基于16S rDNA高通量測序研究電針對腹瀉型腸易激綜合征大鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

王婧雯 鄭淑霞 林晟 許金森

腹瀉型腸易激綜合征(irritable bowel syndrome-diarrhea,IBS-D)是一種反復(fù)發(fā)作、纏綿不愈的慢性功能性腸病,其在臨床上的特征主要是腹瀉、腹痛或腹部不適,根治較難。目前了解到的發(fā)病機制有胃腸功能紊亂、腦腸軸紊亂、內(nèi)臟高敏感性、腸道菌群失調(diào)等。有研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群失調(diào)與IBS-D的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,IBS-D患者的腸道菌群與正常人相比存在明顯差異,常表現(xiàn)為有益菌減少,有害菌增多[1]。臨床在治療IBS-D時采取了很多方法,然而效果卻不盡如人意,針灸以其安全有效簡便的優(yōu)點在眾多治療方法中嶄露頭角。近幾年的研究發(fā)現(xiàn),電針不僅可以改善IBS-D患者的各項癥狀[2],降低內(nèi)臟高敏感性[3-4],而且對于改變腸道菌群結(jié)構(gòu)也有一定幫助[5],但是對于其中具體的分子機制仍存在疑惑。課題組前期研究已經(jīng)表明電針對于IBS-D大鼠具有良好的治療效果,能夠緩解大鼠癥狀,且對于辣椒素受體(TRPV1)以及蛋白酶激活受體-2(partition defective protein-2,PAR-2)通路有影響,但具體對大鼠腸道菌群的影響沒有做出研究,故本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上,從腸道菌群角度探討電針足三里治療IBS-D的機制。

1 材料與方法

1.1動物

選用體質(zhì)量為(200±20)g雄性SPF級SD大鼠25只,由杭州醫(yī)學(xué)院提供[許可證號:SCXK(浙)2019-0002],于福建省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件:室溫26℃左右,濕度60%左右,自由飲食,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始實驗。本實驗嚴格按照《實驗動物管理條例》等文件要求進行。

1.2儀器、設(shè)備

R407型小動物呼吸麻醉機(深圳瑞沃德生命科技公司)、電針儀(華佗牌SDZ-Ⅱ型)、0.25×13 mm的毫針(北京漢醫(yī)醫(yī)療器械有限公司)。

1.3實驗藥品和試劑

番瀉葉飲片(豪州市華鑫中藥飲片科技有限公司)、異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司)、0.9 %氯化鈉注射液(江西科倫藥業(yè)有限公司)。

1.4動物分組及處理

按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組8只、模型組8只、電針組9只。正常組不做處理,正常飲水進食;模型組和電針組進行為期兩周的造模后,對電針組做電針干預(yù)處理,模型組做同等抓取,不做電針處理。

1.5模型制備

采用慢性束縛應(yīng)激聯(lián)合番瀉葉灌服法進行造模[6-7],具體操作方法:動物實驗前10小時禁食不禁水,先給予番瀉葉煎劑(0.3 g/mL)灌胃給藥(10 mL/kg),每日1次,連續(xù)灌胃14天。灌服完番瀉葉煎劑后,即用自制鐵絲網(wǎng)將大鼠固定1小時,期間限制大鼠活動,每日1次,持續(xù)14天。

1.6干預(yù)方法

造模結(jié)束后,電針組選擇雙側(cè)“足三里”穴進行針刺干預(yù)。參照《實驗動物針灸穴位圖譜》進行定位,選取位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下約5 mm處的“足三里”穴。具體方法:采用自制固定器固定大鼠,暴露大鼠足三里的穴區(qū),用0.25 mm×13 mm毫針直刺,深度5 mm,進針后不需要進行手法刺激,連接電針儀進行治療,設(shè)置連續(xù)波[8],頻率2 Hz,電壓2～5 V,強度以大鼠不嘶叫為宜,電針20分鐘,左右足三里交替進行,每日1次,連續(xù)5天。

1.7內(nèi)臟敏感性檢測

檢測前,大鼠禁食不禁水18小時,給予異氟烷麻醉各組大鼠后,用自制工具(三通管連接自制球囊、血壓計、針筒)進行檢測。在球囊上涂充足的液體石蠟后將球囊緩慢插入大鼠肛門約4.5 cm處,然后把大鼠放進自制的20 cm×8 cm×8 cm大小的亞克力透明盒中。等待大鼠完全清醒后,約30分鐘左右檢測大鼠的內(nèi)臟敏感性。測量腹壁回撤反射評分(abdominal withdrawa reflex,AWR)時由針筒向球囊內(nèi)注入空氣,使血壓計讀數(shù)短時間內(nèi)分別達到20、40、60、80 mmHg。不同容積的壓力每個持續(xù)20秒,重復(fù)3次。

AWR評分標(biāo)準(zhǔn)[9]:0分,無明顯行為變化;1分,大鼠身體不動或僅有簡單的頭部運動;2分,大鼠腹部肌肉開始收縮;3分,大鼠下腹壁抬離地面或明顯收縮變平;4分,大鼠腹壁拱起或伴身體、骨盆躬起,臀部抬離地面。

1.8樣本采集與指標(biāo)檢測

干預(yù)結(jié)束后,大鼠禁食不禁水18小時,用高溫烘烤過的手術(shù)器械進行操作。先將大鼠放入小動物呼吸麻醉機誘導(dǎo)盒中使其吸入異氟烷后至麻醉狀態(tài),接著于冰上迅速剪開大鼠的結(jié)腸組織,將留存在大鼠腸道內(nèi)的糞便取出1到2顆裝入備好的無酶EP管內(nèi),隨后置于液氮中保存。

實驗結(jié)束后,將取材得到的大鼠糞便采用16S rDNA高通量測序技術(shù)進行腸道菌群的檢測由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成?；玖鞒?從樣品中提取總基因組DNA,進行16SrDNA區(qū)段擴增,PCR產(chǎn)品定量和鑒定,混合和純化PCR產(chǎn)物,使用無鏈?DNA PCR 樣品制備法生成測序文庫,測序結(jié)果最終進行生物信息分析。

測序完成后,對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行處理,隨后基于有效數(shù)據(jù)進行OTUs 聚類。根據(jù) OTUs 聚類結(jié)果,先做物種注釋,接著進行Beta多樣性分析,比較樣本群落組成的相似性或差異性。糞便基因測序以及生物信息分析流程由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司提供,根據(jù)公司平臺生成的數(shù)據(jù)和圖片進行統(tǒng)計分析處理。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1內(nèi)臟敏感性檢測結(jié)果

由表1可以看出,與空白組相比,模型組大鼠腹壁回撤反射評分明顯升高(P<0.05),提示造模成功。經(jīng)過電針治療后,與模型組相比,在20 mmHg的壓力下,電針組腹壁回撤反射評分明顯降低(P<0.05),而在更大壓力下的變化并不明顯,說明電針可以有效改善IBS-D大鼠的內(nèi)臟敏感性,對于更大壓力變化不明顯的原因有待進一步探索。

表1 三組大鼠電針后不同壓力下腹壁回撤反射評分結(jié)果

2.2OTU分類韋恩圖

通過三組樣本的OTU分布,對樣本的物種分布情況初步判斷,如圖1所示,空白組OTU個數(shù)共有2106,模型組共有1739個,電針組共有2047個OTU數(shù)目;其中模型組與空白組相交疊的OTU數(shù)目明顯低于電針組與空白組交疊數(shù)目。說明經(jīng)過治療后,電針組總OTU數(shù)目以及與空白組交疊數(shù)目均有所上升。

注:K:空白組;M:模型組;D:電針組。

2.3大鼠糞便菌群測序量分析

Shannon稀釋曲線可以用來反應(yīng)各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性,如圖2所示,各組大鼠OTUs不會隨著測序量增加而上升,曲線趨于平坦,說明可以反應(yīng)該樣本絕大多數(shù)微生物多樣性信息,足夠可靠。

圖2 三組大鼠糞便菌群測序量分析Shannon-Wiener圖

2.4大鼠糞便菌群物種組成分析

根據(jù)OTU聚類結(jié)果,分別在綱、屬、種水平上發(fā)現(xiàn),三組的腸道菌群群落結(jié)構(gòu)基本相似,只是構(gòu)成比有差異。通過比較三組大鼠的菌群物種分布情況,說明電針治療可以改善菌群結(jié)構(gòu)。

在綱(class)水平上,擬桿菌綱、梭菌綱、芽孢桿菌綱、δ-變形桿菌綱四種菌綱豐度相對較高。與空白組相比,模型組擬桿菌綱、梭菌綱、δ-變形桿菌綱等均有升高,芽孢桿菌綱則明顯降低。而電針組的菌群結(jié)構(gòu)則在模型組的基礎(chǔ)上有所變化。如圖3A所示。

注:K:空白組;M:模型組;D:電針組。

在屬(genus)水平上,三組中排在前六位的菌屬主要有乳桿菌屬、lachnospiraceae_nk4a136_group(毛螺菌屬)、普雷沃氏菌 Ga6A1屬、Eubacterium_coprostanoligenes_group(真桿菌屬)、Ruminiclostridium_9、Ruminococcaceae_UCG.014等。與空白組相比,模型組乳桿菌屬、真桿菌屬明顯降低,毛螺菌屬、普雷沃氏菌 Ga6A1屬、Ruminiclostridium_9、Ruminococcaceae_UCG.014(瘤胃菌屬)等明顯升高。經(jīng)過電針治療后,可看出以上菌屬豐度均有一定的改善。如圖3B所示。

在種(species)水平上,模型組的菌種結(jié)構(gòu)分布與空白組存在明顯差異,其中約氏乳桿菌的占比明顯減少,而隸屬于灰色部分的其他菌種的占比明顯增加,經(jīng)過電針治療后有所改善。如圖3C所示。

2.5大鼠糞便菌群多樣性比較

Beta多樣性分析用來比較不同樣本在物種多樣性方面的相似程度。采用bray curtis的算法計算樣本間的距離,得到主坐標(biāo)(PCoA)分析的結(jié)果,從圖4可看出模型組與空白組明顯被區(qū)分開(P<0.05),電針組則在兩組之間;且模型組、空白組的組內(nèi)集群效果好,電針組較差。說明了電針組樣本在向空白組靠近,電針可以改善IBS-D大鼠模型的Beta多樣性。

圖4 基于bray curites距離的PCoA分析

3 討論

依照自然屬性分類,人體常見的幾大細菌門主要為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門等,大多數(shù)人腸道菌群中百分之九十九由這四種菌門組成,它們的豐度和構(gòu)成比例對人們的健康影響極大[10]。有研究表明IBS-D患者腸道菌群結(jié)構(gòu)與健康人相比存在失調(diào)情況[11-12],其腸道微生物在糞菌移植治療后,會出現(xiàn)菌群豐度增加、結(jié)構(gòu)改變的情況[13]。近幾年,很多學(xué)者將腸道菌群作為治療IBS-D的靶點,得到了較好的效果。IBS-D患者的腸道微生物失調(diào)總結(jié)起來就是有害菌增加、有益菌減少[14],那么了解哪些有害菌增加,以及又有哪些有益菌減少是非常有必要的。目前,大多研究都認為,厚壁菌綱、擬桿菌門等豐度增加,乳桿菌屬、雙歧桿菌等豐度降低會引起IBS-D[15-17]。眾所周知,IBS-D患者的典型癥狀主要是腹痛、腹瀉、腹脹等,這與內(nèi)臟高敏感性相關(guān)[18],曾有學(xué)者提出其腹痛癥狀與腸道菌群結(jié)構(gòu)關(guān)系密切,在于腸道菌群會產(chǎn)生能加重腹痛癥狀的乙酸鹽[19];同時,也有人指出腹瀉癥狀與某些菌群密切相關(guān), 可能是因為一些腸道菌群能夠產(chǎn)生影響腸道滲透性的脂多糖[20]。因此,通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂的情況,可以緩解IBS-D的癥狀。

本實驗通過慢性束縛應(yīng)激聯(lián)合番瀉葉灌服法構(gòu)建IBS-D大鼠模型,實驗結(jié)果證明電針足三里可以通過改善大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)達到治療大鼠的目的。通過分析各組大鼠糞便菌群在不同水平上的物種組成的結(jié)果發(fā)現(xiàn),IBS-D大鼠糞便菌群的物種構(gòu)成與空白組大鼠存在明顯差異,這與其他人的研究結(jié)果一致[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn),乳桿菌屬明顯降低,且其中約氏乳桿菌種下降非常明顯,乳桿菌屬做為有益菌,可以對抗機體致病微生物,改善腸道屏障功能,預(yù)防和治療腹瀉。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)模型組的普雷沃氏菌 Ga6A1屬豐度明顯高于其他兩組,Prevotellaceae_Ga6A1_group隸屬于普氏菌屬,普雷沃氏菌可以加快碳水化合物發(fā)酵,誘發(fā)內(nèi)臟超敏反應(yīng),甚至可能通過增加腸道通透性的方式加劇腹痛腹瀉的癥狀。基于此,普雷沃氏菌的增加與內(nèi)臟高敏感性呈正相關(guān)。因此,乳桿菌屬的降低、普雷沃氏菌的增加都可能是IBS-D的起病原因。

本實驗通過電針足三里穴發(fā)現(xiàn),IBS-D大鼠具有內(nèi)臟高敏的反應(yīng),且證實了其具體的內(nèi)在機制可能與腸道菌群結(jié)構(gòu)有關(guān);明顯可以看出模型組相較空白組而言有降低或增加的腸道微生物,在電針組中或多或少得到了改善。本研究證明了高通量測序技術(shù)可以滿足大鼠腸道菌群的檢測需求,為深入研究電針足三里穴治療IBS-D提供了參考思路,但由于受客觀條件的影響,并未對實驗中改變明顯的菌群進行功能預(yù)測,未來可進一步研究菌群的功能基因在代謝途徑和蛋白功能上的差異和變化。