)氣孔形態(tài),可以把長(zhǎng)萼堇菜與其近似種(紫花地丁和早開(kāi)堇菜)區(qū)別開(kāi)來(lái),前者具圓形氣孔,后兩種為橢圓形氣孔。然而,氣孔器類型在同種和不同種植物里變化較大,氣孔密度和氣孔指數(shù)雖然種間也有差異,但難以比較其在種間或組間的分布規(guī)律,更多的與物種適應(yīng)環(huán)境相關(guān)[28]。不過(guò),也有研究認(rèn)為,氣孔類型可以作為堇菜屬的組間界限劃分依據(jù)。例如,以三色堇為代表的美麗堇菜亞屬的氣孔類型為圍繞型,以雙花堇菜為代表的二裂柱頭亞屬為極細(xì)胞型;裂葉堇菜組不具有四細(xì)胞型氣孔器,因此支持其獨(dú)立為組[23]。顯然,僅以1個(gè)物種為代表來(lái)探究氣孔類型在組間的分類學(xué)意義有其局限性,仍需更多資料來(lái)支持。
葉中脈和葉柄橫切面輪廓、主維管束形態(tài)、次生維管束數(shù)目和晶狀體的有無(wú)等特征在同種植物里是相對(duì)穩(wěn)定而恒定的,具有重要的物種鑒定意義[32-34]。但關(guān)于堇菜屬的葉中脈和葉柄橫切面解剖特征的分類學(xué)研究的資料較少,本研究初步分析如下。
首先,關(guān)于葉中脈處結(jié)構(gòu)特征的分類學(xué)意義有兩點(diǎn)值得說(shuō)明。第一,早期研究記錄了堇菜屬的部分種類葉中脈橫切面柵欄組織化不明顯,但在夏威夷分布的種類里分化為形態(tài)顯著的柵欄和海綿組織[19,30]。該柵欄組織分化不明顯的葉解剖特征,在伊朗產(chǎn)的堇菜屬植物里也普遍[15],本研究觀察的云南產(chǎn)的8個(gè)種的柵欄組織也不明顯,說(shuō)明該特征值得繼續(xù)關(guān)注。第二,堇菜屬的葉中脈橫切面的上下表皮突起在種間多為凸起型,少數(shù)為平直型,可用于伊朗產(chǎn)的堇菜屬近似種和亞種間的區(qū)別[16]。然而,他們觀察的8 種植物都為凸起型,沒(méi)觀察到平直型,且葉中脈處的上下表皮突起在同種植物也有差異,可分為均等型和不等型,在種間差異明顯,但對(duì)此沒(méi)有深入分析[16]。本研究觀察到的同種植物上下表皮突起是否等大的特征,可以較好地用于物種鑒定。例如:均等型突起出現(xiàn)在堇菜亞屬的3 個(gè)近似種(香堇菜、紫花地丁和長(zhǎng)萼堇菜)和七星蓮。這證實(shí)了3個(gè)近似種在葉形態(tài)解剖特征方面具有相似性,但3種的主維管束的形態(tài)又各有不同,可以相區(qū)別,支持其為獨(dú)立的近似種,并與七星蓮還有一定的相關(guān)性。反之,不等型上下表皮突起見(jiàn)于其余4 種。雖然它們的主維管束都為典型的新月形,但各有區(qū)別。例如,除南山堇菜外,其余3 種的下表皮突起大于上表皮;雙花堇菜和灰葉堇菜的維管束形態(tài)為近圓形,前者有大量的方形晶狀體,后者有稀疏星狀晶體;早開(kāi)堇菜單細(xì)胞毛。
其次,關(guān)于堇菜屬葉柄解剖特征的分類學(xué)意義,集中在葉柄橫切面及主維管束的形態(tài)、次生維管束數(shù)目、上表皮兩側(cè)的翼狀突起及中部的脊?fàn)钔黄饠?shù)目等在種間差別明顯[15-16,33]。與上述研究結(jié)果基本相似,本研究觀察的8種植物的葉柄橫切面均具有中央維管束和1 對(duì)帶次級(jí)維管束的兩側(cè)翼狀突起。但葉柄橫切面和中央維管束形態(tài)相關(guān),基本為橢圓形、近圓形和圓形等,在種間差異較大,可作為近似種之間的分析[16]。例如,雙花堇菜和灰葉堇菜這對(duì)近似種,兩者區(qū)別明顯,前者葉柄橫切面為圓形,后者呈具有缺口的近圓形。值得關(guān)注的是,雙花堇菜的葉柄解剖特征很特別,主維管束形態(tài)為閉合狀圓形,其中央分化出髓,這在現(xiàn)有資料里都是極少見(jiàn)的,值得進(jìn)一步研究。不過(guò),堇菜亞屬的3個(gè)近似種(早開(kāi)堇菜、長(zhǎng)萼堇菜和紫花地?。┖推咝巧彛哂邢嗨频娜~柄橫切面形態(tài),均為橢圓形和具月牙形主維管束特征。因此,結(jié)合它們?cè)谌~中脈橫切面解剖特征的相似性,進(jìn)一步說(shuō)明了這3個(gè)近似種為有近緣關(guān)系的獨(dú)立種,同時(shí)還與七星蓮有一定的親緣關(guān)系,值得進(jìn)一步研究。
再次,關(guān)于堇菜屬的葉片晶狀體的形態(tài)及其分類學(xué)意義資料較少。早期研究記錄了堇菜屬的葉肉和葉柄含有大量的單獨(dú)或成簇的晶狀體[16,21,25];在伊朗產(chǎn)的物種里,星狀或方形的晶狀體也普遍見(jiàn)于不同種,可作為屬下分組的依據(jù)[15-17]。但本研究在8種植物的葉中脈和葉柄橫切面結(jié)構(gòu)上,僅在雙花堇菜發(fā)現(xiàn)有密集的方形晶狀體,在灰葉堇菜和香堇菜的葉中脈和葉柄橫切面上有稀疏分布的晶體。
綜上所述,堇菜屬的葉型態(tài)、表皮毛被類型、葉表皮細(xì)胞形態(tài)、氣孔形態(tài)和氣孔器類型、葉中脈和葉柄橫切面解剖特征在種間差異明顯,可用于屬內(nèi)物種鑒定及近似種的劃分[28-29]。根據(jù)葉形態(tài)、葉中脈和葉柄橫切面解剖特征,編制了云南常見(jiàn)8種堇菜屬植物的分類檢索表,具體如下。
8種堇菜屬植物檢索表-主要根據(jù)葉形態(tài)解剖特征
Key to eight Viola species mainly based on the morpho-anatomy of leaf
1.花黃色。………………………………………………………………………………………………………………………………………(2)
1.花白色或紫色?!?)
2.卵形葉;葉下表皮細(xì)胞為不規(guī)則型,垂周壁深波狀;長(zhǎng)柱狀毛;中脈處上下葉表皮突起為均等型,葉片??;葉柄橫切面近圓形,主維管束深U型……………………………………………………………………………………………………………………………灰葉堇菜V.delavayi
2.腎形葉;葉下表皮細(xì)胞多邊形,垂周壁平直弓形;中柱狀毛;中脈處上下葉表皮突起為不等型,葉片厚;葉柄橫切面圓形,主維管束圓型……………………………………………………………………………………………………………………………………雙花堇菜V.biflora
3.花白色;葉片三全裂………………………………………………………………………………………………南山堇菜V.chaerophylloides
3.花紫色,葉片非三全裂。………………………………………………………………………………………………………………………(4)
4.戟形葉……………………………………………………………………………………………………………………長(zhǎng)萼堇菜V.inconspicua
4.卵形葉。………………………………………………………………………………………………………………………………………(5)
5.葉上下表皮細(xì)胞形態(tài)相同;葉中脈處上下表皮突起均等型?!?)
5.葉上下表皮細(xì)胞形態(tài)不同;葉中脈處上下表皮突起不等型。………………………………………………………………………………(7)
6.葉片?。欢讨鶢蠲?;葉柄橫切面半圓形,主維管束深U形……………………………………………………………………香堇菜V.odorata
6.葉片厚;中柱狀毛;葉柄橫切面橢圓形,主維管束淺U形………………………………………………………………紫花地丁V.philippica
7.葉上表皮細(xì)胞垂周壁式樣不規(guī)則淺波,下表皮為不規(guī)則深波狀………………………………………………………早開(kāi)堇菜V.prionantha
7.葉上下表皮細(xì)胞均為不規(guī)則深波狀……………………………………………………………………………………………七星蓮V.diffusa