利用西瓜愈傷組織快速檢測CRISPR/Cas9基因編輯效率

彭婷　劉曼　劉春宇　王家發(fā)　田樹娟　袁黎

摘? ? 要：西瓜作為重要的園藝經(jīng)濟(jì)作物，其CRISPR/Cas9基因編輯效率的快速檢測方法仍十分匱乏。以愈傷組織再生能力強(qiáng)的野生西瓜種質(zhì)ZTC為試驗(yàn)材料，針對西瓜ClPDS基因構(gòu)建CRISPR/Cas9雙靶點(diǎn)敲除載體，利用農(nóng)桿菌侵染西瓜幼嫩子葉，在含1.0 mg·L^-12，4-二氯苯氧乙酸生長素的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織形成，通過綠色熒光蛋白標(biāo)記篩選陽性愈傷組織，檢測其編輯效率。結(jié)果表明，2個(gè)靶點(diǎn)均發(fā)生基因編輯，靶點(diǎn)1處的編輯效率為42.95%，靶點(diǎn)2處的編輯效率為29.92%。在愈傷組織中建立了西瓜生長發(fā)育早期有效基因編輯效率檢測體系，為后續(xù)編輯株系的確定節(jié)約了大量時(shí)間，為基因編輯技術(shù)應(yīng)用于西瓜重要農(nóng)藝性狀改良及優(yōu)異種質(zhì)創(chuàng)制提供了技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：西瓜；CRISPR/Cas9；愈傷組織；編輯效率檢測

中圖分類號(hào)：S651 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2023）05-029-08

Rapid CRISPR/Cas9 efficiency testing by transient transformation in watermelon callus

PENG Ting， LIU Man， LIU Chunyu， WANG Jiafa， TIAN Shujuan， YUAN Li

（State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas/College of Horticulture， Northwest A&F University， Yangling 712100， Shaanxi， China）

Abstract： The simple and effective system to test CRISPR/Cas9 gene editing efficiency has not been established in watermelon，? an important horticultural cash crop. In this study， the wild watermelon germplasm ZTC with strong callus regeneration ability was used as the material， and the CRISPR/Cas9 dual-target knockout vector was constructed to target the watermelon ClPDS gene. The watermelon young cotyledons were infested with Agrobacterium strain EHA105， then these incubated explants were cultivated in callus induction media. The positive callus was screened by green fluorescent protein label， and the editing efficiency of target sites were further tested by deep sequencing respectively. The results showed that the target 1 and target 2 had been mutated， and the total editing efficiency of target 1 and target 2 were 42.95% and 29.92%， respectively. Thus， a simple and rapid testing system of gene editing efficiency was established in watermelon callus during the early development stage， which saves time and labor for the subsequent experiment， and also provided a basic technical support for future watermelon CRISPR/Cas9 gene editing technology application.

Key words： Watermelon; CRISPR/Cas9; Callus; Editing efficiency testing

基因編輯技術(shù)是目前分子育種3.0時(shí)代的核心技術(shù)，是進(jìn)行作物性狀改良及新種質(zhì)創(chuàng)制的關(guān)鍵技術(shù)。其中，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)因設(shè)計(jì)簡單、操作方便等諸多優(yōu)點(diǎn)成為當(dāng)下應(yīng)用最為廣泛的基因編輯工具之一，在植物生長發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)、響應(yīng)生物與非生物脅迫研究方面發(fā)揮重要作用[1]。該工具主要是通過sgRNA和Cas9蛋白完成對基因組DNA雙鏈的識(shí)別和切割，在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)修飾，激發(fā)細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制，DNA在修復(fù)的過程中造成核苷酸序列改變從而實(shí)現(xiàn)基因編輯[2-3]。隨著對CRISPR/Cas9系統(tǒng)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)在工作過程中存在編輯效率低或無法正常編輯的情況，導(dǎo)致在轉(zhuǎn)基因陽性植株篩選過程中無法獲得正確編輯的突變體或突變體多為嵌合體等一些缺點(diǎn)[4-5]。因此，尋找早期快速、準(zhǔn)確地檢測編輯效率的方法已成為降低研究者工作量、提高工作效率、精準(zhǔn)鑒定后期突變體表型的迫切需求。

植物中早期快速檢測基因編輯效率的研究報(bào)道較少。張?jiān)聠痰萚6]利用西瓜不定根測定CRISPR/Cas9載體中所選靶點(diǎn)的可行性；楊孟霞等[7]通過發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄子葉產(chǎn)生毛狀根，提取轉(zhuǎn)基因毛狀根基因組DNA檢測CRISPR/Cas9多靶點(diǎn)載體的編輯效率。通常情況一條不定根是由一個(gè)細(xì)胞發(fā)育形成的，導(dǎo)致檢測編輯效率時(shí)需要采取大量根部樣品，以保證編輯效率的準(zhǔn)確性。在水稻[8]、玉米[9]和擬南芥[10]中可以利用其原生質(zhì)體細(xì)胞檢測CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率，該方法主要利用PEG將構(gòu)建的基因敲除載體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)細(xì)胞，通過顯微鏡統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的比例，然后提取轉(zhuǎn)化后原生質(zhì)體的DNA檢測編輯效率。原生質(zhì)體檢測編輯效率時(shí)樣品由無數(shù)單一細(xì)胞構(gòu)成，滿足檢測樣品數(shù)量多的條件，但該方法涉及原生質(zhì)細(xì)胞的提取、轉(zhuǎn)化以及培養(yǎng)等繁瑣過程，導(dǎo)致試驗(yàn)可控性和穩(wěn)定性較差。當(dāng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于梨樹研究時(shí)，由于梨組培苗的再生率低，楊鋒等[11]在梨愈傷組織中建立高效的基因編輯體系并檢測該系統(tǒng)的編輯效率。愈傷組織細(xì)胞檢測方式是采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法侵染植物外植體，在特定條件下誘導(dǎo)愈傷組織細(xì)胞團(tuán)的形成，挑取轉(zhuǎn)基因愈傷組織細(xì)胞檢測基因編輯效率。因此，利用愈傷組織早期快速檢測編輯效率的方法克服了不定根檢測法效率檢測準(zhǔn)確率低的問題，同時(shí)克服了原生質(zhì)體法可控性差、穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，是目前較理想的編輯效率檢測方法。

西瓜（Citrullus lanatus）為葫蘆科西瓜屬的一年生蔓生植物，因其清爽解渴，營養(yǎng)價(jià)值豐富，是夏季防暑降溫必備水果，是我國重要的經(jīng)濟(jì)園藝作物之一[12-13]。2017年，許勇團(tuán)隊(duì)將CRISPR/Cas9技術(shù)成功地應(yīng)用于西瓜物種中，定向敲除西瓜白化基因，同時(shí)利用西瓜原生質(zhì)檢測該系統(tǒng)的編輯效率[14]。然而，利用愈傷組織快速準(zhǔn)確檢測基因編輯效率在西瓜中的應(yīng)用待進(jìn)一步研究。針對西瓜穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化周期長、培養(yǎng)過程復(fù)雜和西瓜原生質(zhì)體細(xì)胞不易提取和培養(yǎng)等問題[15-16]，筆者以愈傷再生能力強(qiáng)的野生型西瓜種質(zhì)ZTC為材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法侵染幼嫩子葉外植體并誘導(dǎo)愈傷組織形成，通過西瓜愈傷組織細(xì)胞檢測CRISPR/Cas9基因編輯效率，在西瓜中建立一種簡單快速的CRISPR/Cas9基因編輯效率的檢測方法，為其他葫蘆科作物及植物編輯效率快速檢測提供技術(shù)基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型種質(zhì)ZTC，生長于關(guān)中平原與黃土高原過渡區(qū)域。由于ZTC可進(jìn)行高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化以及該種質(zhì)的愈傷再生能力強(qiáng)，因此選擇野生型西瓜種質(zhì)ZTC為材料展開研究。試驗(yàn)材料于2021年3－8月種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院楊凌西甜瓜示范基地的塑料大棚，2021年10月收取種子用于后續(xù)試驗(yàn)。由西北農(nóng)林科技大學(xué)西甜瓜課題組提供CRISPR/Cas9基因編輯載體pBSE402和pCBC-DT1T2[17-18]。大腸桿菌（E. coli）DH5ɑ菌株和根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105購于上海唯地生物技術(shù)有限公司

1.2 CRISPR/Cas9雙靶點(diǎn)敲除載體的構(gòu)建

（1）用限制性內(nèi)切酶BsaI 酶切pBSE402載體，得到線性化載體。反應(yīng)體系為：2 ?g pBSE402質(zhì)粒，5.0 ?L 10×CutSmart Buffer，1.5 ?L BsaI-HF，補(bǔ)充dd H₂O至50 ?L的反應(yīng)體系，37 ℃酶切45 min。

（2）使用文獻(xiàn)報(bào)道的西瓜PDS基因ClPDS（Cla010898）的2個(gè)靶點(diǎn)作為編輯效率檢測靶點(diǎn)[14]，以ClPDS-F/R為引物，pCBC-DT1T2載體為模板，使用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該P(yáng)CR產(chǎn)物的5和3最末端的序列分別與pBSE402線性化載體兩末端序列完全一致。

（3）使用天根通用型DNA純化回收試劑盒回收純化上述獲得的線性化載體和PCR產(chǎn)物后，通過同源重組方法進(jìn)行連接，取10 μL連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，檢測陽性克隆，測序正確后提取大腸桿菌質(zhì)粒，獲得正確的重組質(zhì)粒pBSE402-PDS。

（4）吸取2 μL pBSE402-PDS重組質(zhì)粒加入100 μL的農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，冰上5 min，液氮5 min，37 ℃ 5 min，冰上5 min后加入500 μL LB液體培養(yǎng)基，200 r?min-1 28 ℃ 3 h后，5000 r?min^-1離心5 min，倒上清液400 μL，將剩余100 μL液體與底部菌液吸打混勻，涂布在50 mg·L^-1卡那霉素和20 mg·L^-1利福平LB固體培養(yǎng)基上，28 ?C培養(yǎng)2～3 d。挑取PCR驗(yàn)證后的單菌落至10 mL 50 mg·L^-1卡那霉素和20 mg·L^-1利福平的LB液體培養(yǎng)基中，在200 r?min^-128 ℃的搖床上搖至OD600=0.8。

1.3 西瓜愈傷組織編輯效率統(tǒng)計(jì)方法

1.3.1 西瓜愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化方法 西瓜愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化主要是參照西瓜遺傳轉(zhuǎn)化過程和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)條件[19-20]，具體步驟如下：

（1）外植體制備：準(zhǔn)備20粒ZTC種子，55 ?C 溫湯浸種30 min，剝?nèi)シN殼；在超凈臺(tái)中將種子在75%乙醇浸泡30 s，滅菌水清洗3遍，3%次氯酸鈉浸泡15 min，然后用滅菌水清洗5～6遍，滅菌濾紙上晾干；平放到播種培養(yǎng)基（瓊脂Agar powder 6.4 g·L-1），于28 ?C黑暗條件下生長2～3 d；待下胚軸長至5 mm左右時(shí)，在超凈臺(tái)中將每粒種子2片子葉分別切成4塊，即為制備好的外植體。

（2）外植體侵染：在20 mL無菌注射器中加入10 mL MS液（M519 4.43 g·L^-1+蔗糖30 g·L-1+6-BA 1.5 mg·L^-1+40.0 mg·L-1乙酰丁香酮），取1 mL OD₆₀₀=0.8的菌液加入MS液體中制成侵染液；將制備好的外植體浸泡在侵染液中，抽真空15 min；棄侵染液，取出外植體平鋪在滅菌濾紙上晾干。

（3）愈傷的組織培養(yǎng)：將晾干外植體移至含有1.0 mg·L^-12，4-D的MS固體培養(yǎng)基（M519 4.43 g·L^-1+蔗糖30.00 g·L^-1 + 瓊脂G3251 3.00 g·L^-1+200 mg·L^-1TMT）并調(diào)pH值為6.0以誘導(dǎo)愈傷組織。

1.3.2 西瓜愈傷組織編輯效率檢測方法 使用體視熒光顯微鏡挑取發(fā)熒光的愈傷細(xì)胞，取20個(gè)獨(dú)立愈傷組織細(xì)胞團(tuán)混合成為1個(gè)樣品，共計(jì)3個(gè)重復(fù)。采用CTAB法提取發(fā)熒光愈傷組織DNA，設(shè)計(jì)引物PDS-F1/R1、PDS-F2/R2擴(kuò)增含靶點(diǎn)的ClPDS基因序列送Sanger測序，設(shè)計(jì)引物PDSd-F1/R1、PDSd-F2/R2擴(kuò)增包含靶點(diǎn)的ClPDS基因序列送深度測序（Hi-TOM），檢測靶點(diǎn)編輯效率以及編輯類型[21]（表1）。

1.4 西瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率統(tǒng)計(jì)方法

外植體制備和外植體侵染參照西瓜愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化中外植體制備和侵染過程，不定芽的組織培養(yǎng)：將晾干外植體移至含有1.0 mg·L^-16-BA的MS固體培養(yǎng)基（M519 4.43 g·L^-1+蔗糖30.00 g·L^-1+瓊脂G3251 3.00 g·L^-1+ 200 mg·L^-1TMT）并調(diào)pH值為6.0；3周后統(tǒng)計(jì)侵染外植體子葉塊的數(shù)目和陽性不定芽的數(shù)目，遺傳轉(zhuǎn)化效率/%=陽性不定芽數(shù)目/外植體數(shù)目×100，1個(gè)載體進(jìn)行3次獨(dú)立的遺傳轉(zhuǎn)化過程，分別統(tǒng)計(jì)每次遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)外植體子葉塊的數(shù)目和陽性不定芽的數(shù)目。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2020進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR/Cas9雙靶點(diǎn)載體的構(gòu)建

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道西瓜ClPDS（Cla010898）基因的2個(gè)靶點(diǎn)，構(gòu)建pBSE402雙靶點(diǎn)敲除載體（圖1-A），2個(gè)靶點(diǎn)分別位于第1個(gè)和第3個(gè)外顯子上，第一個(gè)靶點(diǎn)的GC含量為65%（圖1-B），第二個(gè)靶點(diǎn)的GC含量為47%（圖1-C）。

根據(jù)pBSE402雙靶位點(diǎn)的構(gòu)建原則設(shè)計(jì)含有靶點(diǎn)的引物序列ClPDS-F/R，以pCBC-DT1T2載體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中有4個(gè)片段包括sgRNA1/U6-26t/U6-29p/sgRNA2，目的片段大小為622 bp（圖2-A）。使用限制性內(nèi)切酶BsaI酶切pBSE402載體，切除片段大小為1225 bp（圖2-B）。將上述擴(kuò)增片段和酶切載體膠回收純化，使用同源重組酶連接，將連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，設(shè)計(jì)引物U6-26F和U6-29R檢測陽性克隆，條帶大小為626 bp（圖2-C），表明重組載體構(gòu)建成功，提取質(zhì)粒，使用U6-26F1引物進(jìn)行Sanger測序，將測序正確的質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105，使用U6-26F和U6-29R再次鑒定陽性單克隆，表明該質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105（圖2-D）。

2.2 基于西瓜不定芽的CRISPR/Cas9遺傳轉(zhuǎn)化效率統(tǒng)計(jì)

通過西瓜陽性不定芽檢測CRISPR/Cas9編輯載體pBSE402的轉(zhuǎn)化效率，首先使用pBSE402-PDS/EHA105農(nóng)桿菌侵染西瓜外植體子葉塊，放置于含有1 mg·L^-16-BA的MS固體培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)3周后（圖3），分別統(tǒng)計(jì)3次獨(dú)立侵染外植體的數(shù)量和陽性不定芽的數(shù)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，pBSE402載體的遺傳轉(zhuǎn)化效率為4.75%（表2）。

2.3 基于西瓜愈傷組織細(xì)胞的CRISPR/Cas9編輯效率檢測

通過西瓜陽性愈傷組織實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9編輯效率快速檢測，首先使用pBSE402-PDS /EHA105農(nóng)桿菌侵染西瓜外植體子葉塊，在28 ℃黑暗環(huán)境下共培養(yǎng)3 d（圖4-A～B），放置于含有1 mg·L-1 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織細(xì)胞形成（圖4-C～D）。如圖4-C所示，在體式熒光顯微鏡下挑取GFP熒光蛋白表達(dá)的愈傷組織，提取20個(gè)獨(dú)立陽性愈傷組織混合作為1次重復(fù)，提取愈傷DNA進(jìn)行基因編輯效率分析，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

在sgRNA和Cas9基因的序列上分別設(shè)計(jì)U6-26F/U6-29R和Cas9 F/R引物，檢測轉(zhuǎn)基因愈傷組織中是否有T-DNA的插入。PCR結(jié)果表明，愈傷組織樣品的DNA中U6-26F/U6-29R引物擴(kuò)增片段為626 bp，Cas9 F/R引物擴(kuò)增片段為481 bp，均檢測到sgRNA片段和Cas9基因片段（圖5-A～B），表明pBSE402載體的T-DNA序列成功插入到西瓜基因組中。

設(shè)計(jì)引物PDS-F1/R1、PDS-F2/R2擴(kuò)增含靶點(diǎn)1和靶點(diǎn)2的ClPDS基因序列進(jìn)行Sanger測序。普通測序結(jié)果表明，3個(gè)樣品均在靶點(diǎn)1處出現(xiàn)明顯雙峰，在靶點(diǎn)2處未出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象（圖6-A）。然后設(shè)計(jì)深度測序引物PDSd-F1/R1、PDSd-F2/R2擴(kuò)增包含靶點(diǎn)1和靶點(diǎn)2的ClPDS基因序列進(jìn)行深度測序。深度測序統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，靶點(diǎn)1和靶點(diǎn)2的編輯效率分別為42.95%和29.92%（表3），表明在靶點(diǎn)1和靶點(diǎn)2處均發(fā)現(xiàn)編輯形式，其中靶點(diǎn)1存在6種編輯形式，涉及2～6個(gè)堿基的缺失，其中以3個(gè)堿基GTG的缺失為主要形式。靶點(diǎn)2也存在6種編輯形式，涉及1～6個(gè)堿基的缺失，其中以1個(gè)堿基C的缺失為主要形式（圖6-B）。

3 討論與結(jié)論

目前CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于小麥[22]、玉米[23]、水稻[5]、大豆[24]和番茄[25]等作物中，隨著科學(xué)技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)及其衍生的新型基因編輯工具將在作物定向分子設(shè)計(jì)育種應(yīng)用中發(fā)揮重要作用，能為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)培育高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的創(chuàng)新作物種質(zhì)資源?；蚓庉嬓实臋z測是CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功應(yīng)用于作物中的重要前提，在進(jìn)行大量遺傳轉(zhuǎn)化之前，應(yīng)當(dāng)先進(jìn)行靶點(diǎn)編輯效率的檢測，確定靶點(diǎn)是否能夠工作以及該靶點(diǎn)的編輯效率，從而減少人力和物力的浪費(fèi)。2017年，許勇團(tuán)隊(duì)成功將基因編輯技術(shù)應(yīng)用到西瓜物種中，利用西瓜原生質(zhì)體檢測CRISPR/Cas9編輯效率，但該方法涉及植物原生質(zhì)體細(xì)胞的提取、侵染和培養(yǎng)過程，對植物生長狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)操作過程要求較高，導(dǎo)致試驗(yàn)的穩(wěn)定性和可控性差[14]。愈傷組織是植物的某些器官或組織在合適的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的具有旺盛分裂能力的薄壁細(xì)胞，具有細(xì)胞數(shù)量大，培養(yǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)[26]。愈傷組織再生能力主要是由植物基因型所決定的，同時(shí)也受外源激素和培養(yǎng)基選擇等外在因素的影響[27]。前期試驗(yàn)通過探析不同西瓜種質(zhì)愈傷的再生能力，發(fā)現(xiàn)ZTC野生種質(zhì)的愈傷組織再生能力較強(qiáng)，因此選擇該種質(zhì)作為此次試驗(yàn)的材料。

筆者構(gòu)建了pBSE402-PDS雙靶點(diǎn)基因敲除載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法侵染西瓜外植體，通過西瓜陽性不定芽來統(tǒng)計(jì)pBSE402-PDS載體的遺傳轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果表明，遺傳轉(zhuǎn)化效率為4.75%，與Feng等[20]研究結(jié)果相符。利用深度測序檢測到陽性愈傷基因組靶點(diǎn)１和靶點(diǎn)2處的編輯效率分別為42.95%和29.92%，表明該方法具有可行性。有研究表明，玉米[28]、水稻[29]等植物，可以通過對不斷繼代的愈傷進(jìn)行侵染，然后進(jìn)行脫分化和再分化，培養(yǎng)出完整的轉(zhuǎn)基因植株，筆者在研究中提出了完善的愈傷組織培養(yǎng)方法也為未來通過誘導(dǎo)西瓜愈傷組織分化形成完整的轉(zhuǎn)基因植株提供了技術(shù)支撐。

筆者的研究針對西瓜的遺傳轉(zhuǎn)化體系過程復(fù)雜、周期長以及原生質(zhì)體細(xì)胞操作困難的問題，在西瓜愈傷組織中建立一種簡單、快速、方便的西瓜CRISPR/Cas9基因編輯效率檢測方法，避免在后續(xù)試驗(yàn)中出現(xiàn)靶點(diǎn)不工作、靶點(diǎn)工作效率低等情況，對加快后期基因功能研究和作物遺傳育種研究具有重要意義。

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