葉琦

摘 要：山櫻花是世界著名的觀花類植物，花色是其最重要的觀賞特征。為探究影響山櫻花品種間花色差異的代謝通路及關(guān)鍵代謝產(chǎn)物變化，該文利用LC－MS/MS技術(shù)對白色、綠色和粉色的山櫻花品種進行花青素靶向代謝組學(xué)比較分析。結(jié)果表明：（1）共檢測到42種花青素物質(zhì)，主要包含矮牽牛素、飛燕草素、黃酮類化合物、錦葵色素、芍藥花素、矢車菊素、天竺葵素和原花青素8種物質(zhì)。（2）差異代謝花青素25種，包括11種下調(diào)、14種上調(diào)，其中有7種花青素在粉色花瓣中顯著富集。（3）KEGG通路注釋發(fā)現(xiàn)差異代謝物在花青素生物合成通路中顯著富集，結(jié)合聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)矮牽牛素－3－O－葡萄糖苷是山櫻花品種間花色差異產(chǎn)生的關(guān)鍵代謝物。該研究揭示了山櫻花花色差異的代謝機理，為后續(xù)山櫻花花色分子調(diào)控機制研究提供了一定的理論依據(jù)，也為新品種花色改良和選育提供了一定的科學(xué)參考。

關(guān)鍵詞： 山櫻花， 花色， 代謝組， 花青素， 代謝通路

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：1000－3142（2023）04－0732－09

Abstract：Prunus serrulata is a famous ornamental plant worldwide. Flower color is the most prominent trait of cherry. In order to analyze the different pathways and key metabolite change in flower color among P. serrulata cultivars， we conducted a comparative analysis of anthocyanin metabolomics among white， green， and pinkP. serrulata cultivars using LC－MS/MS. The results were as follows： （1） A total of 42 anthocyanins were detected， mainly including petunidin， delphinidin， flavonoids， malvidin， peonidin， cyanidin， pelargonidin， and procyanidins. （2） A total of 25 anthocyanins were identified as differential metabolites， including 11 down－regulated and 14 up－regulated ones， in which seven anthocyanins with higher abundance in the pink flower. （3） KEGG pathway annotation showed that the differential metabolites were significantly enriched in the anthocyanin biosynthesis pathway; the results of clustering showed that petunidin－3－O－glucoside was the key metabolite for flower color differences ofP. serrulata cultivars. This study provides important insights into the metabolic mechanism offlower color differences in P. serrulata and a reference for novel color cultivars and variety breeding.

Key words： Prunus serrulata， flowering color， metabolome， anthocyanins， metabolic pathway

花色對植物具有重要的生物學(xué)意義，是園林景觀中衡量樹種價值的重要觀賞性狀，也是自然進化過程中有適應(yīng)意義的表型（戴思蘭和洪艷，2016）。李想等（2019）對植物花色成因分析后發(fā)現(xiàn)植物色素種類和含量是影響花色的主要因素。植物色素主要分為類黃酮、類胡蘿卜素和生物堿三大類。其中，花青素（anthocyanin）屬于類黃酮（flavonoids）化合物，是一類重要的植物次級代謝物，具有強抗氧化性和其他促進健康的功能（He & Giusti， 2010），是木本植物呈色多樣性的重要原因?；ㄇ嗨刂饕譃?大類，包括芍藥色素、矢車菊色素、飛燕草素、芍藥色素、矮牽牛素和錦葵色素等。櫻桃（Prunus pseudocerasus）（Guo et al.， 2018）、玫瑰（Rosa rugosa）（Sheng et al.， 2018）和血紅杜鵑（Rhododendron sanguineum）（Ye et al.， 2021）等物種的花色均被證實與花青素有關(guān)。Fiehn（2002）通過代謝物的動態(tài)變化趨勢來明確代謝物與生理變化之間的對應(yīng)關(guān)系。其中，靶向代謝組學(xué)基于已知的標準品檢測，檢測數(shù)據(jù)準確且可靠性高，被廣泛應(yīng)用于植物花色及花青素相關(guān)研究中（Yi et al.， 2021）。Yue等（2019）通過代謝組學(xué)研究長筒石蒜花不同生長發(fā)育階段花色形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Jiao等（2020）應(yīng)用代謝組學(xué)來闡明煙草中粉花突變體的具體形成機制。近年來，有關(guān)花瓣的呈色機制一直是生物學(xué)研究的熱點，植物色素種類和含量是顏色多樣化的重要因素（Fu et al.， 2021; Lu et al.， 2021）。

山櫻花（Prunus serrulata）是櫻屬植物在中國分布最廣泛的種，在華中、華東、華北、華西和東北遼寧均有分布，朝鮮半島和日本也有記錄（Iwatsuki， 2001; Li & Bruce， 2003; 王賢榮，2014）。該物種對不同的地?zé)釛l件適應(yīng)性強，花朵為單瓣的白色或淡粉色（劉志雄等，2010）。山櫻花各部分性狀變化較大，花色變異豐富，是許多觀賞類櫻花品種雜交培育的親本，也是非常重要的觀花類種質(zhì)資源（Yi et al.， 2020）。Ma等（2009）以山櫻花作為良好的親本，開發(fā)和選育了多種天然和人工雜交品種，其種下栽培品種據(jù)統(tǒng)計中國共有45個（Yi et al.， 2020）。目前，關(guān)于山櫻花的研究主要集中在系統(tǒng)分類（Cho & Kim， 2019; Zhu et al.， 2019）、親緣地理（伊賢貴，2018）以及離體組織培養(yǎng)（李蒙，2013）等方面?；ㄉ菣鸦ǖ闹匾^賞性狀，而關(guān)于山櫻花品種花色變異相關(guān)的代謝途徑及調(diào)控機制尚未見有人報道。

山櫻花種系下的品種‘普賢象（Prunus serrulata ‘Albo－rosea）、‘郁金（P. serrulata ‘Grandiflora）和‘永源寺（P. serrulata ‘Eigeng）雖均為重瓣品種，但花色差異較大。朱淑霞（2020）通過SSR指紋圖譜分析，證明3個品種在分子水平上有較近的親緣關(guān)系。本文以粉花品種‘普賢象和綠花品種‘郁金為研究對象，以白花品種‘永源寺為對照，通過靶向代謝組學(xué)探究不同花色的差異呈色物質(zhì)，擬探討以下科學(xué)問題：（1）不同花色的山櫻花品種主要包含的花青素類代謝物；（2）通過對品種間差異顯著的代謝物及差異代謝通路進行篩選，分析品種間花色差異產(chǎn)生的可能原因。本研究結(jié)果可為后期櫻花品種花色分子調(diào)控的相關(guān)研究提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品選定為白色櫻花‘永源寺（Prunus serrulata ‘Eigeng， white flower， WF）、綠色櫻花‘郁金（P. serrulata ‘Grandiflora， green flower， GF）和粉色櫻花‘普賢象（P. serrulata ‘Albo－rosea， pink flower， PF）?；ò瓴牧喜勺园不帐∪房h龍山櫻花園資源圃（118°02′82″ E、32°04′7741″ N）。參照李玉闊（2020）的方法取樣，選擇生長勢一致，無病害管理統(tǒng)一的櫻花樹3棵（每個品種各1棵），在2021年3月采集盛花期的花瓣樣品（圖1）。樣品采集時從樹體東、西、南、北4個方位各采集5 g花瓣樣品后混勻，每個品種采集３個生物學(xué)重復(fù)用于代謝組學(xué)測序分析。取樣后將花瓣樣品裝入錫箔紙中并在液氮中處理30 min，隨后放置于-80 ℃的冰箱保存，用于后續(xù)靶向代謝組學(xué)分析。

1.2 花瓣表型及生理指標分析

參考向秋虹（2019）的方法并略做修改，取3個品種的花瓣進行徒手切片觀察。用單刀片切取花被片基部薄片置于超純水中，夾取薄片放置于載玻片上制備成臨時裝片，在光學(xué)顯微鏡下觀察花瓣表皮細胞色素分布情況。

葉綠素提取參考Li等（2021）的方法并略做修改，稱取0.1 g鮮樣，放入15 mL的95%乙醇中，黑暗避光條件下浸提過夜，直至材料全部退綠，得到葉綠素提取液。使用可見分光光度計測定提取液在663 nm和645 nm的波長下的吸光值。葉綠素含量計算公式：

葉綠素含量（mg·g－1）=Ca+Cb；Ca=13.95×A665-6.88×A649；Cb=24.96×A649-7.32×A665。

花青素提取參考Li等（2021）的方法并略作修改，稱取0.1 g樣品，加入600 μL的1% HCl－甲醇溶液（1%HCl，m/V）在4 ℃中提取2 h。之后加入400 μL蒸餾水和氯仿，12 000 g離心10 min，取上清液，測定A530和A657的吸光值。

花青素含量（mg·g－1）= C×提取總量/樣品鮮重×1 000，式中C=A530-0.24×A657。

1.3 樣品制備及代謝物提取

基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（UPLC－MS/MS）進行靶向代謝組學(xué)的研究。樣品真空冷凍干燥，研磨成粉末（30 Hz， 1.5 min），-80 ℃保存。取50 mg粉末稱重，用0.5 mL甲醇/水/鹽酸（500∶500∶1，V/V/V）提取。隨后將提取液渦旋5 min，超聲5 min，在4 ℃下12 000 g離心3 min。在相同條件下重復(fù)上述步驟再次提取殘渣。收集上清液，經(jīng)微孔膜過濾器（0.22 μm，Anpel）過濾樣品，后續(xù)使用LC－MS/MS（SCIEX，QTRAP 6500+）進行分析?；旌蠘藴嗜芤鹤鳛橘|(zhì)控樣本，每隔10個檢測分析插入1個質(zhì)控樣本用于檢測儀器穩(wěn)定性。

1.4 靶向花青素代謝組測定

花青素提取基于Ferrars等（2014）的方法。數(shù)據(jù)采集儀器包括使用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）和串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）。液相條件：（1）ACQUITY BEH C18 1.7 μm，2.1 mm×100 mm的色譜柱；（2）流動A相為超純水（0.1%甲酸）；流動B相為甲醇（0.1%甲酸）；（3）洗脫梯度設(shè)定為0～6 min 5% B相，6～12 min增至50%，12～14 min增至95%，保持2 min，14 min降至5%，平衡2 min；（4）流速0.35 mL每分鐘；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）溫度550 °C，正離子模式下質(zhì)譜電壓5 500 V，氣簾氣（curtain gas，CUR）35 psi。在Q－Trap 6500+中，每個離子對是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）進行掃描檢測。

1.5 數(shù)據(jù)分析

基于標準品構(gòu)建的MWDB（metware database）數(shù)據(jù)庫，對質(zhì)譜檢測得到的數(shù)據(jù)進行定性分析。相對定量分析利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）分析，每個色譜峰的峰面積（area）代表對應(yīng)物質(zhì)的相對含量，代入線性方程和計算公式，采用MultiQuant 3.0.3軟件，最終得到所有樣本中待測物的定性定量分析結(jié)果。使用R（https：//www.r－project.org/），對不同樣本間代謝物的積累模式進行聚類分析（HCA）及主成分分析（PCA）。計算差異倍數(shù)值（fold_change）及P值，選取P值≤0.5的代謝物為差異代謝物，并將差異代謝物映射到KEGG數(shù)據(jù)庫中進一步富集用于后續(xù)分析。計算公式：

代謝物含量（μg·g－1）= c×V/1 000 000/m。

式中：c為樣本中積分峰面積代入標準曲線得到的濃度值（ng·mL－1）；V為提取時所用溶液的體積（μL）；m為稱取的樣本質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 花瓣表型及生理指標分析

永源寺、普賢象和郁金樣品盛花期花瓣形態(tài)如圖1所示，均為重瓣品種，花朵完全開展且表觀色彩差異較大。通過20倍光學(xué)顯微鏡觀察花瓣上表皮的顯微結(jié)構(gòu)，白色花瓣上表皮無明顯色素沉積（圖1：D）；而粉色花瓣上表皮細胞呈現(xiàn)粉紫色（圖1：E），可能是花青素的色素沉淀；綠色花瓣上表皮呈現(xiàn)綠色（圖1：F）。進一步測定品種葉綠素含量后發(fā)現(xiàn)，郁金中的葉綠素含量遠高于其他兩個品種（圖2）， 郁金呈現(xiàn)綠色的主要原因是葉綠素沉積。這表明花青素在植物花色中起到關(guān)鍵性作用，結(jié)合已有的表型和生理指標，選定花青素進行下一步的靶向代謝組學(xué)檢測。

2.2 主成分分析 （principal component analysis，PCA）

圖3結(jié)果表明，組間代謝物分離趨勢明顯且組內(nèi)生物重復(fù)性好，與表型結(jié)果一致，可用于后續(xù)差異代謝物的分析。其中，在第一主成分（PC1）上，PF與其余兩組發(fā)生明顯分離，表明粉紅色品種存在顯著的差異代謝物。同時，在第二主成分（PC2）上，WF發(fā)生明顯分離，表明WF與其他兩組代謝表達譜差異大，可以作為對照組進行后續(xù)差異表達分析。

2.3 代謝物分析

為檢測不同品種中花青素的變化規(guī)律，通過UPLC－MS平臺靶向測定樣品中的花青素，每組進行3次生物學(xué)重復(fù)，并對其進行定性定量分析。共檢測到42種花青素化合物，其中包括7種矮牽牛素（petunidin）、6種飛燕草素（delphinidin）、6種黃酮類化合物（flavonoid）、1種錦葵色素（malvidin）、4種芍藥花素（peonidin）、8種矢車菊素（cyanidin）、7種天竺葵素（pelargonidin）和3種原花青素（procyanidins）。對代謝物進行聚類（圖4），顯示出樣品組內(nèi)生物學(xué)重復(fù)性較好，表達趨勢一致。組間整體分為3簇，其中簇1在PF中的表達量最高，簇2在GF中表達量最高，色塊分布有顯著差異，表明樣品存在顯著差異。

2.4 差異代謝物分析

基于P值≤0.5篩選差異花青素代謝物（different anthocyanin metabolites， DAMs），差異倍數(shù)（fold_change）表示樣品間代謝物表達量的比值。WF和PF間存在25種DAMs（11種上調(diào)/14種下調(diào)），WF和GF間存在19種DAMs（8種上調(diào)/11種下調(diào)），GF和PF共有差異代謝物25種（11種上調(diào)/14種下調(diào)）。組間兩兩比較后，篩選出11種共有的DAMs（圖5：A），分別是矢車菊素－3，5－O－二葡萄糖苷（cyanidin－3，5－O－diglucoside）、矢車菊素－3－O－阿拉伯糖苷（cyanidin－3－O－arabinoside）、矢車菊素－3－O－葡萄糖苷（cyanidin－3－O－glucoside）、矢車菊素－3－O－蕓香糖苷（cyanidin－3－O－rutinoside）、矢車菊素－3－O－桑布雙糖苷（cyanidin－3－O－sambubioside）、矢車菊素－3－O－木糖苷（cyanidin－3－O－xyloside）、天竺葵素－3－O－蕓香糖苷（pelargonidin－3－O－rutinoside）、芍藥花素－3－O－葡萄糖苷（peonidin－3－O－glucoside）、飛燕草素－3－O－半乳糖苷（delphi－nidin－3－O－galactoside）、飛燕草素－3－O－槐糖苷（delp－h(huán)inidin－3－O－sophoroside）和柚皮素（naringenin）。

結(jié)合具體樣品的分組情況比較各組中代謝物定量信息發(fā)生的差異倍數(shù)變化，選取前20種代謝物繪制差異代謝條形圖，由圖5：B可知，在WF和PF的差異比較中，最顯著上調(diào)的代謝物是天竺葵素－3－O－葡萄糖苷（pelargonidin－3－O－glucoside）；在WF和GF的差異比較中，顯著上調(diào)的代謝物為矮牽牛素－3－O－葡萄糖苷（petunidin－3－O－glucoside），兩組的最顯著下調(diào)的代謝物均為柚皮素（naringenin）；在PF和GF的比較組中，顯著上調(diào)的代謝物是矢車菊素－3－O－桑布雙糖苷，顯著下調(diào)的代謝物是矮牽牛素－3－O－葡萄糖苷，該代謝物在PF中顯著上調(diào)，可能是花瓣呈現(xiàn)粉紅色的重要差異代謝物。

2.5 代謝通路分析

利用KEGG 數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進行注釋并展示。將篩選出的差異代謝物進一步映射到數(shù)據(jù)庫中并繪制通路圖（圖6）。42種DAMs被注釋到7個代謝通路上，分別是花青素生物合成（anthocyanin biosynthesis）、異類黃酮生物合成（isoflavonoid biosynthesis）、類黃酮生物合成（flavonoid biosynthesis）、黃酮和黃酮醇生物合成（flavone and flavonol biosynthesis）、次級代謝產(chǎn)物的生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、生物代謝（metabolic pathways）、苯丙烷生物合成（biosynthesis of phenylpropanoids）等通路。WF和PF組間有14種差異代謝物在花青素生物合成通路中顯著富集（占比77.78%），WF/GF和PF/GF各有11種和13種DAMs在花青素生物合成通路中顯著富集（占比91.6%和76.47%），從圖6可以看出花青素類物質(zhì)在粉花和綠花中合成顯著上調(diào)，進一步證明了花青素在櫻花花色的合成和積累中的重要作用。

3 討論與結(jié)論

花青素含量差異對植物色澤有直接影響，本研究基于代謝組學(xué)技術(shù)，對山櫻花不同品種花瓣中的花青素類物質(zhì)進行了定性定量分析。研究表明，矢車菊素及其衍生物廣泛作用于植物紅色花瓣中（Khoo et al.， 2017），Liu等（2016）對香雪蘭花瓣中的花色苷進行測定后發(fā)現(xiàn)，紅色系品種中的主要化合物為矢車菊素；同時杜鵑花屬內(nèi)30種不同花色的代謝物研究也表明，紅色品種中矢車菊素的含量最高（Du et al.， 2016）。本研究針對3個山櫻花品種共檢測到42種花青素類物質(zhì)，其中WF、GF、PF分別檢測出35、40、34種代謝物，在WF和GF中，均檢測到了矢車菊素、天竺葵素和矮牽牛素等7大類花青素物質(zhì)，PF中，未檢測錦葵色素。在PF中，矢車菊素－3－O－蕓香糖苷含量最高；在GF中，矮牽牛素－3－（6－O－p－對香豆酰）－葡萄糖苷 ［petunidin－3－O－（6－O－p－coumaroyl）－glucoside］含量最高；而在粉色櫻花品種中，矢車菊素含量最高，與前人在其他物種中的研究結(jié)果一致，表明矢車菊素在粉色花瓣呈色中起到重要作用。

為進一步探究山櫻花不同花色形成的差異代謝物，本研究通過P值篩選得到11種關(guān)鍵差異代謝物，包含6種矢車菊素類物質(zhì)，2種飛燕草類物質(zhì)，1種天竺葵素和芍藥色素；矢車菊類物質(zhì)進一步通過甲基化形成了其衍生物矮牽牛素，矮牽牛素－3－O－葡萄糖苷更是在粉色花瓣中顯著上調(diào)，可能是呈色的關(guān)鍵代謝物。Wang等（2021）在紅花花色代謝機制的研究和Li等（2020）關(guān)于蘭花花瓣呈色差異的研究中均發(fā)現(xiàn)該類色素在差異花色品種中顯著上調(diào)，而紫花苜蓿白花品種的矮牽牛素呈現(xiàn)顯著性下調(diào)的趨勢（潘新怡，2021），證明該類色素在花色素合成過程中是一個重要的代謝分支，也證實本研究的代謝組學(xué)結(jié)果有一定的合理性。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序發(fā)現(xiàn)，植物中的PAL、CHS和CHI等相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達量會隨著植物花色變化產(chǎn)生差異。其中，花青苷合成酶基因（ANS）是花青素合成途徑下游的關(guān)鍵酶基因，雖然目前該基因在海棠（Malus spectabilis）（田佶等，2010）、草莓（Fragaria ananassa）（Almeida et al.， 2007）和桃（Prunus persica）（Ye et al.， 2017）等植物中成功分離，并證實其表達量高低是影響植物花色的重要因素，但尚未在山櫻花品種中得到驗證。不同物種間的色素調(diào)控機制和結(jié)構(gòu)基因具有特異性，并且通路間存在相互影響及競爭關(guān)系，為探明山櫻花品種的花青素類物質(zhì)和下游結(jié)構(gòu)基因之間的關(guān)聯(lián)性，本研究后續(xù)仍需在分子層面進一步探索。

研究表明，花青素合成通路對植物花色的形成有重要作用，分析編碼花青素合成的結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子是當下的研究熱點（吳雪霞等，2018）。本研究基于KEGG注釋共富集到7條關(guān)鍵代謝通路，其中花青素生物合成通路、類黃酮合成通路和次級代謝產(chǎn)物合成通路3條代謝通路相對富集。其中，大量代謝物顯著富集在青素生物合成通路中，表明該通路可能在山櫻花花色的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在此以前，李玉闊（2020）同樣發(fā)現(xiàn)在軟棗獼猴桃由綠轉(zhuǎn)紅的生物過程中，類黃酮生物合成通路變化差異最為顯著，花青素類代謝物含量也在紅色成熟果實中顯著提升；針對山茶花不同花色品種進行色素種類及含量的測定后同樣發(fā)現(xiàn)，花青素生物合成途徑相關(guān)的矢車菊素和矮牽牛素的含量在紅色品種中顯著增加（Fu et al.， 2021）；趙君等（2021）發(fā)現(xiàn)，向日葵的紫色莖干矢車菊素含量遠高于白色品種，本研究結(jié)論均和上述結(jié)論相一致，認為花青素合成途徑在組織呈色中扮演了關(guān)鍵角色，同時該結(jié)論也和植物表型及生理研究結(jié)果相吻合。本研究初步探索了花青素在櫻花花色中的代謝差異，在代謝層面進行了一些初步探索，而未對其他典型色素例如類黃酮進行測定，尚不明確影響櫻花花色的具體分子機制，在之后的研究中需要進一步聯(lián)合多組學(xué)聯(lián)合研究櫻花花色呈色機制。

本研究利用生理生化及靶向代謝組學(xué)技術(shù)檢測山櫻花花瓣進行代謝組分析，共檢測到了42種花青素物質(zhì)，其中鑒定出11種共有差異代謝物并在KEGG數(shù)據(jù)中注釋，闡明了不同代謝物在花色變化中的表達趨勢，全面解析了不同花色櫻花品種形成的內(nèi)在代調(diào)控機制，為后期櫻花花色的分子層面調(diào)控提供了參考，并對櫻花新品種選育提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 李 莉 王登惠）