ame-miR-124-3p對西方蜜蜂氣味學習的影響

王天寶,邱園妹,孫巧玲,楊長生,Aqai Kalan Hassanyar,黃景南,李志國,蘇松坤

(福建農林大學動物科學學院(蜂學學院),福州 350002)

蜜蜂是一種真社會性昆蟲,它們的神經生理指標可以被記錄,相關行為可以直接觀察,被認為是研究學習與記憶的良好模式生物(Giurfaetal., 2012; Lafonetal., 2021)。研究表明,蜜蜂能夠在實驗室條件下的3D虛擬現實(virtual reality, VR)環(huán)境中學會根據顏色差異區(qū)分獎勵和懲罰的刺激(Lafonetal., 2021)。在氣味學習訓練中,蜜蜂能夠將氣味與糖水獎勵聯系起來,表現出很強的聯想學習能力,這在蜜蜂外出覓食中發(fā)揮著重要作用(Giurfa, 2007)。

miRNA是一種長度大約為21～22 nt的非編碼RNA,是一類在轉錄后水平對mRNA進行負調控的關鍵調控因子(Bartel, 2018)。與mRNA一樣,miRNA的表達模式在空間和時間上都是特定的,每個miRNA可以靶向數十到數百個mRNA,并可能因此調節(jié)多個基因網絡(Friedmanetal., 2009; Bartel, 2018)。因此,在miRNA表達相對較小的情況下,就可以實現復雜行為的基因調控。

越來越多的證據表明,miRNA參與了昆蟲的神經調控。研究發(fā)現,miR-132和miR-125影響小鼠大腦的神經可塑性和記憶(Edbaueretal., 2010)。Rajasethupy等人在海兔中發(fā)現170個miRNA,并在神經系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用(Rajasethupathyetal., 2009)。Busto等人通過RNA干擾技術,發(fā)現miRNA在果蠅嗅覺學習與記憶上發(fā)揮重要作用(Bustoetal., 2015)。據報道,miRNA參與了蜜蜂的學習與記憶過程。研究發(fā)現,miR-276和miR-1000在蜜蜂腦部高表達,并通過原位雜交技術發(fā)現其富集在蘑菇體的keyon細胞中,有研究報道,蘑菇體是昆蟲大腦的一個高級整合中心,蘑菇體外源性神經元(Mushroom body extrinsic neurons,MB Ens)可能參與調控蜜蜂的行為(Haehneletal., 2010; Fillaetal., 2015; Paffhausenetal., 2020),從而推測miR-276和miR-1000參與調控了蜜蜂的神經功能(Sayaka Hori, 2011)。此外,Cristino等人通過嗅覺學習實驗發(fā)現miR-932的抑制會損害長期記憶的形成,miR-932通過靶向肌動蛋白,調控蜜蜂的記憶(Cristinoetal., 2014)。Qin等人通過迷宮訓練實驗,也發(fā)現miRNA可能在蜜蜂的學習和記憶過程中發(fā)揮關鍵作用(Qinetal., 2014)。這些研究表明,蜜蜂學習行為的變化會伴隨著腦部miRNA的表達變化,miRNA在一定程度上參與了蜜蜂的學習與記憶過程。雖然研究人員對miRNA研究較多,但對于其如何調控蜜蜂學習行為的確切機制仍知之甚少。

在本實驗室團隊之前的研究中,通過利用small RNA-seq(sRNA-seq)技術對12日齡學會與學不會的西方蜜蜂Apismellifera個體腦部進行高通量測序,篩選出14個差異表達miRNA,其中ame-miR-124-3p在學會的蜜蜂組中表達上調,根據以往文獻報道ame-miR-124-3p可能是西方蜜蜂學習的關鍵調控因子(Qinetal., 2014; Michelyetal., 2017),但ame-miR-124-3p對西方蜜蜂氣味學習的作用沒有得到直接的實驗驗證,其分子機制尚不明確。為了繼續(xù)研究ame-miR-124-3p在調控蜜蜂氣味學習的作用,在本試驗中發(fā)現,ame-miR-124-3p的表達抑制降低了蜜蜂的學習比例,ame-miR-124-3p的過表達則能增強蜜蜂的氣味學習能力,這表明ame-miR-124-3p在調控蜜蜂氣味學習中起著重要作用。

1 材料與方法

1.1 供試蜜蜂

西方蜜蜂來自福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)實驗蜂場(福建,福州)。從3群健康蜂群中提取3張成熟子脾,置于3個干凈的限王產卵框中,并放在恒溫培養(yǎng)箱(溫度34℃,相對濕度70%)中培養(yǎng)。每天用不同顏色的油漆筆標記剛出房的蜜蜂工蜂,記為1日齡,每天標記的蜜蜂大概在400～500頭,將標記好的蜜蜂放入原蜂群。

1.2 干擾序列設計

根據ame-miR-124-3p的成熟體序列,委托上海吉瑪制藥有限公司(GenePharma)設計合成ame-miR-124-3p的抑制劑(ame-miR-124-3p inhibitor)、ame-miR-124-3p抑制劑的無意義序列(ame-miR-124-3p inhibitor-NC)、ame-miR-124-3p的模擬物(ame-miR-124-3p mimics)和ame-miR-124-3p模擬物的無意義序列(ame-miR-124-3p mimics-NC)(表1)。

表1 干擾序列及相關信息

1.3 蜜蜂的固定與合成序列的飼喂

待到蜜蜂11日齡時,用軟鑷子抓取并放入透氣的玻璃瓶中,放置冰上凍暈,用膠帶將蜜蜂快速固定于特制的銅管中,使其吻部可自由活動而露出的頭部不可隨意轉動。將固定好的蜜蜂喂食10 μL含每種合成試劑6.6 μg的50%蔗糖溶液(Liuetal., 2017),所有的蜜蜂在處理后都用50%蔗糖溶液喂飽,置于黑暗培養(yǎng)箱中(28℃,相對濕度70%),24 h后進行氣味聯想性學習訓練(Matsumotoetal., 2012)。

1.4 氣味聯想學習訓練

氣味聯想性學習實驗的訓練方式參照Matsumoto等創(chuàng)建的PER標準方法(Matsumotoetal., 2012)。實驗前用30%糖水觸碰蜜蜂觸角,只有表現出伸吻反應的蜜蜂才被用于實驗。訓練時采用A、B(A,1-壬醇;B,正己醇)兩種不同的氣味,A氣味為條件刺激(Conditional Stimuli,CS),糖水獎勵為非條件刺激(Unconditional Stimuli,US),A氣味與糖水獎勵配對訓練(CS+),B氣味作為對照氣味,不與糖水獎勵相配對(CS-)。為了排除順序對實驗的干擾,每組一半的蜜蜂按照ABBAAB的順序,另一半的蜜蜂按照BAABBA的順序,對每頭蜜蜂分別進行3次聯想性學習和非聯想性學習。聯想性學習的訓練時間是42 s。先將蜜蜂靜置10 s,再單獨通入5 s的空氣;隨后通入4 s的A氣味給予條件刺激,同時使用30%糖水觸碰觸角,使其伸吻,持續(xù)時間為2 s;而后讓蜜蜂取食糖水1 s,最后再通空氣20 s。非聯想性學習訓練是通B氣味時不給予糖水獎勵,每次聯想性學習和非聯想性學習訓練的時間間隔為10 min。實驗重復進行5次,每組至少有50頭蜜蜂接受氣味學習訓練。本研究認為只有在蜜蜂觸角接觸到氣味時,蜜蜂立即伸吻并表現出強烈攝食動作才算學會CS關聯US,記為“1”,未表現出伸吻反應則記為“0”,通過蜜蜂對氣味的伸吻反應率來評估3次實驗中蜜蜂的學習情況。訓練結束后立即用液氮將蜜蜂凍斃,獲取蜜蜂頭部并儲存于-80℃超低溫冰箱,用于后續(xù)腦部解剖。

1.5 qRT-PCR檢測相對表達量

低溫下解剖蜜蜂腦部,放入RNA-Free EP管中,每管3頭,每組設置12個生物學重復。利用miRNA Design軟件(Vazyme公司,中國)設計特異性的Stem-loop引物、上游引物和通用的反向引物,選擇R為通用引物(表2),U6作為內參基因(Liuetal., 2019)。委托上海生工生物工程有限公司合成引物。通過磁珠法,利用LabServ Universal RNA kit分別提取處理組和對照組總RNA,按miRNA 1stStrand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop)(MR101-01/02)(Vazyme公司,中國)說明書進行總RNA的莖環(huán)反轉錄。反轉錄體系為10 μL,5×g DNA Wiper Mix:1 μL,總RNA:v μL,Stem-loop primer(2 μM):1 μL,10 × RT Mix:1 μL,Hiscript II Enzyme Mix:1 μL,RNase Free ddH2O:6-v μL;反轉錄條件為:25℃ 5 min,50℃ 15 min,85℃ 5 min,得到的cDNA作為模板進行qPCR。qPCR反應體系為10 μL:SYBR Green Dye 5 μL,特異性上游引物0.2 μL,通用下游引物0.2 μL,cDNA模板1 μL,RNA-Free H2O 3.6 μL。反應條件為:95℃ 5 min,95℃ 10 s,60℃ 30 s,共40個循環(huán),熔解曲線反應條件為:95℃ 15 s,60℃ 1 min。最后用2-ΔCT的值來計算相對表達量(Ishiguro, 1992)。

表2 用于熒光實時定量 PCR的引物序列

1.6 統(tǒng)計分析

利用SPSS 16.0軟件對PER和qPCR數據進行t檢驗,GraphPad Prism 5.0軟件進行結果的繪圖。

2 結果與分析

2.1 ame-miR-124-3p抑制與過表達對氣味學習的影響

ame-miR-124-3p的抑制組與ame-miR-124-3p抑制的對照組的有效樣本數分別為54頭和62頭,與ame-miR-124 inhibitor-NC組(80.47%)相比,飼喂ame-miR-124 inhibitor組的蜜蜂經過3次訓練后學習比例(63.17%)顯著下降(t=3.081,P<0.05)(圖1),這表明ame-miR-124-3p的抑制能夠減弱蜜蜂的氣味學習行為。ame-miR-124-3p的過表達組與ame-miR-124-3p過表達的對照組的有效樣本數分別為62頭和65頭,與ame-miR-124-3p過表達對照組(67.73%)相比,飼喂ame-miR-124-3p過表達組的蜜蜂學習比例(84.39%)顯著上升(t=2.771,P<0.05)(圖2),說明ame-miR-124-3p過表達能夠增強蜜蜂的氣味學習行為,這表明ame-miR-124-3p可能參與氣味學習的正向調控。

圖1 ame-miR-124-3p抑制對西方蜜蜂氣味學習的影響Fig.1 Effect of inhibition of ame-miR-124-3p on odor learning in Apis mellifera注:*表示在第3次學習試驗中ame-miR-124抑制組與ame-miR-124抑制對照組中的伸吻反應率經t檢驗顯著性差異(P<0.05)。Note: Single asterisk indicated that proboscis extension response rates were significantly different by t-test between ame-miR-124-3p inhibitor and ame-miR-124-3p inhibitor-NC from the 3rd learning experiments.

2.2 qRT-PCR驗證氣味學習后蜜蜂腦部ame-miR-124的相對表達水平

與ame-miR-124-3p抑制劑的無意義序列組相比,飼喂ame-miR-124抑制劑組蜜蜂腦部ame-miR-124相對表達量水平顯著降低(t=2.655,P<0.05)而與ame-miR-124-3p模擬物的無意義序列組相比,ame-miR-124-3p模擬物組蜜蜂腦部的ame-miR-124-3p相對表達量水平顯著升高(t=2.114,P<0.05)(圖3),這揭示了ame-miR-124-3p在調控蜜蜂的氣味學習中起著重要作用。

圖2 ame-miR-124-3p過表達對西方蜜蜂氣味學習的影響Fig.2 Effect of overexpression of ame-miR-124-3p on odor learning in Apis mellifera注:*表示在第3次學習試驗中ame-miR-124-3p過表達組與ame-miR-124-3p過表達對照組的伸吻反應率經t檢驗呈顯著性差異(P<0.05)。Note: Single asterisk indicated that proboscis extension response rates were significantly different by t-test between ame-miR-124-3p mimics and ame-miR-124-3p mimics-NC from the 3rd learning experiments.

圖3 ame-miR-124-3p的相對表達量Fig.3 Relative expression levels of ame-miR-124-3p注:*表示經t檢驗呈顯著性差異(P<0.05)。Note: Single asterisk indicated that proboscis extension response rates were significantly different by t-test.

3 結論與討論

學習是動物在自然界中賴以生存的重要能力,相對于大型動物,蜜蜂大腦體積小,包含的神經元數量少,但蜜蜂同樣有復雜的社會行為(Lafonetal., 2021)。因此,利用蜜蜂作為模型動物由淺入深的研究學習機制極其重要。研究報道顯示,12日齡的蜜蜂已經具有穩(wěn)定且較好的氣味學習能力(Laloietal., 2001; 邱園妹等,2020)。在本試驗中只選取11日齡的蜜蜂作為實驗對象,排除了日齡對實驗的干擾。氣味學習過程中提供兩種較容易區(qū)分的氣味(1-壬醇和正己醇),可減小蜜蜂對特定氣味的喜好所產生的偏差(Rayetal., 1997; Michelyetal., 2017)。

目前,許多研究都在探索蜜蜂的氣味學習分子機制。Wang等人將氣味學習訓練后的蜜蜂大腦與未經過氣味學習訓練的蜜蜂大腦進行基因表達譜(Digital gene expression,DGE)測序發(fā)現 259個差異表達基因,這為探究蜜蜂的氣味學習與記憶的機制提供了重要線索(Wangetal., 2013)。Farooqui等人發(fā)現章魚胺介導觸角葉早期加工階段嗅覺記憶組成部分的鞏固(Farooquietal., 2003)。另外,Cristino等人研究發(fā)現miR-932的抑制能夠損害氣味學習后長期記憶的形成,mir-932靶基因的驗證發(fā)現,miR-932與肌動蛋白相互作用,這表明miR-932可能能靶向肌動蛋白來調控蜜蜂的記憶形成(Cristinoetal., 2014),為miRNA參與蜜蜂學習與記憶提供了直接證據。此外,Michely等人在蜜蜂氣味聯想學習訓練前4 h注射miR-124抑制劑,發(fā)現蜜蜂在3次氣味聯想學習后2 h的短期記憶和24 h的長期記憶顯著降低,這說明miR-124在條件反射誘導的瞬變記憶的早期階段起著重要作用(Michelyetal., 2017)。Cristino等人和Michely等人的研究雖然很好地闡述了miRNA與蜜蜂記憶的關系,但未揭示miRNA對蜜蜂氣味學習能力的影響。

本研究通過miRNA的抑制和過表達發(fā)現了ame-miR-124-3p在調控蜜蜂氣味學習能力中起著重要作用。ame-miR-124-3p被抑制后,蜜蜂的氣味學習能力降低(圖1),蜜蜂腦部ame-miR-124-3p的相對表達量顯著降低(圖3);而ame-miR-124-3p的過表達則會增強蜜蜂的氣味學習能力(圖2),這表明ame-miR-124-3P可能是調控蜜蜂學習能力的重要因子,這與Michely等人的研究發(fā)現產生了緊密的關聯。以往的研究表明,miR-124在果蠅的中樞神經系統(tǒng)中表達(Starketal., 2005),也在雞脊髓神經前體細胞中高度表達(Caoetal., 2007);miR-124是小鼠大腦含量最豐富的miRNA,占所有miRNA在大腦表達的25%～48%(Lagos-Quintanaetal., 2017)。用miR-124轉染小鼠神經干細胞發(fā)現,miR-124能夠誘導神經干細胞、刺激神經元的分化(Silberetal., 2017)。Cheng等人在小鼠腦室下區(qū)(Subventricular zone,SVZ)的活體實驗發(fā)現,miR-124使SRY-box表達下調,從而抑制前體分裂并刺激分化(Chengetal., 2009)。Rajasethupathy等人通過分析miRNA在海兔不同組織中產生的克隆數量,確定每個miRNA的豐度和組織分布,他們發(fā)現含量最豐富的是miR-124(Rajasethupathyetal., 2009)。這些發(fā)現說明在果蠅、雞、小鼠和海兔中,miR-124都是神經發(fā)生的重要調控因子。此外,Qin等人利用SRNA-seq技術,發(fā)現經過視覺學習后的蜜蜂個體腦部miRNA表達量出現變化,并檢測出40個差異表達的已知miRNA,其中包含miR-124,這表明視覺學習的蜜蜂會在條件化之后直接誘導不同miRNA水平的變化,特定的miRNA可能通過調控學習,從而促進蜜蜂記憶的形成(Qinetal., 2014)。這些研究結果表明miR-124在各種物種中相對保守,并可能參與動物的神經調控。

miRNA在突觸發(fā)育的不同階段發(fā)揮著廣泛的作用,包括樹突形成、突觸形成和突觸成熟(Schratt, 2009)。此前有報道稱miR-932位于蜜蜂神經連接蛋白2(Neuroligin 2, Nlg 2)基因的內含子2中(Biswasetal., 2008),并且已被證明參與脊椎動物和無脊椎動物的谷氨酸和γ-氨基丁酸能突觸的發(fā)育(Biswasetal., 2008; Chenetal., 2012)。神經可塑性是指由于經驗原因引起的大腦的結構改變。大腦由神經元細胞和神經膠質細胞構成,這些細胞互相連接,通過加強或削弱這些連接,大腦的結構可以發(fā)生改變。氣味學習是一種會導致大腦功能和結構改變的一種行為(Haehnel, 2010; Paffhausenetal., 2020),miRNA可能是通過影響神經可塑性了來影響蜜蜂的氣味學習能力。突出可塑性是蜜蜂學習與記憶的基礎,研究表明,突出可塑性的長期保持有賴于蛋白質的合成(Zoghbi, 2003)。因此,在無脊椎動物模式生物中,miRNA與突觸可塑性、學習和記憶的調控有關。以上表明,miR-124可能是通過影響蜜蜂神經可塑性進而調控氣味學習能力,最終影響其早期記憶,miRNA與神經可塑性之間的聯系需要進一步探索。

綜上,抑制ame-miR-124-3p的表達能夠降低蜜蜂氣味學習的能力,ame-miR-124-3p過表達則能增強蜜蜂的氣味學習能力,這表明ame-miR-124-3p在調控蜜蜂氣味學習能力中起著重要作用。本實驗結果有助于從分子水平上了解蜜蜂氣味學習行為和大腦功能之間的聯系。