毛林夕　王夢云　楊皓宇　覃艷　王煒

〔摘要〕 目的 制備谷胱甘肽（glutathione， GSH）響應的香豆素類熒光探針并應用于中藥GSH調節(jié)劑的篩選。方法 以香豆素為熒光團，2-氯-5-硝基嘧啶為淬滅基團，構建GSH響應的熒光探針（HCN），通過紫外、高效液相色譜、熒光光譜和核磁等表征手段確定HCN的結構及其對GSH響應的可行性、特異性、靈敏性，以確定最佳響應條件。通過MTT實驗及細胞成像考察HCN的細胞毒性及胞內熒光信號。以GSH商品化消耗劑（NEM）為陽性對照，選取民族藥血筒中16種化合物為篩選對象，通過HCN檢測所選化合物對GSH水平的調控能力，并進一步采用分子對接手段驗證篩選結果的可靠性。結果 核磁譜表明HCN合成成功，能與GSH特異性響應并呈線性關系，且HCN的最佳反應溫度和反應時間分別為37 ℃和100 min。MTT實驗表明，在HepG2細胞中，與0 μmol/mL相比，80 μmol/mL和100 μmol/mL的HCN降低了細胞活力（P＜0.05），說明HCN對HepG2細胞增殖有影響；在HL-7702細胞中，與0 μmol/mL相比，各濃度HCN對細胞活力影響微弱（P>0.05），說明HCN對HL-7702細胞增殖無影響。在細胞成像實驗中，與0 μmol/mL相比，各濃度HCN的熒光強度增強（P＜0.05）。在藥物篩選中，與control相比，血筒中的化合物五內酯B、南五內酯和異南內酯A下調了GSH的水平（P＜0.001，P＜0.05）。分子對接結果表明，血筒中的化合物五內酯B、南五內酯和異南內酯A與GSH形成了2個及以上的氫鍵，結合能分別為-3.94、-3.64、-4.87 kal/mol。結論 本文設計合成了一種GSH響應的香豆素類探針HCN，HCN具有良好的GSH響應特異性、靈敏性、光穩(wěn)定性及低細胞毒性等特點，能應用于中藥GSH調節(jié)劑的篩選，該研究可為熒光探針技術服務與中藥活性成分篩選提供參考。

〔關鍵詞〕 熒光探針；香豆素；谷胱甘肽；生物硫醇；天然產(chǎn)物；血筒

〔中圖分類號〕R284；R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.012

Preparation of GSH-responsive probe and its application in screening natural medicine

MAO Linxi， WANG Mengyun， YANG Haoyu， QIN Yan， WANG Wei

College of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To prepare the glutathione （GSH）-responsive coumarin fluorescent probe and apply it to screen GSH regulators in Chinese medicine. Methods A GSH-responsive fluorescent probe （HCN） was constructed by coumarin as fluorophore and 2-chloro-5-nitropyrimidine as quench group. The structure of HCN and the feasibility， specificity， and sensitivity of its response to GSH were determined by ultraviolet-visible （UV-Vis）， high performance liquid chromatography （HPLC）， fluorescence spectrum and nuclear magnetic resonance （NMR） spectrum， so as to ascertain the optimal response conditions. The cytotoxicity and intracellular fluorescence signal of HCN were examined by MTT assay and cell imaging， respectively. Using GSH commercial consumable （NEM） as the positive control， 16 compounds of Xuetong in the ethnic medicine were selected as screening objects. The regulatory ability of the selected compounds on GSH level was checked by HCN， and the reliability of the screening results was further verified by molecular docking method. Results The NMR spectrum showed that HCN was synthesized successfully and could respond to GSH in a linear relationship. The optional temperature and time of reaction of HCN were 37 ℃ and 100 min， respectively. MTT assay showed that， in HepG2 cells， HCN of 80 μmol/mL and 100 μmol/mL lowered the cell viability compared with HCN of 0 μmol/mL （P<0.05）， which indicated the influence of HCN on HepG2 cell proliferation. While in HL-7702 cells， HCN with various concentrations has mild effects on cell viability compared with HCN of 0 μmol/mL （P>0.05）， which indicated that HCN had no effects on HL-7702 cell proliferation. Cell imaging experiment demonstrated that HCN of various concentrations possessed higher fluorescence intensity compared with HCN of 0 μmol/mL （P<0.05）. Schisanlactone B， kadsudilactone， and heteroclitalactone A of Xuetong down-regulated GSH level compared with control in drug screening （P<0.001， P<0.05）. Molecular docking results showed that two or more hydrogen bonds were formed by Schisanlactone B， kadsudilactone， and heteroclitalactone A of Xuetong， and GSH， with the binding energies of -3.94， -3.64， and -4.87 kal/mol. Conclusion In this paper， HCN， a GSH-responsive coumarin fluorescent probe， was designed and synthesized. It is featured by good GSH response specificity， sensitivity， light stability and low cytotoxicity， which could help screen GSH regulators of Chinese medicines. This study aimed to provide reference for fluorescence probe technology to screen active ingredients in Chinese medicines.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 fluorescent probe; coumarin; glutathione; biological thiols; natural products; Xuetong

谷胱甘肽（glutathione， GSH）作為細胞中最豐富的生物硫醇，1～10 mmol/L的含量在維持人體正常生理活動方面發(fā)揮著重要作用。因此，檢測體內GSH具有重要意義[1-3]。現(xiàn)有分析方法如高效液相色譜法[4-6]、質譜法[7-9]、熒光探針法[10-12]、電化學法[13]和量熱法[14]已被廣泛用于GSH水平檢測。其中，熒光探針法具有操作方便、成本低和靈敏可視等特點，已成為目前檢測GSH的主要手段。GSH是細胞內氧化還原活動、細胞內信號轉導和基因調控的重要單位[15]，常為疾病診斷和治療的重要生物標志物。癌癥、心臟病和肝損傷等疾病，可能都是由GSH水平異常引起的[16-17]。因此，開發(fā)定量檢測GSH水平的熒光探針方法具有重要的疾病診斷和治療意義[18-19]。

熒光探針主要由熒光團、連接基團和識別基團組成，熒光團可用來發(fā)射熒光信號，其結構多含有共軛體系，識別基團是熒光探針與分析物特異性識別的位點，連接基團的作用是將熒光團和識別基團連接起來[20]。熒光分子探針檢測方法具有選擇性高、靈敏度高、肉眼可見、操作簡單和成本低等特點，已成為生物學分析、有機合成與代謝和臨床診斷的重要手段之一[21]。香豆素的基本結構是苯并吡喃環(huán)，為一種內酯化合物，具有熒光量子產(chǎn)率高、斯托克斯位移大和光學性能好等優(yōu)點[22]。本實驗以7-羥基香豆素為熒光基團、2-氯-5-硝基嘧啶為熒光淬滅基團，合成具有GSH識別位點的香豆素型探針HCN。研究通過合成一種開關型熒光探針，從而可視化地對細胞內外GSH的水平變化進行定量檢測，并據(jù)此快速地篩選具有GSH水平調控能力的中藥活性成分，為GSH相關疾病的調控尋找新的候選中藥活性分子。

1 材料與方法

1.1? 實驗試劑

GSH（上海源葉生物科技有限公司，批號：Z17S10C97807）；7-羥基香豆素（批號：I1818049）、2-氯-5-硝基嘧啶（批號：G2123334）均購自上海阿拉丁試劑公司；N，N-二甲基甲酰胺（上海麥克林生化科技股份有限公司，批號：C13331861）；吡啶（批號：20150930）、二氯甲烷（批號：20220119）、石油醚（批號：20210914）、二甲基亞砜（批號：20220218）均購自國藥集團化學試劑有限公司；胎牛血清（批號：SA220415）、DMEM高糖培養(yǎng)基（批號：WH0022D221）、青霉素-鏈霉素（雙抗，100×）（批號：WH0622G181）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；PBS（批號：20221101）、胰蛋白酶（批號：20220501）均購自北京賽文創(chuàng)新科技有限公司。天然產(chǎn)物來自湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥名族醫(yī)藥國際聯(lián)合實驗室從血筒葉中分離出來的化合物。

1.2? 實驗儀器

熒光分光光度計（日本Hitachi公司，型號：F-7000）；紫外分光光度計（日本島津公司，型號：UV-1800）；激光掃描共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號：FV1200）； NMR光譜（德國Brucker公司，型號：Bruker 600MHz）；微孔板檢測器（美國PerkinElmer公司，型號：Epire）；細胞CO2培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機（美國賽默飛公司，型號：HERA CELL 150i、ST 8R）；雙目倒置相差顯微鏡（美國尼康公司，型號：TS2R）。

1.3? HCN的合成和表征

氮氣保護下，向250 mL圓底燒瓶中分別加入7-羥基香豆素（10.5 mg）、2-氯-5-硝基嘧啶（28.6 mg）和吡啶（20 μL），加入10 mL無水N，N-二甲基甲酰胺中，在70 ℃下反應7 h。將混合物蒸發(fā)，并通過二氯甲烷和石油醚（v/v，10/1）洗脫的硅膠色譜進一步純化殘留物，以獲得HCN（白色固體，20.8 mg，53.3%）。HCN的氫譜數(shù)據(jù)顯示有7個氫，分別為δ_H9.47（s，2H）、8.11（1H，d，J=58 Hz）、7.85（1H，d，J=8.45 Hz）、7.49（1H，d，J=2.23 Hz）、7.33（1H，dd，J=8.46，2.28 Hz）、6.51（1H，d，J=9.61 Hz）。碳譜數(shù)據(jù)顯示有13個碳，分別為δ_C165.8、159.7、156.8、154.5、154.4、143.8、139.8、129.8、118.3、117.0、115.7、110.0、59.8。液質數(shù)據(jù)LC-MS m/z[C₁₃H₇N₃O₅⁺]為286.3。

1.4? HCN的可行性和特異性實驗

用去離子水制備GSH（10 mmol/mL）的儲存溶液，并稀釋至不同濃度。HCN儲備液用DMSO/PBS（1/9，v/v）制備，并將儲備液用去離子水稀釋至終濃度為20 μmol/mL，得到光譜測定溶液。用熒光分光光度計或紫外可見吸收分光光度計記錄不同分析物的熒光或紫外吸收光譜。

1.5? MTT實驗

HL-7702和HepG2細胞（1×104個/孔）在含有100 μL DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清、1%鏈霉素、37 ℃，5% CO2）的96孔板中培養(yǎng)24 h，待細胞密度達到 80%時，棄掉培養(yǎng)基，將含不同濃度HCN的培養(yǎng)基（1%胎牛血清）加入96孔板中進一步孵育48 h。HCN孵育結束后去除培養(yǎng)基，將含有MTT溶液（0.5 mg/mL）的100 μL新鮮DMEM培養(yǎng)基加入每個孔中，再孵育2～4 h。最后，棄掉含有MTT溶液的培養(yǎng)基，加入DMSO（100 μL），并在細胞活力測定前，在黑暗中低速搖動15 min。

1.6? 細胞成像

將HepG2細胞（4×104個/孔）接種在鋪有爬片的12孔板上，用1 mL DMEM（10%胎牛血清、1%鏈霉素、37 ℃和5% CO₂）培養(yǎng) 24 h，待細胞密度達到80%后，用Mito-Tracker紅色染料（200 μL）孵育30 min。隨后用恢復至室溫的PBS 洗3遍，用不同濃度的HCN（0、40、80、100、200、300、400 μmol/mL）孵育30 min后，用PBS洗3遍，最后用激光掃描共聚焦顯微鏡進行熒光成像。

1.7? GSH中藥調節(jié)劑的篩選

在含有200 μL PBS的EP管中依次加入16種血筒化合物（20 μmol/mL）和GSH（100 μmol/mL），室溫下反應30 min。隨后加入HCN（20 μmol/mL），在37 ℃下反應30 min。用熒光分光光度計測量熒光強度。激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射范圍為 400～550 nm。

1.8? 分子對接

研究HCN和血筒化合物（五內酯B、南五內酯、異南內酯A）與GSH之間的潛在結合模式，使用Le Dock.win32軟件進行分子對接。通過Chem 3D 20.0將HCN和血筒化合物結構的2D模式轉換為3D模式，將HCN和血筒化合物（五內酯B、南五內酯、異南內酯A）結構能量質子化并最小化，以獲得穩(wěn)定的3D結構，并以“moe file”形式保存。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載GSH（PDB代碼：1b4q）的氨基酸序列。用LeDock.win32軟件進行分子對接。

2 結果

2.1? HCN的檢測原理

香豆素類化合物具有熒光強度高、光穩(wěn)定性強、熒光量子產(chǎn)率高等特點，是一種優(yōu)良的熒光基團。同時，2-氯-5-硝基嘧啶作為一種經(jīng)典的熒光淬滅劑，具有穩(wěn)定可靠的熒光淬滅性能。本實驗以7-羥基香豆素為熒光團、2-氯-5-硝基嘧啶為淬滅基團，成功合成了無熒光信號的HCN。HCN可特異性地與GSH反應，釋放出熒光基團7-羥基香豆素，實現(xiàn)了熒光信號從無到有的轉變。詳見圖1。

2.2? HCN的表征

為驗證HCN是否成功合成，采用質譜對其分子量進行了分析。由圖2可見，HCN的分子量為286.3，與計算所得分子量286.2相符。同時，采用核磁技術進一步確證了HCN的結構。從氫譜中可以看出該探針含有7個氫，并且有2個氫化學位移相同，說明這2個氫在嘧啶基團上空間位置相同，且香豆素上的7位羥基與嘧啶上的2位氯發(fā)生取代反應。從碳譜可以看出該探針含有13個碳，故氫譜和碳譜數(shù)據(jù)表明HCN合成成功。

2.3? HCN的可行性和特異性

為了研究HCN對GSH的敏感性，研究特定濃度HCN（20 μmol/mL）和GSH（100 μmol/mL）的溫度和時間依賴性熒光響應。溫度依賴性實驗表明在37 ℃時其熒光強度最高，故后續(xù)實驗在37 ℃下進行（見圖3A）。時間依賴性實驗中，在剛開始的10～100 min，可以發(fā)現(xiàn)其峰值發(fā)射強度迅速增加，120 min時達到平臺期后開始下降，因此，100 min為HCN與GSH的最佳反應時間（見圖3B）。在紫外可見吸收光譜實驗中，當HCN的溶液中含有GSH時，其紫外吸收峰和熒光團7-羥基香豆素吸收峰位置相同，而不含GSH的溶液幾乎沒有紫外吸收，說明HCN與GSH反應后釋放的熒光物質為7-羥基香豆素，這與預期結果相符（見圖3C）。在離子選擇性實驗中，HCN與各組分析物反應后，HCN與GSH響應最強，說明HCN可以特異性地響應GSH而不受其他干擾因素的影響（見圖3D）。HCN對GSH的濃度依賴性實驗中，在不含GSH時，幾乎沒有熒光發(fā)射峰，然而，隨著GSH（0～200 μmol/mL）濃度的增加，各發(fā)射光譜曲線在450 nm處的發(fā)射條帶逐漸增強，并與0～200 μmol/mL范圍內的GSH濃度具有線性相關性（R²=0.9897）（見圖3E、3F）。分子對接結果表明，HCN和GSH通過氫鍵與GLN-65、ASN-66和ALA-67結合，形成了3個穩(wěn)定的氫鍵，其結合能為-6.09 kcal/mol，說明HCN與GSH可以穩(wěn)定地結合（見圖4）。

2.4? HCN細胞毒性和成像

兩株細胞分別用不同濃度的HCN孵育48 h后，在HepG2細胞中，與0 μmol/mL相比，80 μmol/mL和100 μmol/mL的HCN降低了細胞活力（P<0.05），對HepG2細胞增殖有影響。在HL-7702細胞中，與0 μmol/mL相比，各濃度的HCN對細胞活力影響微弱（P>0.05），對細胞增殖無影響。細胞成像實驗中，與0 μmol/mL相比，各濃度HCN藍色熒光強度增強（P＜0.05），直到濃度達到400 μmol/mL時，熒光強度趨于穩(wěn)定。詳見圖5—6。

2.5? GSH中藥調節(jié)劑的篩選及其分子對接

與control相比，化合物五內酯B、南五內酯和異南內酯A的GSH水平下調（P＜0.05），而其他化合物對GSH水平變化的影響微弱（P>0.05）。分子對接結果表明，五內酯B通過氫鍵與LYS-A：19和GLN-A：57結合，而南五內酯通過氫鍵與VAL-A：29、TYR-A：24、CYS-A：22和LYS-A：19連接，異南內酯A通過氫鍵與SER-A：83、GLN-A：57和ARG-A：67連接，各自形成了2個及以上穩(wěn)定的氫鍵，其結合能分別為-3.94、-3.64、-4.87 kal/mol。詳見表1、圖7。

3 討論

土家族藥物血筒[Kadsura heteroclita （Roxb.） Craib]為五味子科（Schisandraceae）南五味子屬（Kadsura），是一種常綠攀緣型木質藤本，主要藥用部位是莖和果實。目前，已經(jīng)有較多的文獻報道了中藥血筒中化學成分的研究，從中藥血筒莖中分離并鑒定的化合物主要有木脂素類、三萜類、倍半萜類、黃酮類、甾體類等化學成分[23-26]。藥理學研究也表明，中藥血筒中分離得到的單體化合物具有抗類風濕關節(jié)炎、抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝、抗HBV、抗HIV和抗癌等藥理活性[27]。本實驗中篩選的化合物主要是從血筒葉中分離提取得到，除了傳統(tǒng)的抗炎和抗癌等藥理作用外，血筒化合物五內酯B、南五內酯和異南內酯A 3個三萜化合物可以下調GSH的表達水平。

GSH是含量最多的一種生物硫醇，在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)、抵御自由基和毒素方面起著重要作用。本研究成功合成了GSH響應型HCN，其具有高選擇性、低細胞毒性和高靈敏度等特點。通過紫外、液相、熒光光譜和細胞成像等實驗發(fā)現(xiàn)HCN可以靈敏地檢測細胞內外GSH表達水平的變化，并通過HCN成功地從血筒化合物中篩選了中藥GSH調節(jié)劑五內酯B、南五內酯和異南內酯A。綜上所述，本文主要以HCN為篩選工具，GSH為篩選靶標，成功獲取了能下調GSH水平的中藥GSH調節(jié)劑，該研究為快速發(fā)現(xiàn)中藥活性成分提供了新思路。

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