李錦超, 劉淑祺, 師晨瑋, 李躍凡, 賈凱旋, 劉曉清, 楊太新, 葛淑俊

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/教育部華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河北 保定 071000)

山藥為薯蕷科多年生纏繞性藤本薯蕷(DioscoreaopposataThunb.),地下根莖具有重要的食用與藥用價值[1],藥用歷史始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,富含皂苷、黏液質(zhì)、糖蛋白等多種有效成分,具有降血糖、降血脂、延緩衰老等藥理作用[2]。山藥在北方幾乎不結(jié)種子,無法利用種子來進(jìn)行更新[3]。山藥珠芽,在薯蕷中常叫做“零余子”,俗稱“山藥豆”[4],為變態(tài)腋生塊莖,具有與根莖相似的成分與功效,珠芽成熟后能自主發(fā)育為新的植株,是山藥種苗繁育、脫毒快繁和遺傳轉(zhuǎn)化研究的重要組織材料[5]。

山藥珠芽是由多個副芽分化而成的一種腋生復(fù)合結(jié)構(gòu),具有多個分生區(qū)和可以生根或出芽的疣突。珠芽解剖學(xué)結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)由表皮、薄壁組織、初生加厚分生組織、內(nèi)生薄壁組織和散生在其中的有限外韌維管束組成[6]。其形成和發(fā)育與蔗糖、淀粉的代謝以及激素含量的變化有重要關(guān)系[7]。當(dāng)山藥莖蔓枯黃時,珠芽中糖分和干物質(zhì)積累完全,表皮完全變褐,發(fā)育成熟[8]。在離體條件下珠芽誘導(dǎo)和發(fā)育受激素、蔗糖濃度和培養(yǎng)條件等因素影響。李明軍等[9]用懷山藥帶芽莖段作為外植體,在含有60 g/L 蔗糖的培養(yǎng)基和完全黑暗的培養(yǎng)條件中能誘導(dǎo)珠芽產(chǎn)生;彭曉英等[10]將盾葉薯蕷帶頂芽莖段豎插于MS+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+6%蔗糖培養(yǎng)基中,光照條件為1 500～2 000 lx,14 h/d,建立了珠芽離體誘導(dǎo)體系;將腳板薯脫毒試管苗雙節(jié)莖段接種在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8%蔗糖培養(yǎng)基中,8 h/d光照下,珠芽離體誘導(dǎo)率可達(dá)100%,且數(shù)量、鮮重和直徑均高于其他光照處理[11]。由此可見,高濃度的蔗糖是離體莖段形成珠芽的關(guān)鍵因素。但光強(qiáng)和光周期對山藥珠芽形態(tài)發(fā)生的影響尚未有系統(tǒng)研究。

本試驗(yàn)以河北省道地山藥小白嘴為材料,以帶芽莖段為外植體,研究離體條件下光照強(qiáng)度和光周期對珠芽誘導(dǎo)和生長發(fā)育的影響,為解析山藥珠芽發(fā)育機(jī)理和種苗高效快繁提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

將小白嘴山藥根莖切段栽種于育苗盒中,培養(yǎng)至幼苗嫩莖具7～8個節(jié)段備用。

珠芽誘導(dǎo)選用MS固體培養(yǎng)基,蔗糖濃度6%,瓊脂濃度0.8%,pH值5.8～6.0。121 ℃高溫高壓滅菌20 min備用。

1.2 光環(huán)境設(shè)置

對實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行光照強(qiáng)度和光周期處理。其中光照強(qiáng)度設(shè)3個處理,光合有效輻射(Photosynthetically active radiation,PAR)分別為20 μmol/(m2·s)、95 μmol/(m2·s)、195 μmol/(m2·s)。在每個光強(qiáng)下分別設(shè)置4 h/d、8 h/d、10 h/d、12 h/d、16 h/d等5個光照時長,共15個光強(qiáng)和光周期組合(表1)。

表1 光強(qiáng)和光周期的處理組合Table 1 Processing combinations of light intensity and photoperiod

1.3 接種及調(diào)查

剪取山藥植株帶芽嫩莖,流水沖洗30 min,無菌水沖洗3遍,用75%酒精消毒30 s,0.1%氯化汞溶液消毒8 min,無菌水沖洗5次。接種到培養(yǎng)基中,每瓶接3段,每處理15瓶,每天光照10 h,溫度(25±1)℃。待珠芽肉眼可見時(約15 d)轉(zhuǎn)移到上述光調(diào)控條件下。在處理0 d(D 0)、10 d(D 10)、20 d(D 20)、30 d(D 30)后,調(diào)查以下項目:分枝數(shù);葉面積及葉色;莖節(jié)數(shù);葉腋數(shù);珠芽數(shù)量;珠芽著生位置;珠芽長度;珠芽須根數(shù)和須根長;珠芽表皮顏色變褐面積;珠芽出芽率。其中,珠芽著生位置將接種外植體所含節(jié)定為初節(jié)(0),腋芽新生節(jié)根據(jù)生長次序依次定為第1、2、3、4節(jié)。

注:A為接種1 d莖段;B～C為培養(yǎng)15 d的莖段;B為長新生莖段外植體;C為未長新生莖段;D～G為由左至右第一排為處理1～5,第二排為處理6～10,第三排為處理11～15;D～E為光調(diào)控10 d;F～H為光調(diào)控20 d;I～G為光調(diào)控30 d;D、F、I為帶葉片植株;E、H、G為剪除葉片植株。比例尺為1 cm。圖1 山藥植株的生長形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes of yam plantlets

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表制作使用Microsoft Office Excel 2016軟件,采用IBM SPSS Statistics 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,用新復(fù)極差測驗(yàn)法(Duncan test)進(jìn)行處理間差異顯著性比較。不同小寫字母之間表示顯著性差異(p<0.05),同一列中不同字母代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 光強(qiáng)和光周期對山藥外植體生長狀態(tài)的影響

將消毒后的山藥帶芽莖段接種到培養(yǎng)基上,莖節(jié)處芽點(diǎn)會繼續(xù)分化發(fā)育,部分腋芽生長迅速,長出新生莖段,新葉呈綠色,約15 d后在葉腋處有乳白色珠芽著生,有不定根迅速形成并伸長(圖1 B);有些腋芽則不再伸長生長,僅在原始莖節(jié)葉腋處分化形成乳白色珠芽,同樣有不定根迅速形成并伸長(圖1 C)。

帶有珠芽的莖段轉(zhuǎn)移到不同光強(qiáng)和光周期組合條件下繼續(xù)培養(yǎng),葉片和分枝等逐漸發(fā)生變化。弱光[PAR 20 μmol/(m2·s)]下培養(yǎng),新生葉片一直呈深綠色,中度光強(qiáng)[PAR 95 μmol/(m2·s)]下出現(xiàn)程度較弱的黃化現(xiàn)象,而在強(qiáng)光條件[PAR 195 μmol/(m2·s)]下培養(yǎng)葉片黃化極明顯,且隨著培養(yǎng)時間和光照時數(shù)的延長黃化現(xiàn)象更嚴(yán)重,20 d后16 h/d光照下會出現(xiàn)葉片枯萎,30 d后在12 h光照下造成葉片枯死。表明山藥葉片在強(qiáng)光條件下隨著培養(yǎng)時間的增長而出現(xiàn)黃化現(xiàn)象,不利于外植體的生長,產(chǎn)生光脅迫(圖1)。

光照強(qiáng)度對離體培養(yǎng)的山藥莖段分枝數(shù)、莖節(jié)數(shù)和葉腋數(shù)沒有顯著影響,處理前后均為1、2個和4個,而光照時間影響較大,與較短日照時數(shù)相比,8 h和16 h的光照使莖、葉數(shù)量產(chǎn)生顯著差異,尤其在16 h/d強(qiáng)光照射下分枝生長受到抑制,分枝數(shù)、莖節(jié)數(shù)和葉腋數(shù)(分別為0.93、2.23、3.80)均顯著低于其他處理。分析表明,15 d內(nèi)山藥莖段的莖、葉分化已經(jīng)定型。因此,各處理間差異不顯著,而光強(qiáng)和光周期的變化影響了山藥葉片的生長狀態(tài),長時間強(qiáng)光照射會抑制植株生長,進(jìn)一步對珠芽的生長產(chǎn)生影響。

2.2 光調(diào)控對山藥珠芽的影響

2.2.1光強(qiáng)和光周期對山藥珠芽著生位置的影響

經(jīng)過統(tǒng)計分析,山藥珠芽的著生位置在各處理中未產(chǎn)生較大差異,最初珠芽集中著生在初葉節(jié)和新生枝的第1節(jié),平均占比47%和43%,隨著處理時間的推移,第2節(jié)和第3節(jié)處的珠芽開始生長,第4節(jié)僅在個別生長健壯的植株中少有珠芽著生(圖2)。但在強(qiáng)光處理4、5和中等光強(qiáng)處理10中隨著光照時間的增加,初葉節(jié)珠芽占比大于50%,說明長時間強(qiáng)光照射抑制了山藥新生枝條及其附生珠芽的生長。

圖2 山藥珠芽著生位置統(tǒng)計Fig.2 Statistics of bubil position of yam

2.2.2光強(qiáng)和光周期對山藥珠芽數(shù)量的影響

隨著在不同處理下山藥生長狀態(tài)的變化,珠芽數(shù)量也隨之變化,0～10 d是珠芽數(shù)量增長最快的階段,在處理10 d后數(shù)量趨于穩(wěn)定,平均每株4個珠芽,之后的20 d增長速度減緩。在強(qiáng)光和中等光強(qiáng)下,珠芽在光照8～16 h內(nèi)隨著時長的增加數(shù)量有所減少,而在4 h光照下分別低于8 h、8～12 h的珠芽數(shù)量;弱光條件下趨勢相反,4～12 h光照下珠芽數(shù)量呈增長趨勢,而16 h處理低于10～12 h光照的數(shù)量(表2)。分析可得,山藥珠芽生長數(shù)量與植株的葉腋數(shù)呈極顯著正相關(guān),而山藥珠芽的起始發(fā)育與光合有效輻射的積累有關(guān),4 h/d的195 μmol/(m2·s)光強(qiáng)照射基本滿足珠芽的發(fā)育需求,8 h時長下珠芽數(shù)量最多,而在20 μmol/(m2·s)光強(qiáng)下需要10 h光照時長才能滿足,并在12 h的光照條件積累下達(dá)到最高值。

表2 光照處理中山藥珠芽數(shù)量的變化Table 2 The change of the number of bulbil in each light treatment

2.2.3光強(qiáng)和光周期對山藥珠芽長度的影響

圖3表明,山藥珠芽在處理7、8中30 d平均長度超過4 mm,顯著優(yōu)于其他處理,弱光下平均長度也能達(dá)到3.5 mm左右,而在強(qiáng)光下珠芽整體長度僅達(dá)到3 mm,其生長顯著受到抑制。山藥珠芽隨著處理時間的延長,伸長生長量亦有所差別,不同光照條件下達(dá)到生長高峰的時間不同,強(qiáng)光處理整體抑制了珠芽的生長,處理前期0～10 d生長受阻,中期10～20 d適應(yīng)后生長較快,后期20～30 d生長遲緩滯緩;弱光下前期生長迅速,中后期生長速度減緩;中等光強(qiáng)下珠芽生長量顯著優(yōu)于其他處理(圖3)。通過分析光周期和珠芽生長量的關(guān)系發(fā)現(xiàn),在各光強(qiáng)下,4 h/d光照均不能滿足珠芽快速生長的需要,并且16 h/d的光照不同程度的抑制生長,而每天8 h和10 h的光照時長適宜珠芽的生長。

圖3 光照處理中山藥珠芽長度變化Fig.3 The length of yam bulbil changed under each treatment

2.2.4光強(qiáng)和光周期對山藥珠芽表皮顏色的影響

在不同光照處理中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),珠芽在最初萌發(fā)時為乳白色,隨著培養(yǎng)時間的延長,在處理10 d后中等以上光強(qiáng)均會促使珠芽50%以上的表皮變成褐色,強(qiáng)光下的變化稍早于中等光強(qiáng),20 d后達(dá)到70%以上,30 d后達(dá)90%以上。在弱光條件下,表皮褐化程度和速度與光照時間的增加呈正相關(guān),4 h/d光照使珠芽顏色一直處于顯著較低的褐化程度。通過分別分析光強(qiáng)和光周期對表皮顏色的影響發(fā)現(xiàn),弱光條件下珠芽褐化程度一直低于同期強(qiáng)光照射,并且中等光強(qiáng)與強(qiáng)光變化程度趨于一致;在不同光周期下,4 h/d光照有利于保持珠芽較淺的表皮顏色,16 h/d光照顯著促進(jìn)表皮變褐(圖4)。分析表明,山藥珠芽表皮對光反應(yīng)極為敏感,在弱光條件下亦產(chǎn)生褐化,而褐化程度標(biāo)志著珠芽成熟度的變化,減少光照輻射會減緩褐變速度,使珠芽能夠持續(xù)生長,為獲得更高質(zhì)量的珠芽提供可能性。

圖4 光強(qiáng)和光周期對山藥珠芽表皮顏色的影響Fig.4 The effect of light intensity and photoperiod on the epidermis color of bulbil

2.2.5光強(qiáng)和光周期對山藥珠芽須根生長的影響

珠芽萌發(fā)時伴隨著1～2條須根的生長,隨著處理時間的延長,弱光條件下,每個珠芽根數(shù)達(dá)到平均6條以上,平均根長17 mm左右(表3);強(qiáng)光明顯抑制根的萌發(fā)和生長,隨著光照時長的增加,根數(shù)和根長下降趨勢明顯(圖5);中等光強(qiáng)配合10 h以下光照時間有利于根的生長,16 h抑制根的生長。根的生長決定了珠芽吸收養(yǎng)分的多少,從而影響整體的生長趨勢。綜合來看,弱光和短日照條件是促進(jìn)山藥珠芽須根生長的有利因素。

圖5 光照處理0～30 d山藥珠芽不定根長度變化Fig.5 The length of bulbil adventitious roots varied from 0 to 30 days under light treatments

表3 光照處理中山藥珠芽不定根數(shù)量變化Table 3 Adventitious root number changes of yam bulbil under light treatmentt

2.2.6光強(qiáng)和光周期對山藥珠芽發(fā)芽率的影響

山藥組織培養(yǎng)體系中,珠芽是誘導(dǎo)再生植株的理想材料。本研究發(fā)現(xiàn),山藥莖段在培養(yǎng)25 d后珠芽在不同光照條件下均有出芽現(xiàn)象,弱光下發(fā)芽較早,在處理10 d后平均發(fā)芽率達(dá)到72.20%,而強(qiáng)光明顯抑制出芽,處理后10 d發(fā)芽率僅39.17%,處理30 d后發(fā)芽率約50%,中等光強(qiáng)發(fā)芽率達(dá)60%～70%,弱光則提升發(fā)芽率達(dá)83.82%左右,光周期對發(fā)芽率的影響不顯著(圖6)。分析表明,光強(qiáng)是影響山藥珠芽隱芽萌發(fā)的重要因素,受光周期的調(diào)控較弱。

圖6 光強(qiáng)和光周期對山藥珠芽發(fā)芽率的影響Fig.6 Effects of light intensity and photoperiod on the rate of bulbil shoots

3 討 論

光照是綠色植物生長的重要環(huán)境條件之一,山藥珠芽作為一種變態(tài)莖,且處于光照環(huán)境中,除了生長方向?yàn)橄蛑亓π陨L以外,似乎沿襲了莖在光照環(huán)境中的習(xí)性。在植物學(xué)中,山藥珠芽和地下根莖均起到貯藏作用,作為“庫”器官吸收轉(zhuǎn)化“源”器官輸送的光合產(chǎn)物,其自身不能進(jìn)行光合作用。在田間由于各種種植系統(tǒng)的不同經(jīng)常發(fā)生蔭蔽現(xiàn)象,導(dǎo)致光照條件不勻,田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)遮蔭會降低箭葉蘭芋(Xanthosomasagittifolium)、甘薯 (Ipomoeabatatas)、山藥(Dioscoreaesculenta)、木薯 (Manihotesculenta) 和香芋 (Colocasiaesculenta)等主要熱帶塊根和塊莖作物的下表皮氣孔密度,導(dǎo)致產(chǎn)生表面積更大但更薄的葉子[12],在山藥外植體培養(yǎng)過程中,長時間強(qiáng)光照射導(dǎo)致葉片加速衰老,而弱光下枝葉茂密,具有更多的分枝和莖節(jié)。Hendrik等[13]發(fā)現(xiàn),許多植物表型特征隨著日常光積分(DLI)以指數(shù)方式增加,比如本研究中外植體根、莖、葉等可在光調(diào)控下產(chǎn)生明顯的差異。山藥對光周期的微小變化非常敏感,Marcos等[14]評估輻射利用效率(RUE)隨種植日期的變化及其對水山藥(DioscoreaalataL.)生長和產(chǎn)量的影響發(fā)現(xiàn),受作物發(fā)育和光周期控制的源庫相互作用,最大RUE與光周期呈負(fù)相關(guān)。Vaillant等[15]研究了光周期對山藥幼苗發(fā)育的影響,發(fā)現(xiàn)地下塊莖僅在12 h光周期下誘導(dǎo)形成和發(fā)育,相反,16 h的光周期抑制了塊莖的形成并刺激了藤蔓和葉子的生長。Yasunori等[16]研究了光周期對山藥(DioscoreaoppositaThunb. cv. Ichoimo)塊莖發(fā)育的影響,發(fā)現(xiàn)長日光周期促進(jìn)了枝葉的發(fā)育,相比之下,塊莖受到16 h和24 h光周期的嚴(yán)重抑制,本研究中珠芽的生長同樣受到16小時強(qiáng)光照射的抑制。

由于珠芽是一些植物在特殊生境下為保障繁衍而進(jìn)化出的器官,因此植物珠芽的形成與環(huán)境因子也有一定的關(guān)系。珠芽繁殖是特基拉龍舌蘭對弱光環(huán)境的適應(yīng)性選擇,在弱光條件下,龍舌蘭的花莖上產(chǎn)生混合分生組織,在小苞片處萌生珠芽[17]。不同植物的珠芽形成對光周期有不同的要求,珠芽艾麻和樓梯草在短日照條件下形成珠芽,珠芽景天在長日照條件下形成珠芽。短日照、弱光環(huán)境能促進(jìn)臺閩苣苔產(chǎn)生相對更多的珠芽[18]。由此可見,光照會顯著影響一些植物珠芽的形成,不同植物對光強(qiáng)和光周期有不同的適應(yīng)性,山藥珠芽的伸長也受到光環(huán)境的調(diào)控從而產(chǎn)生適應(yīng)性生長。

光照是植物組織培養(yǎng)體系中的重要條件之一,自1955年首次報道在向日葵等組織培養(yǎng)中引進(jìn)光因子以來[19],有關(guān)光調(diào)控在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用研究已引起人們關(guān)注。在前人的研究中,短波光在較低強(qiáng)度下對煙草芽發(fā)生有促進(jìn)作用,而長波光需要在較高的光強(qiáng)下才能促進(jìn)芽的發(fā)生[20]。不同植物對光的接受能力不同,蘭花組培苗在中等光強(qiáng)[270 μmol/(m2·s)]下類胡蘿卜素含量高于低光強(qiáng)[175 μmol/(m2·s)]或高光強(qiáng)[450 μmol/(m2·s)],高光強(qiáng)下光合色素會加速分解而使其含量降低,而類胡蘿卜素可以吸收過剩的光子能量保護(hù)葉綠素不被氧化,減少光抑制[21],但人參組培苗在60 μmol/(m2·s)條件下葉綠素和類胡蘿卜素含量最高[22]。延長光照時間可促進(jìn)地黃組培苗的生長[23]。不同的植物在離體培養(yǎng)中對光的需求也不同,光強(qiáng)、光質(zhì)和光照時間的不同對外植體的生長產(chǎn)生不同的影響,根據(jù)培養(yǎng)目的不同創(chuàng)造合適的光環(huán)境能達(dá)到事半功倍的效果。同樣,在本研究中通過光環(huán)境調(diào)控發(fā)現(xiàn),弱光和短日照條件促進(jìn)山藥珠芽持續(xù)伸長、出芽和根的生長,而強(qiáng)光和長日照條件使珠芽表皮顏色褐化加快,促進(jìn)成熟,抑制芽和根的生長。

本研究利用山藥帶芽莖段為外植體,研究在培養(yǎng)過程中光強(qiáng)和光周期對莖、葉及珠芽伸長生長的影響。結(jié)果表明,長時間強(qiáng)光照射會抑制莖葉生長和珠芽的伸長;珠芽的發(fā)育與光合有效輻射的積累有關(guān);在各光強(qiáng)下8 h和10 h光周期適宜珠芽的生長;珠芽表皮對光反應(yīng)極為敏感,在弱光條件下亦產(chǎn)生褐化;弱光和短日照條件促進(jìn)珠芽根的生長;光強(qiáng)是影響珠芽出芽的重要因素。綜合來看,如培養(yǎng)目的為獲得更高質(zhì)量的種苗即促進(jìn)珠芽的伸長生長可選擇95 μmol/(m2·s)光照8 h或10 h,抑制生根和萌發(fā)可采用195 μmol/(m2·s)光照12 h或16 h,提高萌發(fā)率和促進(jìn)須根生長可選用20 μmol/(m2·s)照射4～12 h,為山藥種質(zhì)研究和快繁體系的優(yōu)化提供參考。