姜愛文,郭鴻運,吳望軍,劉紅林

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)

我國是世界上最大的豬肉消費國,豬(Susscrofa)作為我國重要的經(jīng)濟(jì)動物,其繁殖性狀、豬肉產(chǎn)量和肉質(zhì)性狀的提高始終是豬遺傳育種工作的主要方向[1-2]。傳統(tǒng)的豬育種技術(shù)依托于純系選育和配套雜交等方法,對生長速度、飼料轉(zhuǎn)化率等遺傳性狀的改良,往往需要多代雜交和選擇才能獲得優(yōu)質(zhì)個體[3]。傳統(tǒng)育種所需時間長,無法突破物種界限引入其他新型性狀,且其在瘦肉率、肌內(nèi)脂肪含量(intramuscular fat,IMF)、背膘厚等數(shù)量性狀的選擇上準(zhǔn)確度低、選育費用高。在快速發(fā)展的當(dāng)今社會,傳統(tǒng)育種方法已無法滿足人們?nèi)找嬖鲩L的消費需求。分子育種技術(shù),如全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study,GWAS)的發(fā)展,可將基因型的多樣性與表型性狀相結(jié)合,以獲得影響復(fù)雜性狀的分子遺傳標(biāo)記和候選基因。Fan等[4]利用GWAS發(fā)現(xiàn)黑素皮質(zhì)素受體4(melanocortinc 4 receptor,MC4R)是影響背膘厚的候選基因;Luo等[5]鑒定到了與肉質(zhì)性狀有關(guān)的47個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位點;韓云珍等[6]發(fā)現(xiàn)MC4R基因的多態(tài)性與美系大白豬的胴體性狀密切相關(guān),這些研究為加速常規(guī)育種進(jìn)程提供了可借鑒的信息。近年來,隨著基因編輯技術(shù)的興起,人為干預(yù)基因組信息,并對目的基因進(jìn)行插入或刪除,可以直接、迅速培育出特定性狀的家畜,也可以打破生殖隔離,實現(xiàn)不同物種之間的交流。包括轉(zhuǎn)基因、基因編輯在內(nèi)的“分子設(shè)計育種”已成為分子育種的重要研究方向。此外,由于體型大小和特征與人類相似,豬也被認(rèn)為是器官移植和人類疾病的理想模型[1,7-8]。因此,豬基因編輯技術(shù)的研究與應(yīng)用不僅能加快家畜遺傳育種的進(jìn)程,也對人類再生醫(yī)學(xué)具有重要意義。

基因組編輯技術(shù)主要包括位點定向鋅指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(transcription activatorclike effector nucleases,TALEN)和聚類規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列/相關(guān)核酸酶Cas9(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats,CRISPR/Cas9)3種[9-11]。其中,CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于具有成本低、操作簡單、效率高等優(yōu)點,已成為目前最常用的基因編輯方法[12]?；蚪M編輯技術(shù)的發(fā)展加速了動物育種的進(jìn)程。與傳統(tǒng)的雜交方法不同,基因組編輯可以在小鼠、人、羊、豬等多種物種中快速有效修改目的基因序列[13]。目前,基因編輯豬在抗病性和提高肉質(zhì)等方面取得了很大進(jìn)展。肌肉生長抑制素(myostatin,MSTN)是骨骼肌生長發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子,其失活可誘導(dǎo)骨骼肌肥大并促進(jìn)肉類生產(chǎn)[14-15]。與野生型豬相比,MSTN基因敲除豬具有更高的肌生成素表達(dá)和明顯的肌間邊界,能顯著促進(jìn)豬的生長,增加瘦肉產(chǎn)量[16-17]。清道夫受體(cluster of differentiation,CD163)是豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)病毒的受體,CD163基因的敲除可以有效阻止豬感染PRRS病毒。Tanihara等[18]利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了CD163基因敲除豬,獲得了PRRS病毒耐受模型。

基因編輯在應(yīng)用轉(zhuǎn)化中的最大阻礙源于對其安全性的擔(dān)憂,如何保證外源基因高效插入并表達(dá),而又不會影響基因組本身的功能成為應(yīng)用基因敲入技術(shù)的基礎(chǔ)。ROSA26是一種非編碼RNA。在小鼠中,ROSA26位于第6號染色體,最早在ROSA β geo26的小鼠品系中發(fā)現(xiàn)[19]。在后續(xù)研究中,研究人員發(fā)現(xiàn)ROSA26位點隨機(jī)插入LacZ報告基因后,在小鼠的幾乎所有組織中均能檢測到β-半乳糖苷酶的高表達(dá),且外源基因插入的小鼠生長與繁殖性能均無異常,ROSA26位點附近的基因表達(dá)也未受影響[20]。因此,ROSA26被認(rèn)為是外源基因插入的“安全位點”,可以使外源片段安全、高效插入基因組。除了誘導(dǎo)外源基因的廣泛表達(dá)外,ROSA26位點還可以結(jié)合Cre-LoxP條件敲入系統(tǒng),誘導(dǎo)外源基因在特定組織或特定時間表達(dá)[21-22]。2014年,Li等[23]通過多個物種間比較,確定了豬ROSA26啟動子區(qū)的序列,并利用TALEN技術(shù)成功地在豬ROSA26位點定點插入了Cre重組酶報告基因。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)在豬上的應(yīng)用,豬防御素2(porcine β defensing 2,PBD2)、干擾素誘導(dǎo)基因S-腺苷甲硫氨酸基區(qū)域蛋白2(sadicalS-adenosyl methionine domain containing 2,RSAD2)等轉(zhuǎn)基因豬相繼獲得[24-25]。

雖然基因編輯豬已成功獲得,但低敲除效率阻礙了轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生過程中外源基因的敲入效率,并降低了體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移(somatic cell nuclear transfer,SCNT)的應(yīng)用。因此,建立一個穩(wěn)定、高效的基因敲除系統(tǒng)對促進(jìn)基因編輯在豬上的應(yīng)用是必要的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬胎兒成纖維細(xì)胞(PEF)由本課題組分離、培養(yǎng)、建立。PX458-cas9-egfp質(zhì)粒和PX459-cas9-puro質(zhì)粒由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)于童贈送;2個質(zhì)粒均為cas9和sgRNA二合一質(zhì)粒,其中PX458-cas9-egfp質(zhì)粒可表達(dá)綠色熒光,在本研究中用于PEF電轉(zhuǎn)體系的篩選;PX459-cas9-puro用于構(gòu)建豬ROSA26的sgRNA,以實現(xiàn)對PEF基因組編輯。RGS-CR質(zhì)粒由廣西大學(xué)唐小川贈送。Cas9蛋白(A50576)和NeonTM轉(zhuǎn)染試劑盒(MPK10025)購自ThermoFisher Scientific。與Cas9蛋白在體外形成RNP的sgRNA序列為sgRNA2序列(不含PAM),序列由ThermoFisher Scientific合成并修飾后使用。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬ROSA26打靶位點的選擇根據(jù)豬ROSA26的基因組序列,在其啟動子區(qū)域(含第一外顯子)設(shè)計2條sgRNA(sgRNA1和sgRNA2)。sgRNA1/sgRNA2的具體序列為5′-AAAGTGTGCTGTGTATTTTG-3′/5′-AGAGAAGAGGCTGTGCTCTG-3′。

1.2.2 PX459-cas9-sgRNA打靶載體的構(gòu)建根據(jù)sgRNA1和sgRNA2的序列,兩側(cè)添加BbsⅠ的黏性末端,合成sgRNA上游引物和下游引物(表1);上、下游引物磷酸化(NEB,M0201S)與退火后(NEB,B0202S)形成帶有BbsⅠ黏性末端的短DNA雙鏈。限制性內(nèi)切酶BbsⅠ(NEB,R0539S)切割PX459-cas9-puro載體,再利用膠回收試劑盒(OMEGA,D2500-02)回收PX459-cas9-puro大片段。將sgRNA退火形成的短DNA雙鏈與回收的PX459-cas9-puro大片段使用T4連接酶(NEB,M0202S)連接,隨后經(jīng)感受態(tài)細(xì)胞DH5α轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌液測序。對測序正確的菌液提取質(zhì)粒(TIANGEN,DP117)。

表1 本試驗所用引物序列Table 1 Sequence of primers used in this test

1.2.3 RGS-sgRNA載體的構(gòu)建RGS-CR由pegfp-N1改造而成,紅色熒光蛋白(red fluorescent protein,RFP)和增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)由CMV啟動子啟動表達(dá)。在egfp序列前引入EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點,可使sgRNA靶序列在2個酶切位點間插入。在egfp前引入終止密碼子,因此當(dāng)沒有Cas9/sgRNA切割靶位點時,EGFP不表達(dá);當(dāng)Cas9/sgRNA切割靶位點時,終止密碼子發(fā)生移碼突變,可使egfp有2/3概率處于開放閱讀框內(nèi)而發(fā)生表達(dá)。根據(jù)2條sgRNA的序列,在RGS-sgRNA上游引物中引入EcoR Ⅰ的酶切位點,在RGS-sgRNA下游引物中引入BamHⅠ的酶切位點,分別合成RGS-sgRNA的上、下游引物(表1)。上、下游引物退火形成短DNA雙鏈;RGS-CR骨架序列用EcoRⅠ(NEB,R3101S)和BamHⅠ(NEB,R3136S)酶切后回收,使用T4連接酶連接,隨后經(jīng)感受態(tài)細(xì)胞DH5α轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌液測序。對測序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染PEF細(xì)胞在含15%胎牛血清(Gibco,16000-044)和雙抗(Gibco,15140-122)的DMEM培養(yǎng)基(Hyclnoe,SH30022.01B)中培養(yǎng),待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時,用PBS(Hyclone,SH30256.01B)洗2次,胰酶(Gibco,25200-072)消化3 min,隨后加入15%培養(yǎng)基終止消化。消化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管(Corning,430791)中,離心后獲得細(xì)胞沉淀;將細(xì)胞沉淀用PBS重懸后離心,獲得細(xì)胞沉淀。在24孔板上,細(xì)胞沉淀用5 μL Buffer R重懸,使細(xì)胞密度達(dá)到1.0×107mL-1;用5 μL Buffer R分別稀釋 1 μg PX458-cas9-egfp質(zhì)粒和1 μg PX459-cas9-puro質(zhì)?；駽as9/sgRNA2復(fù)合物(1 250 ng Cas9+240 ng sgRNA2);將含有細(xì)胞的Buffer R與含有質(zhì)?；虻鞍椎腂uffer R混勻,使用Neon電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(MPK5000,Invitrogen)進(jìn)行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)3 d后,收集細(xì)胞,提取基因組DNA后進(jìn)行打靶驗證。取293T細(xì)胞在含10%胎牛血清和雙抗的培養(yǎng)基中培養(yǎng),待細(xì)胞融合度至80%左右,使用Lip3000(InvitrogenTM,L3000015)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染3 d后在熒光倒置相差顯微鏡(Olympus,CKX41)下觀察熒光。綠色熒光的激發(fā)光為488 nm,紅色熒光的激發(fā)光為567 nm。

1.2.5 打靶效率檢測PX459-cas9-sgRNA2質(zhì)?；駽as9/sgRNA2核糖核蛋白復(fù)合體轉(zhuǎn)染3 d后,PEF細(xì)胞經(jīng)PBS洗1次后收集細(xì)胞沉淀。使用基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN,DP304)提取PEF細(xì)胞的基因組DNA。將PX459-cas9-sgRNA2質(zhì)?；駽as9/sgRNA2打靶后的基因組DNA濃度統(tǒng)一至30 ng·μL-1?；蚪MDNA使用Q5高保真酶(NEB,S0494)對打靶區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為Target-F/R(表1),擴(kuò)增片段的大小為360 bp。擴(kuò)增體系:Q5高保真酶12.5 μL,10 μmol·L-1Target-F/R各1.25 μL,基因組DNA 1 μL,無DNA核酸酶水9 μL?；靹蛏鲜鲈噭?再按照如下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增:98 ℃ 30 s;98 ℃ 50 s,68 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,35個循環(huán);72 ℃ 2 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,確定條帶位置正確后進(jìn)行TA克隆連接與測序。

1.2.6 脫靶位點鑒定sgRNA2潛在的脫靶位點(評分>1.5)見表2。為了檢測sgRNA2的脫靶效應(yīng),經(jīng)PX459-cas9-sgRNA2切割后的PEF細(xì)胞被收集并分別用引物進(jìn)行擴(kuò)增。引物的序列見表3。擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物進(jìn)行桑格爾測序分析。

表2 脫靶位點信息Table 2 Information of off-target loci

表3 脫靶引物Table 3 Off-target primers

1.2.7 測序分析桑格爾測序分析由北京擎科生物科技有限公司完成。PX459-cas9-sgRNA質(zhì)粒鑒定使用測序引物CAG-R(表1),RGS-sgRNA質(zhì)粒鑒定使用測序引物CMV-F(表1),基因組DNA打靶檢測的測序引物為Target-F/R(表1),脫靶檢測采用正向引物進(jìn)行測序(表3)。測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN比對分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

圖1 PX459-cas9-sgRNA1和PX459-cas9-sgRNA2質(zhì)粒的構(gòu)建及測序驗證Fig.1 Construction and sequencing validation of PX459-cas9-sgRNA1 and PX459-cas9-sgRNA2 plasmidsa、b.分別把sgRNA1和sgRNA2的上、下游引物退火后構(gòu)建在PX459-cas9-puro質(zhì)粒上,獲得PX459-cas9-sgRNA1和PX459-cas9-sgRNA2質(zhì)粒 The forward and reverse primer of sgRNA1 and sgRNA2 were annealed and then constructed into PX459-cas9-puro to obtain PX459-cas9-sgRNA1 and PX459-cas9-sgRNA2 plasmids;c、d.分別對PX459-cas9-sgRNA1和PX459-cas9-sgRNA2質(zhì)粒進(jìn)行桑格爾測序鑒定sgRNA1和sgRNA2插入片段 Identification of sgRNA1 and sgRNA2 sequences in PX459-cas9-sgRNA1 and PX459-cas9-sgRNA2 plasmids by Sanger sequencing.

2 結(jié)果與分析

2.1 PX459-cas9-sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建和驗證

針對豬ROSA26位點的啟動子區(qū)(含第一外顯子)設(shè)計sgRNA1和sgRNA2,再將sgRNA序列插入PX459-cas9-puro質(zhì)粒。sgRNA1和sgRNA2的質(zhì)粒圖譜見圖1-a和圖1-b。桑格爾測序結(jié)果表明,sgRNA1和sgRNA2均成功插入PX459質(zhì)粒,分別獲得PX459-cas9-sgRNA1和 PX459-cas9-sgRNA2(圖1-c,d)。

2.2 RGS-sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建和驗證

將sgRNA1和sgRNA2的靶序列及其PAM序列插入RGS-CR質(zhì)粒。sgRNA1和sgRNA2的質(zhì)粒圖譜見圖2-a和圖2-b。桑格爾測序結(jié)果表明,sgRNA1和sgRNA2的靶序列及其PAM序列插入成功,分別獲得RGS-sgRNA1和RGS-sgRNA2質(zhì)粒(圖2-c,d)。

圖2 質(zhì)粒RGS-sgRNA1和RGS-sgRNA2的構(gòu)建及測序驗證Fig.2 Construction and sequencing validation of RGS-sgRNA1 and RGS-sgRNA2 plasmidsa、b.RGS-sgRNA1和RGS-sgRNA2的上、下游引物退火后構(gòu)建在RGS-CR質(zhì)粒上,獲得RGS-sgRNA1和RGS-sgRNA2質(zhì)粒The forward and reverse primer of RGS-sgRNA1 and RGS-sgRNA2 are annealed and then constructed into RGS-CR to obtain RGS-sgRNA1 and RGS-sgRNA2 plasmid;c、d. 對RGS-sgRNA1和RGS-sgRNA2質(zhì)粒進(jìn)行桑格爾測序鑒定sgRNA1和sgRNA2插入片段 Identification of sgRNA1 and sgRNA2 sequence in RGS-sgRNA1 and RGS-sgRNA2 plasmids by Sanger sequencing.

2.3 sgRNA打靶效率的篩選

為比較sgRNA1和sgRNA2的打靶效率,PX459-cas9-sgRNA1/RGS-sgRNA1及PX459-cas9-sgRNA2/RGS-sgRNA2分別共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,并以RGS-CR為對照。RGS-CR質(zhì)粒本身發(fā)紅色熒光,而被打靶后能同時發(fā)出紅色熒光和綠色熒光。結(jié)果表明,3組處理均可發(fā)出紅色熒光,表明RGS轉(zhuǎn)染成功(圖3-a),且細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率在3組之間無顯著差異(圖3-b)。RGS-CR組無綠色熒光,但PX459-cas9-sgRNA1/RGS-sgRNA1和PX459-cas9-sgRNA2/RGS-sgRNA2轉(zhuǎn)染后均能發(fā)出綠色熒光(圖3-a),這表明sgRNA1和sgRNA2都能對各自的靶序列進(jìn)行打靶。但sgRNA1的打靶效率顯著低于sgRNA2(3-c),表明sgRNA2具有更高的打靶效率。因此,后續(xù)使用sgRNA2對豬PEF基因組進(jìn)行打靶。

2.4 轉(zhuǎn)染條件的篩選

為獲得較高的PEF轉(zhuǎn)染效率,使用Neon電轉(zhuǎn)系統(tǒng),將PX458-cas9-egfp轉(zhuǎn)染至PEF中,并對合適的電轉(zhuǎn)條件進(jìn)行探索(圖4-a)。由于PX458-cas9-egfp轉(zhuǎn)染成功后細(xì)胞內(nèi)可檢測到綠色熒光,通過計算EGFP陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例計算各電轉(zhuǎn)條件的電轉(zhuǎn)效率。由圖4結(jié)果可知:1 500 V、3 t、10 ms的電轉(zhuǎn)條件具有較強的細(xì)胞存活率,且細(xì)胞生長狀態(tài)良好;1 600與1 650 V的電壓使細(xì)胞形態(tài)明顯皺縮,存活細(xì)胞量顯著降低(圖4-a,b);此外,在1 500 V、3 t、10 ms的電轉(zhuǎn)條件下有較高的電轉(zhuǎn)效率(圖4-a,c)。因此,后續(xù)采用1 500 V、3 t、10 ms的條件對PEF進(jìn)行電轉(zhuǎn)。

2.5 脫靶鑒定

收集經(jīng)PX459-cas9-sgRNA2打靶后的PEF細(xì)胞,提取基因組DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,利用NCBI獲得的豬基因組序列并進(jìn)行桑格爾測序。結(jié)果(圖5)顯示sgRNA2未發(fā)生脫靶。

2.6 PX459-cas9-sgRNA2與Cas9/sgRNA2打靶效率的比較

采用1 500 V、3 t、10 ms的電轉(zhuǎn)條件,分別將PX459-cas9-sgRNA2質(zhì)粒和Cas9/sgRNA2體系電轉(zhuǎn)至PEF細(xì)胞中,再收集的DNA經(jīng)擴(kuò)增鑒定后使用Target-F/R引物進(jìn)行桑格爾測序。測序結(jié)果(圖6)表明,PX459-cas9-sgRNA2的打靶效率為15.67%,而Cas9/sgRNA2的打靶效率為33.33%。

圖3 sgRNA打靶效率的篩選Fig.3 Screening sgRNA with higher efficiencya.PX459-cas9-sgRNA與RGS-sgRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至293T細(xì)胞中(紅色熒光代表轉(zhuǎn)染后效果,綠色熒光代表切割后效果,標(biāo)尺=1 000像素)Co-transfection of PX459-cas9-sgRNA with RGS-sgRNA into 293T cells(Transfection efficiency is indicated by red fluorescent protein RFP,and cutting efficiency is indicated by green fluorescent protein. Scar bar=1 000 pixel);b.各組的轉(zhuǎn)染效率Transfection efficiency among each group;c.各組的打靶效率Targeting efficiency among each group.不同字母表示不同組別間存在顯著差異(P<0.05)。Different letters indicate significant difference among groups(P<0.05).

圖4 Neon系統(tǒng)電轉(zhuǎn)染條件的篩選Fig.4 Screening transfection conditions for Neon transfection systema.不同轉(zhuǎn)染條件下PX458-egfp質(zhì)粒效果觀察(標(biāo)尺=500像素)Effect of PX458-egfp plasmid under different transfection conditions(Scar bar=500 pixel);b.不同轉(zhuǎn)染條件下細(xì)胞存活率Cell survival rate under different transfection conditions;c.不同轉(zhuǎn)染條件下的轉(zhuǎn)染效率Transfection efficiency under different transfection conditions.

圖5 sgRNA2排名前4位潛在脫靶位點的桑格爾測序檢測Fig.5 Top 4 of potential off-target identification of sgRNA2 by Sanger sequencing

圖6 PX459-cas9-sgRNA和Cas9/sgRNA系統(tǒng)切割打靶效率的比較Fig.6 Comparison of targeting efficiency between PX459-cas9-sgRNA plasmid and Cas9/sgRNAa.桑格爾測序檢測PX459-cas9-sgRNA2質(zhì)粒打靶豬胎兒成纖維細(xì)胞基因組的效率(第1行為野生型基因組序列,打靶后的序列位于第1行下面)The genome DNA sequence is used to analyze indels by Sanger sequencing in the group of PX459-cas9-sgRNA2 plasmid(The wild-type sequence is located on the first line(wt),and the mutated sequences are arranged below;b.PX459-cas9-sgRNA2打靶后的PEF基因組靶位點序列 Target sequence of PEF genome after PX459-cas9-sgRNA2 cleavage;c.桑格爾測序檢測Cas9/sgRNA體系打靶豬胎兒成纖維細(xì)胞基因組的效率(第1行為野生型基因組序列,打靶后的序列位于第1行下面)The genome DNA sequence is used to analyze indels by Sanger sequencing in the group of Cas9/sgRNA(The wild-type sequence is located on the first line(wt),and the mutated sequences are arranged below;d.Cas9/sgRNA2體系打靶后的PEF基因組靶位點序列 Target sequence of PEF genome after Cas9/sgRNA2 cleavage;e.2組的打靶效率比較Cut efficiency between two groups.

3 討論

隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展,基因編輯技術(shù)已經(jīng)在多個動物物種上應(yīng)用,包括小鼠、雞、兔子、豬、羊[26-30]。目前基因編輯動物的獲得主要有2種方式。一種是將cas9 mRNA和sgRNA共注射到胚胎干細(xì)胞中產(chǎn)生基因編輯動物。然而,豬的胚胎干細(xì)胞至今未成功建系,因此通常采用第二種方式,即對豬體細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行CRISPR/Cas9打靶,并篩選陽性細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬[31]。PEF細(xì)胞是常用的供體細(xì)胞類型,因此,對PEF進(jìn)行基因編輯是轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)的第一步。外源基因敲入效率低始終是轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的主要問題。研究發(fā)現(xiàn),含有Cas9切割位點的供體質(zhì)粒可以有效促進(jìn)外源基因整合至基因組[32]。此外,基于微同源介導(dǎo)的末端連接(microhomology-mediated end joining,MMEJ)的方法,以及基于同源末端連接(homology-mediated end joining,HMEJ)的方法都被證明能顯著提高外源基因的敲入效率[33-35]。然而,大多數(shù)研究都是在斑馬魚和老鼠身上進(jìn)行的,而關(guān)于豬基因編輯技術(shù)的研究較少。

轉(zhuǎn)基因豬在農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α,PGC1α)轉(zhuǎn)基因豬表現(xiàn)出較高的肉質(zhì)品質(zhì)[36]。此外,轉(zhuǎn)黏液病毒抗性(myxovirus-resistant,Mx)基因的豬也被成功用于保護(hù)豬免受豬瘟病毒(classical swine fever virus,CFSV)的感染[37]。人白蛋白轉(zhuǎn)基因豬在人類抗病性中發(fā)揮重要作用[38]?；蚯萌胛稽c的選擇對轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)育和健康具有重要意義,ROSA26是外源性基因敲入的首選位點,其在多個物種中具有保守性[39]。許多外源基因敲入動物通過插入ROSA26位點而成功建立[40]。目前已經(jīng)確定了豬ROSA26的啟動子序列,研究人員發(fā)現(xiàn)豬ROSA26的啟動子可以通過避免DNA甲基化的方式來驅(qū)動基因高而穩(wěn)定的表達(dá)[41]。

盡管轉(zhuǎn)基因豬已經(jīng)成功生產(chǎn),但其效率仍然很低。高效的PEF打靶效率是外源基因成功導(dǎo)入的必要條件。目前豬的基因打靶效率在不同的研究中差異較大,Li等[42]針對豬ROSA26第一外顯子與第二外顯子之間的區(qū)域設(shè)計了14條sgRNAs,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的sgRNA的打靶效率差異較大,且最高的sgRNA打靶效率能達(dá)到54.3%,對豬中心體蛋白112(centrosomal protein 112,CEP112)基因的打靶結(jié)果也顯示最高的打靶效率可達(dá)到36.7%[43]。Xie等[39]研究發(fā)現(xiàn),將cas9 mRNA和sgRNA微注射到豬的孤雌胚胎中,經(jīng)桑格爾測序鑒定的突變效率僅為14.8%,而利用CRISPR/Cas9質(zhì)粒對PEF細(xì)胞進(jìn)行黑素皮質(zhì)素受體3(melanocortin receptor 3,MC3R)基因的敲除,也只能實現(xiàn)15.28%的雙等位基因突變[44]。以上研究表明,雖然在某些基因的某些位點CRISPR/Cas9的打靶效率已經(jīng)較高,但對于較難插入外源區(qū)域的位點或基因,提高其打靶效率仍然是必要的。目前關(guān)于豬ROSA26位點的打靶區(qū)域,均設(shè)計在第一外顯子與第二外顯子區(qū)域,在本研究中,我們針對豬ROSA26的啟動子區(qū)進(jìn)行打靶,并設(shè)計了2條靶向豬ROSA26啟動子的sgRNAs;利用RGS-CR質(zhì)粒篩選打靶效率較高的sgRNA。組織特異性啟動子可驅(qū)動基因在特定組織中表達(dá),而產(chǎn)生組織特異性轉(zhuǎn)基因動物對于基因治療至關(guān)重要[45]。在本研究中,豬ROSA26位點啟動子的切割破壞了ROSA26啟動子的活性,從而允許外源的組織特異性啟動子的敲入,這為后續(xù)研究豬的外源基因組織特異性表達(dá)提供了參考方向。更重要的是,本研究結(jié)果表明,與傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9質(zhì)粒相比,利用Cas9/sgRNA體外形成的RNP復(fù)合體,可以顯著提高sgRNA的打靶效率,為提高后續(xù)基因編輯效率奠定基礎(chǔ)。

綜上所述,本試驗成功構(gòu)建了PX459-cas9-sgRNA和RGS-sgRNA,且sgRNA2的打靶效率高于sgRNA1,且sgRNA2 不存在脫靶效應(yīng)。1 500 V、3 t、10 ms的電轉(zhuǎn)條件對PEF細(xì)胞而言具有較好的轉(zhuǎn)染效果。Cas9/sgRNA體外直接形成RNP的打靶效率比CRISPR/Cas9質(zhì)粒提高了約1倍,這對于促進(jìn)基因編輯在豬的應(yīng)用和提高未來SCNT的效率和外源基因敲入具有重要意義。