劉曉娜, 李戈輝, 陳 穎, 楊桂朋, 丁海兵??

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266100; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài) 與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237; 3. 中國(guó)船舶工業(yè)系統(tǒng)工程研究院, 北京 100094)

低分子量有機(jī)酸(LMWOAs, low-molecular weight-organic acids)是海洋溶解有機(jī)物的重要組成部分[1],能夠調(diào)節(jié)海水的pH值,海洋生物也將其作為可吸收利用的主要碳源之一[2]。其來(lái)源廣泛,包括陸源輸入、大氣沉降、海洋生物的生產(chǎn)釋放等[3]。藻類(lèi)和微生物是水體中LMWOAs主要生產(chǎn)者。藻類(lèi)在生長(zhǎng)初期能夠釋放一些容易被生物體吸收的低分子量物質(zhì),如LMWOAs、氨基酸等[4];藍(lán)藻在厭氧環(huán)境下能夠產(chǎn)生乳酸、乙酸等LMWOAs[5];在沉積物間隙水中檢測(cè)到較高濃度乙酸,主要源于微生物的厭氧呼吸和發(fā)酵等過(guò)程[6];缺氧海水中的產(chǎn)甲烷菌和還原產(chǎn)乙酸菌也可以產(chǎn)生LMWOAs[7]。海洋中LMWOAs濃度低、消耗速度快,且產(chǎn)生和消耗機(jī)制較為復(fù)雜,目前相關(guān)研究十分匱乏,特別是海洋藻類(lèi)生長(zhǎng)對(duì)海水LMWOAs影響的研究未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。藻類(lèi)是海洋生態(tài)系統(tǒng)賴以生存的基礎(chǔ),探究海洋藻類(lèi)生長(zhǎng)與海水環(huán)境中LMWOAs的關(guān)系,有助于更深入地了解海洋有機(jī)碳循環(huán)及海洋酸化等過(guò)程。

顆石藻(Coccolithophore)隸屬定鞭藻門(mén)(Haptophyta)、定鞭藻綱(Prymnesiophyceae),目前發(fā)現(xiàn)并記錄在冊(cè)的顆石藻有400多種[16],廣泛分布在全球海域[17]?，F(xiàn)在所見(jiàn)的大多數(shù)顆石藻屬于異晶顆石藻,赫氏圓石藻(Emilianiahuxleyi)是其中的典型代表,其耐受海水壓力和酸性的特點(diǎn)導(dǎo)致其在海底化石也較為常見(jiàn)[18]。赫氏圓石藻作為現(xiàn)代海洋中占主導(dǎo)地位的顆石藻[19],適宜生長(zhǎng)在18～23 ℃,正常鹽度的海水中[20]。研究表明,熱帶、溫帶及近岸海域,海水經(jīng)過(guò)季節(jié)變化的垂直混合、海水層化、中心環(huán)流等過(guò)程,形成有利于顆石藻生長(zhǎng)的環(huán)境,可使赫氏圓石藻形成優(yōu)勢(shì)藻種[21-23],容易形成藻華[24]。目前,赫氏圓石藻已經(jīng)成為研究海洋碳循環(huán)的模式生物之一[25]。顆石藻不易溶解的碳酸鈣(CaCO3)結(jié)構(gòu)是深海碳酸鹽的主要來(lái)源之一,對(duì)海洋中CaCO3生產(chǎn)量貢獻(xiàn)約50%[26],在全球鈣循環(huán)和碳循環(huán)中起重要作用[27-29]。赫氏圓石藻也被認(rèn)為是海洋環(huán)境主要的方解石生產(chǎn)者[19],它們還能合成長(zhǎng)鏈烯酮,指示其生長(zhǎng)時(shí)期的水體溫度,在古海洋學(xué)和古氣候?qū)W研究中具有重要意義[30-31]。然而,到目前為止,赫氏圓石藻生長(zhǎng)過(guò)程對(duì)海水LMWOAs影響的相關(guān)研究幾乎沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。

本論文以海洋中兩種代表性藻類(lèi)中肋骨條藻和赫氏圓石藻為研究對(duì)象,通過(guò)設(shè)置不同滅菌狀態(tài)和光暗周期,考察細(xì)菌共存和光照條件對(duì)它們生長(zhǎng)過(guò)程的影響,追蹤不同生長(zhǎng)條件下兩種藻生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液LMWOAs含量、pH、葉綠素含量等參數(shù)的變化情況,探究藻類(lèi)生長(zhǎng)過(guò)程中LMWOAs的產(chǎn)生動(dòng)力學(xué)及其影響因素。本研究有助于進(jìn)一步了解海洋浮游微藻生命活動(dòng)與海洋環(huán)境相互作用情況,為更加深入地掌握不同藻類(lèi)大量繁殖形成的藻華,特別是赤潮等有害藻華對(duì)海水CO2系統(tǒng)和海洋有機(jī)碳組成的影響提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 藻種和培養(yǎng)液

實(shí)驗(yàn)所用中肋骨條藻和赫氏圓石藻由中國(guó)海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院海洋界面化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。用f/2培養(yǎng)液[32-33]對(duì)兩種藻進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)液中所用海水采集自青島石老人海域,并用0.45 μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾,培養(yǎng)液用0.22 μm濾膜過(guò)濾。

1.2 藻類(lèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

1.2.1 藻類(lèi)培養(yǎng)預(yù)實(shí)驗(yàn) 兩種藻的生長(zhǎng)狀況、生長(zhǎng)周期通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定,以便更好地計(jì)劃正式的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)中,將中肋骨條藻分別接種至滅菌和未滅菌培養(yǎng)液中,分別設(shè)置3種光照條件進(jìn)行培養(yǎng),每日記錄其生長(zhǎng)狀況,以掌握兩種藻的生長(zhǎng)周期。

滅菌組所用海水用手提式壓力蒸汽滅菌鍋(YXQ-SG46-280S,上海博迅)121 ℃高溫滅菌30 min后加入滅菌的f/2培養(yǎng)液;未滅菌組海水直接加入f/2培養(yǎng)液。

設(shè)置培養(yǎng)箱(GXZ-250A,寧波江南儀器廠)光照強(qiáng)度4 000 Lx(冷白光源),溫度(22±1) ℃。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3種光暗周期,光暗比(L∶D)分別為18 h∶6 h,12 h∶12 h,6 h∶18 h。培養(yǎng)條件分別以A、B、C、D、E、F表示,如表1所示。

表1 中肋骨條藻和赫氏圓石藻的培養(yǎng)參數(shù)

取處于指數(shù)生長(zhǎng)中期的中肋骨條藻藻液約1.5 mL接種到含培養(yǎng)液350 mL的錐形瓶(規(guī)格為500 mL)中,初始細(xì)胞密度約為1.25×104個(gè)·mL-1。每日定時(shí)搖藻,隔日定時(shí)取樣,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。25×16型血球計(jì)數(shù)板(型號(hào):XB-K-25)規(guī)格為0.002 5 mm2,計(jì)數(shù)公式為:

細(xì)胞個(gè)數(shù)(mL-1)=(80個(gè)小方格細(xì)胞總數(shù)/80)×104×稀釋倍數(shù)

根據(jù)每日統(tǒng)計(jì)的藻細(xì)胞數(shù)目計(jì)算細(xì)胞密度,并繪制生長(zhǎng)曲線。

赫氏圓石藻培養(yǎng)方法同上,初始細(xì)胞密度約為1.00×104個(gè)·mL-1。

1.2.2 藻類(lèi)連續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)1.2.1中預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,設(shè)計(jì)連續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的生長(zhǎng)周期,對(duì)中肋骨條藻培養(yǎng)組設(shè)定取樣時(shí)間為第2、6、10、14、18、21、25天,對(duì)赫氏圓石藻培養(yǎng)組取樣時(shí)間設(shè)定為第2、6、10、14、17、21天。在相應(yīng)的天數(shù)從對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)瓶中采集10 mL培養(yǎng)液于棕色玻璃瓶中,用0.22 μm的聚醚砜濾膜過(guò)濾后,于-20 ℃冷凍保存,以便后續(xù)測(cè)定培養(yǎng)液LMWOAs的濃度。

1.3 低分子量有機(jī)酸含量測(cè)定

本研究培養(yǎng)液中的LMWOAs的測(cè)定方法采用的是改進(jìn)的衍生化高效液相色譜(HPLC)法[34]。

1.3.1 繪制LMWOAs標(biāo)準(zhǔn)曲線 配置濃度均為0.10 mol·L-1的甲酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為原始儲(chǔ)備液。對(duì)原始儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋,配制成濃度為0.00,1.00,5.00,10.00,20.00,30.00,40.00,50.00,60.00,80.00,100.00 μmol·L-1的低濃度LMWOAs標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)后續(xù)衍生化過(guò)程處理,通過(guò)HPLC分析,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以上試劑均為分析純,來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.3.2 樣品衍生化 取2 mL過(guò)濾后的藻類(lèi)培養(yǎng)液至4 mL棕色硼硅酸鹽玻璃瓶中,加入200 μL體積比為1∶1的鹽酸吡啶溶液(吡啶純度≥99.99%,Sigma公司),通高純氮?dú)饧s5 min(排除CO2),依次加入0.1 mol·L-12-硝基苯肼(NPH,純度≥97%,Sigma公司)溶液和0.3 mol·L-12-二甲基氨丙基碳化二亞胺(EDC,純度≥99.99%,Sigma公司)溶液各200 μL,輕晃搖勻,室溫避光靜置2.5 h。待衍生化反應(yīng)完成,加入200 μL 40%(w/v)的KOH溶液,混勻于70 ℃恒溫金屬浴中(HB120-S,大龍興創(chuàng))加熱10 min,隨后用0.45 μm聚醚砜濾膜過(guò)濾,取上清液100 μL通過(guò)HPLC進(jìn)行定量分析。

1.3.3 LMWOAs測(cè)定 本研究所使用的HPLC為Agilent-1100(美國(guó)安捷倫科技公司),用于分析的色譜柱是Agilent Eclipse XDB-C8(4.6 mm × 150 mm × 5 μm)。流動(dòng)相A:50 nmol·L-1乙酸鈉、2 mmol·L-1四丁基氫氧化銨(純度≥99.99%,Sigma公司)溶液、2.5%正丁醇溶液和2 mmol·L-1溴化十四烷基甲胺(TDTMABr,純度≥99.99%,Sigma公司)溶液,用色譜純磷酸調(diào)節(jié)pH至4.5左右;流動(dòng)相B:50 mmol·L-1TDTMABr溶液。以上未注明的其他試劑均為分析純,來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)。HPLC洗脫程序如表2所示。

表2 洗脫程序

使用該方法檢測(cè)到培養(yǎng)液中含有三種LMWOAs:乳酸(LA)、乙酸(AA)和甲酸(FA),其保留時(shí)間分別為7,9和10 min;檢出限分別為0.13,0.32和0.12 μmol·L-1[35]。根據(jù)1.3.1繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品峰面積,計(jì)算出培養(yǎng)液中LMWOAs的濃度。

1.4 pH值測(cè)定

本研究采用分光光度法測(cè)定pH[36]。以2 mmol·L-1間甲酚紫鈉鹽溶液為指示劑,調(diào)節(jié)指示劑在578和434 nm處的吸光度比值約為1.6。測(cè)定樣品在730,578和434 nm處的吸光度值,再向該樣品中加入80 μL指示劑,混合均勻后再測(cè)定730,578和434 nm處的吸光度值。將測(cè)得的熒光信號(hào)值代入以下公式:

(A1/A2)corr= (A1/A2) -0.08[0.125- 0.147(A1/A2)];

(293≤T/K≤303,30≤S≤37);

計(jì)算即可得到樣品的pH值。該方法的精密度優(yōu)于0.001pH[36]。

1.5 葉綠素a含量測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用熒光分光光度法分析樣品的葉綠素a(Chla)濃度[37]。在設(shè)定的培養(yǎng)天數(shù)取藻類(lèi)培養(yǎng)液4 mL,經(jīng)0.77 μm孔徑玻璃纖維濾膜過(guò)濾(<15 kPa),之后將濾膜對(duì)折放入離心管中,低溫避光條件下用8 mL 90%的丙酮-水溶液萃取24 h,將萃取液放入冷凍離心機(jī)(GTR16-2型,北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司),以4 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min,取離心后的上清液用熒光分析儀(F-4500,株式會(huì)社日立制作所)分析樣品的熒光信號(hào)值。根據(jù)葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出樣品的葉綠素a含量。此方法檢測(cè)限為0.01 μg·L-1[37]。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

本研究中,根據(jù)表1的光暗周期設(shè)計(jì)6個(gè)系列的連續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),每個(gè)系列設(shè)置兩組平行試驗(yàn)。使用SPSS24.0(SPSS Inc.,Chicago,USA)相關(guān)性分析軟件測(cè)試了藻類(lèi)細(xì)胞密度、培養(yǎng)液中LMWOAs、葉綠素a、pH之間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 兩種藻類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線變化特征

兩種藻類(lèi)生長(zhǎng)曲線如圖1所示。對(duì)中肋骨條藻共計(jì)培養(yǎng)25天,滅菌組中肋骨條藻生長(zhǎng)速度較未滅菌組快。滅菌組中肋骨條藻在培養(yǎng)第4天,便進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期,光照充足的中肋骨條藻生長(zhǎng)速度更快,18 h光照組培養(yǎng)液細(xì)胞密度在第12天達(dá)到最大值,為1.50×106個(gè)·mL-1,12、6 h光照組培養(yǎng)液細(xì)胞密度在第14天達(dá)到最大值,分別為1.52×106和1.40×106個(gè)·mL-1。滅菌組不同光照培養(yǎng)條件下中肋骨條藻的衰亡期從培養(yǎng)第14天起幾乎同步開(kāi)始,但較長(zhǎng)光照時(shí)間培養(yǎng)條件下的中肋骨條藻衰亡速度較快。未滅菌培養(yǎng)液中的中肋骨條藻在培養(yǎng)前10天生長(zhǎng)速度一直較緩,培養(yǎng)10天后,18、12 h光照組培養(yǎng)液中的中肋骨條藻開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期,在第14天左右同時(shí)達(dá)到最大密度,均為0.55×106個(gè)·mL-1,其生長(zhǎng)趨勢(shì)變化非常接近。未滅菌條件下6 h光照組的培養(yǎng)液中,中肋骨條藻生長(zhǎng)受到限制,未出現(xiàn)明顯的指數(shù)生長(zhǎng)期?？傮w上,滅菌條件較未滅菌條件對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)有明顯優(yōu)勢(shì),表明培養(yǎng)液中微生物的存在對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)有顯著抑制。

對(duì)赫氏圓石藻共計(jì)培養(yǎng)21天,滅菌組赫氏圓石藻在不同光照條件下生長(zhǎng)有所差異。在培養(yǎng)第4天左右,滅菌組赫氏圓石藻開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期,18、12 h光照組培養(yǎng)液細(xì)胞密度在第17天達(dá)到最高,分別為1.68×106個(gè)·mL-1,1.11×106個(gè)·mL-1,隨后培養(yǎng)液細(xì)胞密度逐漸下降,開(kāi)始進(jìn)入衰亡期。6 h光照組培養(yǎng)液細(xì)胞密度在第14天達(dá)到最大值,為1.28×106個(gè)·mL-1,之后細(xì)胞密度迅速下降?？傮w上,滅菌組赫氏圓石藻接受光照時(shí)間越長(zhǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)越旺盛。未滅菌培養(yǎng)條件下,赫氏圓石藻的生長(zhǎng)速度明顯慢于滅菌組。18 h光照條件下的細(xì)胞在第4天進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期,12 和6 h光照條件下赫氏圓石藻生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致,在第10天左右進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期。三種光照條件下,培養(yǎng)液的赫氏圓石藻均在第17天達(dá)到最大密度,分別為0.76×106,0.68×106和0.65×106個(gè)·mL-1,隨后進(jìn)入衰亡期。整體上赫氏圓石藻接受光照時(shí)間越長(zhǎng),生長(zhǎng)速度越快,最大密度值越高。與滅菌組相比,赫氏圓石藻在含有細(xì)菌等微生物的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)受到明顯抑制。

((a)中肋骨條藻;(b)赫氏圓石藻。(a) Skeletonema costatum; (b) Emiliania huxleyi.)

2.2 兩種藻類(lèi)生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液LMWOAs濃度的變化

本研究所采集的原始海水未檢測(cè)到乳酸。中肋骨條藻生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液乳酸濃度隨培養(yǎng)時(shí)間變化如圖2(a)所示,一直呈上升趨勢(shì)。滅菌條件比未滅菌條件能夠積累更多的乳酸,且接受的光照時(shí)間越長(zhǎng),乳酸積累越多。滅菌組的培養(yǎng)液到中肋骨條藻的衰亡期最多可累積乳酸濃度為5.42 μmol·L-1;而未滅菌組培養(yǎng)液最多只能積累乳酸濃度至2.21 μmol·L-1。赫氏圓石藻在生長(zhǎng)初期和指數(shù)生長(zhǎng)期產(chǎn)生乳酸,在指數(shù)生長(zhǎng)末期或衰亡期將乳酸完全消耗,如圖2(b)所示。滅菌組培養(yǎng)液乳酸濃度最大值6 h光照組>12 h光照組>18 h光照組。在未滅菌組培養(yǎng)液中,12 h光照組培養(yǎng)液在培養(yǎng)6天后,乳酸濃度達(dá)到最大值,為0.62 μmol·L-1,之后乳酸消耗速度也最快,在指數(shù)生長(zhǎng)期第14天之前均全部消耗完,以后的生長(zhǎng)過(guò)程培養(yǎng)液不再積累乳酸;18 h光照組培養(yǎng)液積累乳酸持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng),直到第21天衰亡期乳酸才被完全消耗;6 h光照組赫氏圓石藻產(chǎn)生乳酸很少,培養(yǎng)液乳酸最大濃度出現(xiàn)在第6天為0.15 μmol·L-1,在第14天被完全消耗完,之后培養(yǎng)液便不再積累乳酸。

本研究所采集的原始海水乙酸初始濃度較高,為92.00 μmol·L-1。兩種藻類(lèi)生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液乙酸濃度隨時(shí)間呈現(xiàn)復(fù)雜的變化趨勢(shì),如圖2(c)、2(d)所示。不同生長(zhǎng)階段培養(yǎng)液的乙酸含量均出現(xiàn)較大波動(dòng),乙酸消耗和積累交替發(fā)生。中肋骨條藻滅菌培養(yǎng)液中,18 、12和6 h光照組的乙酸含量波動(dòng)范圍分別為70.10～138.40,43.52～142.00,97.80～123.70 μmol·L-1;未滅菌培養(yǎng)液中乙酸含量波動(dòng)范圍分別為45.00～122.00,43.16～121.50,57.29～116.70 μmol·L-1。赫氏圓石藻滅菌培養(yǎng)液中,3種光照條件下,前10天培養(yǎng)液乙酸濃度呈升高趨勢(shì),在隨后的培養(yǎng)過(guò)程中乙酸濃度呈明顯波動(dòng),整體上滅菌培養(yǎng)液18,12,6 h光照組的乙酸波動(dòng)范圍分別為96.52～145.90,92.95～156.70和95.95～176.82 μmol·L-1;到衰亡期末,18、6 h光照組培養(yǎng)液中乙酸含量高于初始值,12 h光照組乙酸含量比初始值略低。在未滅菌培養(yǎng)組,赫氏圓石藻18,12,6 h光照組培養(yǎng)液乙酸變化范圍分別為93.77～141.00,83.79～157.80,99.00～172.78 μmol·L-1,到衰亡期,3種光照條件下培養(yǎng)液中乙酸濃度均高于初始值。

((a),(c),(e)中肋骨條藻;(b),(d),(f)赫氏圓石藻。(a), (c), (e) Skeletonema costatum; (b), (d), (f) Emiliania huxleyi.)

本研究所采集的原始海水中不含甲酸。中肋骨條藻在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生少量甲酸,到培養(yǎng)后期甲酸均被消耗,如圖2(e)所示。中肋骨條藻滅菌培養(yǎng)過(guò)程中,6 h光照組培養(yǎng)液在其生長(zhǎng)初期最早出現(xiàn)甲酸積累,于第6天達(dá)到最高值0.47 μmol·L-1,在衰亡期前被全部消耗;18、12 h光照組培養(yǎng)液在第6天開(kāi)始積累甲酸,18 h光照條件下培養(yǎng)液中的甲酸于第18天濃度達(dá)到最高值1.69 μmol·L-1,于第21天被完全消耗,12 h光照條件下培養(yǎng)液甲酸含量于第10天達(dá)到最高值0.22 μmol·L-1,到第14天甲酸均被消耗。整體上,中肋骨條藻未滅菌組培養(yǎng)液中積累的甲酸少于滅菌組,未滅菌組中肋骨條藻培養(yǎng)液中12、6 h光照條件不積累甲酸,18 h光照組培養(yǎng)液出現(xiàn)少量甲酸積累,在第10天其濃度達(dá)到最高值0.26 μmol·L-1。赫氏圓石藻生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液中積累的甲酸量明顯高于中肋骨條藻,且在生長(zhǎng)過(guò)程的各個(gè)階段都出現(xiàn)積累。在滅菌培養(yǎng)液中,18、12 h光照組培養(yǎng)液出現(xiàn)甲酸積累的時(shí)間較早,在第10天的培養(yǎng)液中甲酸濃度達(dá)到最大,分別為5.58和8.77 μmol·L-1;6 h光照組培養(yǎng)液在培養(yǎng)第17天甲酸積累最多,濃度高達(dá)8.26 μmol·L-1。滅菌組中不同光照條件下的赫氏圓石藻在衰亡期到來(lái)之前或在衰亡期均能夠消耗掉大部分甲酸。未滅菌組中,18和12 h光照組的培養(yǎng)液均在第17天積累甲酸至最高濃度,分別為8.49和5.83 μmol·L-1;6 h光照組培養(yǎng)液甲酸積累較少,在第10天積累量最高僅為2.70 μmol·L-1。

由于原始海水不含乳酸,甲酸,所以原始海水LMWOAs總濃度即為原始海水乙酸濃度92.00 μmol·L-1。兩種藻類(lèi)培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液總LMWOAs濃度變化如圖3所示。在滅菌18和12 h光照組中,中肋骨條藻培養(yǎng)液總LMWOAs濃度均在第18天達(dá)到最值,分別為143.67和145.11 μmol·L-1,6 h光照組整個(gè)培養(yǎng)周期培養(yǎng)液中總LMWOAs濃度均高于海水初始濃度,在第10天達(dá)到最高值124.50 μmol·L-1。未滅菌培養(yǎng)液中,18和12 h光照組其總LMWOAs濃度范圍分別為46.32～123.03 、43.38～121.71 μmol·L-1;6 h光照組培養(yǎng)液總LMWOAs最高濃度出現(xiàn)在第18天,為116.85 μmol·L-1。整體上,赫氏圓石藻無(wú)論在滅菌還是未滅菌培養(yǎng)過(guò)程中,培養(yǎng)液中總LMWOAs濃度均高于原始海水中總LMWOAs濃度。赫氏圓石藻在滅菌條件下,18、12和6 h光照組培養(yǎng)液總LMWOAs濃度最大值分別為151.82、165.66和185.39 μmol·L-1;在未滅菌條件下,18,12和6 h光照組培養(yǎng)液中總LMWOAs濃度最大值分別為147.22、163.63和175.60 μmol·L-1。

((a)中肋骨條藻;(b)赫氏圓石藻。(a) Skeletonema costatum; (b) Emiliania huxleyi.)

2.3 兩種藻類(lèi)生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液pH值的變化

本研究所使用的原始海水初始pH值為8.17。中肋骨條藻生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液pH值變化如圖4(a)所示。在指數(shù)生長(zhǎng)期滅菌培養(yǎng)液中的pH值呈現(xiàn)上升趨勢(shì),衰亡期pH值呈下降趨勢(shì)。未滅菌組培養(yǎng)液中的pH值變化較為復(fù)雜,不斷波動(dòng),到衰亡期,12 和6 h光照組培養(yǎng)液的pH值隨培養(yǎng)時(shí)間均呈先上升后下降趨勢(shì),18 h光照組培養(yǎng)液pH值有所上升。整體上,中肋骨條藻各個(gè)生長(zhǎng)階段培養(yǎng)液的pH值在滅菌和未滅菌狀態(tài)均高于海水初始pH值。

((a)中肋骨條藻;(b)赫氏圓石藻。(a) Skeletonema costatum; (b) Emiliania huxleyi.)

赫氏圓石藻生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液pH值變化如圖4(b)所示。滅菌組培養(yǎng)液中pH值在不同光照條件下均呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì);到培養(yǎng)結(jié)束,受18 h光照的培養(yǎng)液pH值最高,為8.40,其他兩組培養(yǎng)液pH值接近,分別為8.36和8.37。未滅菌組中,18 h光照組培養(yǎng)液pH值隨培養(yǎng)時(shí)間波動(dòng)上升,12 h、6 h光照組培養(yǎng)液中的pH值在指數(shù)生長(zhǎng)期呈上升趨勢(shì),至衰亡期趨于穩(wěn)定;培養(yǎng)結(jié)束,18 h光照組培養(yǎng)液pH值最高,為8.43,其余兩組培養(yǎng)液pH值分別為8.35和8.34。整體上,滅菌和未滅菌培養(yǎng)液的pH值總體上呈上升趨勢(shì),且均在18 h光照組中達(dá)到最高。

2.4 兩種藻類(lèi)生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液Chl a濃度的變化

中肋骨條藻在兩種培養(yǎng)液中Chla濃度隨培養(yǎng)時(shí)間變化曲線如圖5(a)所示。Chla濃度在兩種培養(yǎng)液中均隨培養(yǎng)時(shí)間呈現(xiàn)上升趨勢(shì),且滅菌組較未滅菌組積累更快。滅菌組與未滅菌組3種光照條件下的Chla積累速度均為:12 h光照組>18 h光照組>6 h光照組。中肋骨條藻Chla濃度隨時(shí)間變化與細(xì)胞密度明顯不同,Chla濃度在中肋骨條藻衰亡期仍然呈現(xiàn)上升趨勢(shì),表明單個(gè)細(xì)胞的Chla含量在不斷上升。

((a)中肋骨條藻;(b)赫氏圓石藻。(a) Skeletonema costatum; (b) Emiliania huxleyi.)

兩種赫氏圓石藻培養(yǎng)液中Chla濃度隨培養(yǎng)時(shí)間變化曲線如圖5(b)所示。滅菌組培養(yǎng)液中Chla含量整體上高于未滅菌組,且呈現(xiàn)接受光照時(shí)間越長(zhǎng),Chla濃度越高的特征。赫氏圓石藻滅菌和未滅菌培養(yǎng)液中的Chla濃度均呈現(xiàn)在指數(shù)生長(zhǎng)期逐漸增長(zhǎng),衰亡期呈逐漸下降的趨勢(shì),這與赫氏圓石藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線較為相似。

3 討論

未滅菌環(huán)境更接近中肋骨條藻和赫氏圓石藻在海洋中的生長(zhǎng)環(huán)境,在未滅菌條件下,至培養(yǎng)期結(jié)束,三種光照條件下兩種藻培養(yǎng)液中的總LMWOAs均有所積累,因此這兩種藻生長(zhǎng)過(guò)程釋放的LMWOAs均是海洋中LMWOAs的來(lái)源。

兩種微藻釋放LMWOAs的狀況與其生長(zhǎng)階段密切相關(guān),在藻類(lèi)生長(zhǎng)過(guò)程中,有機(jī)酸的產(chǎn)生與消耗是同時(shí)發(fā)生的。前期研究表明,一般藻類(lèi)在生長(zhǎng)初期,藻類(lèi)細(xì)胞更傾向于釋放易溶解、易利用的小分子物質(zhì),如氨基酸、小分子糖類(lèi)和有機(jī)酸等[4],使有機(jī)酸的生產(chǎn)大于消耗,培養(yǎng)液LMWOAs的濃度呈增加趨勢(shì)。生長(zhǎng)后期至衰亡期,藻細(xì)胞多分泌大分子物質(zhì),如多糖,蛋白質(zhì)等[39],這些大分子物質(zhì)被生物體作為碳源和能量來(lái)源分解利用,也能成為海水有機(jī)酸的重要來(lái)源。另一方面,與微生物共存條件下,藻類(lèi)對(duì)有機(jī)酸的產(chǎn)生和利用受到多種生物與化學(xué)過(guò)程的控制,加之藻類(lèi)產(chǎn)生的一些物質(zhì)可能存在趨化性[40],導(dǎo)致培養(yǎng)體系中LMWOAs的濃度呈現(xiàn)復(fù)雜的變化趨勢(shì)。

3.1 影響中肋骨條藻培養(yǎng)液中LMWOAs濃度的因素

本研究中,滅菌和未滅菌培養(yǎng)條件下中肋骨條藻的生長(zhǎng)曲線有明顯差異,整體上,滅菌培養(yǎng)的中肋骨條藻在生長(zhǎng)速度和積累LMWOAs方面更有優(yōu)勢(shì)。隨著中肋骨條藻的生長(zhǎng),乳酸在培養(yǎng)液中逐漸積累,表明其生長(zhǎng)過(guò)程會(huì)持續(xù)產(chǎn)生乳酸并釋放到培養(yǎng)液中。滅菌組乳酸的積累量顯著高于未滅菌組,表明培養(yǎng)液中的細(xì)菌等微生物能夠以乳酸為碳源進(jìn)行新陳代謝,消耗乳酸,細(xì)菌等微生物對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的抑制和對(duì)乳酸的消耗是造成這種差異的重要原因。此外,即使在中肋骨條藻生長(zhǎng)的衰亡期,滅菌和未滅菌培養(yǎng)體系乳酸濃度仍然繼續(xù)增加,表明中肋骨條藻可能無(wú)法以乳酸為碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)。

中肋骨條藻滅菌和未滅菌培養(yǎng)液中的乙酸濃度隨時(shí)間均呈現(xiàn)出較為復(fù)雜的變化,與藻類(lèi)和水體中細(xì)菌存在的復(fù)雜相互作用有關(guān)[41]。細(xì)菌可以吸收利用藻類(lèi)分泌的有機(jī)物質(zhì),并為藻類(lèi)提供必要的維生素等促生長(zhǎng)因子,或通過(guò)再礦化作用溶解有機(jī)質(zhì)[42],水體中的微生物能夠利用有機(jī)物的礦化產(chǎn)物生存;水體中多種細(xì)菌通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等方式抑制藻類(lèi)生長(zhǎng),這些相互作用有助于保持水體生態(tài)系統(tǒng)的平衡[43]。本研究的結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)下,由于生長(zhǎng)空間有限,培養(yǎng)液中的微藻和細(xì)菌等微生物都會(huì)利用其中的營(yíng)養(yǎng)鹽、微量元素等進(jìn)行自身的生命活動(dòng),形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。與滅菌條件相比,未滅菌條件下中肋骨條藻生長(zhǎng)受到一定程度的抑制,降低了其產(chǎn)生、釋放LMWOAs的能力,從而導(dǎo)致未滅菌組培養(yǎng)液LMWOAs積累量低于滅菌組。

表3 中肋骨條藻培養(yǎng)液樣品中各參數(shù)的相關(guān)性分析

3.2 影響赫氏圓石藻培養(yǎng)液中LMWOAs的因素

赫氏圓石藻的生長(zhǎng)曲線符合藻類(lèi)光照時(shí)間越長(zhǎng),生長(zhǎng)速度越快,密度最大值越高的特點(diǎn)。與中肋骨條藻相似,水體中的細(xì)菌和赫氏圓石藻同樣存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。赫氏圓石藻對(duì)外部變化響應(yīng)較為靈敏,多數(shù)研究認(rèn)為,海洋酸化會(huì)使此類(lèi)藻的光合作用增強(qiáng)[45]。在如今海洋趨向酸化的情況下,藻類(lèi)光合作用的增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致其大量繁殖,從而向海水中釋放LMWOAs,影響海水中LMWOAs的含量。

赫氏圓石藻生長(zhǎng)中會(huì)產(chǎn)生少量乳酸,在衰亡期將其全部消耗,表明乳酸很有可能是赫氏圓石藻生長(zhǎng)過(guò)程中的碳源。赫氏圓石藻培養(yǎng)液中LMWOAs總濃度與3種LMWOAs濃度均為顯著正相關(guān),乙酸與總LMWOAs的相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.995,說(shuō)明二者之間關(guān)系非常密切,這種密切關(guān)系與乙酸在總LMWOAs中占較大比例有關(guān)。赫氏圓石藻產(chǎn)生和消耗乙酸的情況比較復(fù)雜,衰亡期培養(yǎng)液中乙酸的含量高于生長(zhǎng)初期。滅菌和未滅菌條件下,均在6 h光照組培養(yǎng)液乙酸含量最高,短時(shí)間光照,長(zhǎng)時(shí)間的黑暗環(huán)境有利于培養(yǎng)液中乙酸積累,表明赫氏圓石藻的呼吸作用有利于乙酸的產(chǎn)生。此外,滅菌組和未滅菌組的培養(yǎng)液中乳酸和乙酸濃度顯著相關(guān)(P<0.05),表明二者在赫氏圓石藻的新陳代謝過(guò)程中可能存在某種相互轉(zhuǎn)化機(jī)制。赫氏圓石藻在生長(zhǎng)初期、指數(shù)生長(zhǎng)期都產(chǎn)生一定量的甲酸,在衰亡期消耗部分甲酸,培養(yǎng)液甲酸濃度與培養(yǎng)天數(shù)存在顯著相關(guān)(P<0.05),其產(chǎn)生消耗甲酸的機(jī)理需要進(jìn)一步研究。赫氏圓石藻培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液的pH值與LMWOAs總濃度顯著相關(guān)(P<0.05),與甲酸濃度、Chla濃度、細(xì)胞密度和培養(yǎng)天數(shù)也顯著相關(guān)(P<0.01)。隨著藻細(xì)胞密度、Chla含量增加,光合作用增強(qiáng)等生化過(guò)程消耗更多CO2等物質(zhì),培養(yǎng)液的pH值升高。在赫氏圓石藻的培養(yǎng)周期里,總體上LMWOAs的積累大于消耗,LMWOAs總濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而升高。赫氏圓石藻在滅菌和未滅菌的培養(yǎng)液中均能積累一定的甲酸,也能同時(shí)產(chǎn)生乳酸,但這些乳酸會(huì)被完全消耗;中肋骨條藻與之相反,在滅菌和未滅菌的培養(yǎng)液中出現(xiàn)持續(xù)的乳酸積累,但只產(chǎn)生少量甲酸。表明這兩種藻在生產(chǎn)LMWOAs的機(jī)制上有一定的差異。

表4 赫氏圓石藻培養(yǎng)液樣品中各參數(shù)的相關(guān)性分析

4 結(jié)論

本研究以海洋中具有代表性的中肋骨條藻和赫氏圓石藻為研究對(duì)象,在不同的培養(yǎng)條件下考察藻類(lèi)生長(zhǎng)過(guò)程不同階段培養(yǎng)液中的LMWOAs濃度變化,探究了藻類(lèi)生長(zhǎng)與海水LMWOAs的關(guān)系。

(1) 中肋骨條藻和赫氏圓石藻生長(zhǎng)過(guò)程均能釋放乳酸、乙酸、甲酸3種LMWOAs,且生長(zhǎng)過(guò)程中總LMWOAs的產(chǎn)生量大于消耗量,這兩種藻類(lèi)是海水中LMWOAs的重要來(lái)源。

(2) 在中肋骨條藻生長(zhǎng)周期中,培養(yǎng)液中乳酸含量持續(xù)增加,乙酸含量呈波動(dòng)趨勢(shì),甲酸產(chǎn)量較低并最終完全消耗。赫氏圓石藻在生長(zhǎng)周期中產(chǎn)生少量乳酸,至衰亡期被全部消耗,培養(yǎng)液中乙酸含量呈波動(dòng)趨勢(shì),甲酸含量先升高后下降,最終出現(xiàn)少量積累。滅菌環(huán)境均有利于中肋骨條藻和赫氏圓石藻LMWOAs的積累。

(3) 兩種藻類(lèi)生長(zhǎng)過(guò)程培養(yǎng)液中的pH值和總LMWOAs濃度、細(xì)胞密度均呈正相關(guān),它們的生長(zhǎng)過(guò)程通過(guò)產(chǎn)生LMWOAs和消耗無(wú)機(jī)碳影響海水pH值。