高溫對(duì)“萬(wàn)圣節(jié)”花青素代謝的影響

薛雅 施竹玥 李舒敏 王婷 陳淑婷 趙榮 李素華 張麗華

摘要 為研究高溫脅迫對(duì)多肉植物‘萬(wàn)圣節(jié)花青素代謝的影響，以‘萬(wàn)圣節(jié)扦插苗為材料，對(duì)其進(jìn)行37 ℃處理，分別處理0、6、12、24、48 h，測(cè)定各處理下‘萬(wàn)圣節(jié)葉片花青素含量、過(guò)氧化物酶活性、多酚氧化酶活性、過(guò)氧化物酶基因和多酚氧化酶基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在高溫脅迫處理的48 h內(nèi)，‘萬(wàn)圣節(jié)葉片花青素含量總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但前12 h內(nèi)花青素含量無(wú)顯著變化；‘萬(wàn)圣節(jié)葉片多酚氧化酶活性和過(guò)氧化物酶總體均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且均在24 h時(shí)達(dá)到頂峰；過(guò)氧化物酶基因cluster-7 148.177和cluster-7 148.112 77表達(dá)水平的變化趨勢(shì)總體上與過(guò)氧化物酶活性的變化較為一致，但是過(guò)氧化物酶基因cluster-7 148.326 45和cluster-7 148.152 9的變化趨勢(shì)與過(guò)氧化物酶活性的變化趨勢(shì)不一致。由此可見(jiàn)，高溫脅迫處理影響‘萬(wàn)圣節(jié)葉片中花青素的積累、多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶活性；多酚氧化酶基因cluster-7 148.531 8、過(guò)氧化物酶基因cluster-7 148.177和cluster-7 148.112 77可能在高溫引起的‘萬(wàn)圣節(jié)花青素降解中起重要作用。

關(guān)鍵詞 高溫脅迫；多肉植物；花青素代謝

中圖分類(lèi)號(hào) TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-7731（2023）03-0029-05

Effects of High Temperature on the Metabolism of Anthocyanins in

Aeonium arboreum ′Halloween′

XUE Ya? ?SHI Zhuyue? ?LI Shumin? ?WANG Ting? ?CHEN Shuting? ?ZHAO Rong? ?LI Suhua? ?ZHANG Lihua

（Suqian College， Suqian Jiangsu 223800）

Abstract In order to study the effect of high temperature stress on the anthocyanin metabolism of Aeonium arboreum 'Halloween'， the cuttings of 'Halloween' were used as materials and treated at 37 ℃ for 0 h， 6 h， 12 h， 24 h and 48 h， respectively. Then， the anthocyanin content， peroxidase activity， polyphenol oxidase activity， peroxidase gene and polyphenol oxidase gene expression levels in the leaves of 'Halloween' under each treatment were determined. The results showed that the anthocyanin content in the leaves of 'Halloween' showed a downward trend in the 48 h of high temperature stress treatment， but there was no significant change in the first 12 h; the activity of polyphenol oxidase and peroxidase in the leaves of 'Halloween' showed a trend of increasing first and then decreasing， and both reached the peak at 24 h; the change trend of the expression level of peroxidase genes cluster-7 148.177 and cluster-7 148.112 77 was generally consistent with the change trend of peroxidase activity， however， the change trend of peroxidase genes cluster-7 148.326 45 and cluster-7 148.152 9 is not consistent with the change trend of peroxidase activity. High temperature stress affects the accumulation of anthocyanins， polyphenol oxidase and peroxidase activities in leaves of 'Halloween'; polyphenol oxidase gene cluster-7 148.531 8， peroxidase gene cluster-7 148.177 and cluster-7 148.112 77 may play an important role in the degradation of 'Halloween' anthocyanins induced by high temperature.

Keywords high temperature stress; succulent plants; anthocyanin metabolism

多肉植物是一類(lèi)具有膨大且肉質(zhì)化器官的高等植物，多生于較干旱的地區(qū)，常體型小巧。這類(lèi)植物因其小巧優(yōu)雅的形態(tài)、絢麗奪目的色彩和耐陰耐旱的適應(yīng)性，廣受園藝愛(ài)好者的青睞，成為我國(guó)新興產(chǎn)業(yè)。近年來(lái)已經(jīng)形成四大多肉植物主產(chǎn)區(qū)，分別是山東青州、云南昆明、福建漳州和江蘇常州，多個(gè)具有相當(dāng)規(guī)模的種植基地、特色小鎮(zhèn)和國(guó)家農(nóng)業(yè)龍頭企業(yè)應(yīng)運(yùn)而生，多肉產(chǎn)業(yè)對(duì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和鄉(xiāng)村振興起到了較大的推動(dòng)作用[1-2]。

花青素在植物組織中廣泛存在，對(duì)植物葉片、花和果實(shí)的著色起著至關(guān)重要的作用[3]。色彩對(duì)觀(guān)賞植物的重要性不言而喻，因而花青素代謝的研究一直是觀(guān)賞植物的研究熱點(diǎn)，如矮牽牛、月季、百合等植物均有相關(guān)研究的報(bào)道[4-6]。合成和降解是花青素代謝中2個(gè)重要的過(guò)程。花青素生物合成途徑已十分明晰，該途徑由一系列酶基因構(gòu)成[7]，在這些酶基因上游存在著一些調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平的轉(zhuǎn)錄因子，如MYB、BHLH和WD40等轉(zhuǎn)錄因子[8]。目前花青素代謝的研究主要集中在花青素生物合成及其調(diào)控上，花青素降解相關(guān)的研究還少有報(bào)道，僅有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道花青素降解可能與過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶活性有關(guān)[9-10]。

‘萬(wàn)圣節(jié)（Aeonium arboreum‘Halloween）為景天科蓮花掌屬多肉植物，分布于亞洲、非洲和美洲的干旱和半干旱地區(qū)?！f(wàn)圣節(jié)形態(tài)優(yōu)雅、色彩艷麗、觀(guān)賞價(jià)值高，在多肉生產(chǎn)中占有重要地位。然而，夏季高溫下葉色紅艷的‘萬(wàn)圣節(jié)易變暗淡，觀(guān)賞價(jià)值降低，經(jīng)濟(jì)效益不理想。本課題組前期的研究表明，彩葉‘萬(wàn)圣節(jié)葉片中主要的色素是矢車(chē)菊3-o-半乳糖苷，該色素是一種天然花青素，這意味著高溫影響了‘萬(wàn)圣節(jié)葉片中花青素的代謝?；诖?，該研究以‘萬(wàn)圣節(jié)扦插苗為材料，對(duì)其進(jìn)行37 ℃處理，分別處理0、6、12、24、48 h，測(cè)定各處理下‘萬(wàn)圣節(jié)葉片花青素含量、過(guò)氧化物酶活性、多酚氧化酶活性、過(guò)氧化物酶基因和多酚氧化酶基因的表達(dá)水平，探明高溫對(duì)‘萬(wàn)圣節(jié)花青素代謝的影響，以期為減輕或消除高溫對(duì)‘萬(wàn)圣節(jié)葉片呈色的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取宿遷學(xué)院園林實(shí)驗(yàn)基地苗床上當(dāng)年扦插的‘萬(wàn)圣節(jié)單頭植株為材料，將大小一致的扦插苗移入盆中栽培，盆高20 cm，上口直徑24 cm，每盆1 株，分5個(gè)處理，每處理6盆，共移栽30盆，培養(yǎng)于室溫為18 ℃的生長(zhǎng)室內(nèi)。在移栽21 d后，‘萬(wàn)圣節(jié)生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，此時(shí)將30盆植株轉(zhuǎn)至37 ℃的人工氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、6、12、24、48 h后取‘萬(wàn)圣節(jié)植株第4至第5輪的葉片，檢測(cè)不同處理時(shí)長(zhǎng)下葉片花青素含量、過(guò)氧化物酶活性、多酚氧化酶活性、過(guò)氧化物酶基因和多酚氧化酶基因的表達(dá)水平，3次重復(fù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2 試驗(yàn)方法

花青素含量測(cè)定采用0.1%鹽酸比色法[11]，過(guò)氧化物酶活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚比色法[11]，多酚氧化酶活性測(cè)定采用鄰苯二酚比色法[12]，‘萬(wàn)圣節(jié)葉片RNA提取采用天根生化的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，熒光定量PCR采用朗基Q2000B進(jìn)行。采用Primer Premier 5設(shè)計(jì)過(guò)氧化物酶基因和多酚氧化酶基因的定量引物（表1），‘萬(wàn)圣節(jié)AaACT2為內(nèi)參基因。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用GraphPad Prism 5制圖，采用SPSS 25.0進(jìn)行ANOVA單因素分析，分析數(shù)據(jù)間是否具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對(duì)‘萬(wàn)圣節(jié)葉片花青素含量的影響

由圖1可知，高溫脅迫對(duì)‘萬(wàn)圣節(jié)葉片中花青素積累量影響很大。在高溫脅迫處理的48 h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，‘萬(wàn)圣節(jié)葉片花青素含量總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，花青素含量在高溫脅迫處理的12 h內(nèi)無(wú)顯著變化，24 h后才表現(xiàn)出顯著下降，且24和48 h后的花青素含量無(wú)顯著性差異。

2.2 高溫脅迫對(duì)‘萬(wàn)圣節(jié)葉片多酚氧化酶含量的影響

由圖2可知，高溫脅迫對(duì)‘萬(wàn)圣節(jié)葉片中多酚氧化酶活性具有一定的影響。在高溫脅迫處理的48 h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，‘萬(wàn)圣節(jié)葉片多酚氧化酶活性總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，多酚氧化酶活性在高溫脅迫處理的6 h內(nèi)無(wú)顯著的變化，12 h后才表現(xiàn)出顯著的上升，在24 h時(shí)達(dá)到頂峰，后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.3 高溫脅迫對(duì)‘萬(wàn)圣節(jié)葉片過(guò)氧化物酶含量的影響

由圖3可知，高溫脅迫對(duì)‘萬(wàn)圣節(jié)葉片中過(guò)氧化物酶活性具有一定的影響。在高溫脅迫處理的48 h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，‘萬(wàn)圣節(jié)葉片過(guò)氧化物酶活性總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，多酚氧化酶活性在高溫脅迫處理的12 h內(nèi)無(wú)顯著的變化，24 h后才表現(xiàn)出顯著的上升，后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.4 高溫脅迫對(duì)‘萬(wàn)圣節(jié)葉片多酚氧化酶基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探究多酚氧化酶對(duì)高溫脅迫下花青素積累的影響，從已構(gòu)建的‘萬(wàn)圣節(jié)葉片轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中篩選出1個(gè)可能的多酚氧化酶基因cluster-7 148.531 8，并以高溫脅迫下的‘萬(wàn)圣節(jié)葉片為材料，進(jìn)行了該基因的表達(dá)量分析。由圖4可知，高溫脅迫對(duì)‘萬(wàn)圣節(jié)葉片中多酚氧化酶基因的表達(dá)影響很大，在高溫脅迫處理的48 h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，‘萬(wàn)圣節(jié)葉片多酚氧化酶基因的表達(dá)水平總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，多酚氧化酶基因的表達(dá)水平在高溫脅迫處理的12 h內(nèi)無(wú)顯著的變化，24 h后才表現(xiàn)出顯著的上升，后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.5 高溫脅迫對(duì)‘萬(wàn)圣節(jié)葉片過(guò)氧化物酶基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探究過(guò)氧化物酶對(duì)高溫脅迫下花青素積累的影響，從已構(gòu)建的‘萬(wàn)圣節(jié)葉片轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中篩選出了4個(gè)可能的過(guò)氧化物酶基因，并以高溫脅迫下的‘萬(wàn)圣節(jié)葉片為材料，進(jìn)行了上述基因的表達(dá)量分析。由圖5可知，高溫脅迫對(duì)‘萬(wàn)圣節(jié)葉片中過(guò)氧化物酶基因的表達(dá)影響很大，在高溫脅迫處理的48 h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，‘萬(wàn)圣節(jié)葉片中4個(gè)過(guò)氧化物酶基因的表達(dá)水平總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，cluster-7 148.177、cluster-7 148.112 77和cluster-7 148.326 45這3個(gè)過(guò)氧化物酶基因的表達(dá)水平在高溫脅迫處理的12 h內(nèi)無(wú)顯著的變化，24 h后才表現(xiàn)出顯著的上升，前2個(gè)基因在48 h后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而最后一個(gè)基因48 h與24 h的表達(dá)水平無(wú)顯著變化。過(guò)氧化物酶基因cluster-7 148.152 9較為獨(dú)特，在高溫脅迫處理的48 h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，該基因的表達(dá)水平總體呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)，表達(dá)水平的高峰分別在0和24 h。

3 結(jié)論與討論

花青素是植物中分布較為廣泛的一類(lèi)色素，其負(fù)責(zé)的顏色范圍從紅色到紫色及藍(lán)色。目前，花青素的生物合成途徑已被解析清楚，花青素的合成調(diào)控已有諸多研究進(jìn)展，然而學(xué)界目前對(duì)花青素在植物中的穩(wěn)定性和分解代謝知之甚少。在紅花檵木[13]、茄子[14]和‘紅陽(yáng)獼猴桃[15]中的研究表明，高溫會(huì)顯著減少植物中花青素的積累，這一結(jié)論與該研究結(jié)果相一致。然而，不同的物種對(duì)不同高溫的反應(yīng)并不相同，紅花檵木中35 ℃處理1周即可使紅色的葉片轉(zhuǎn)青，‘紅陽(yáng)獼猴桃40 ℃處理后，其果肉內(nèi)果皮中花青素含量迅速下降?；ㄇ嗨卦诟邷貤l件下顯著減少，這一過(guò)程中肯定存在著花青素降解這一過(guò)程。氧化水果提取物中花青素的主要酶之一是多酚氧化酶，該酶是一大類(lèi)酶，普遍存在于高等植物中，在綠原酸或咖啡酰酒石酸存在下，多酚氧化酶增加了水果提取物和果汁中花青素的降解速率[16]。另一種可降解水果提取物中花青素的酶是過(guò)氧化物酶，因?yàn)樵贖2O2存在的條件下，過(guò)氧化物酶可降解水果提取物中的花青素[17]，且過(guò)氧化物酶在高溫條件下可直接參與紅葡萄漿果花青素分解代謝[18]。因而，該研究主要測(cè)定了以上2種酶的活性及可能編碼這2類(lèi)酶的基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在‘萬(wàn)圣節(jié)葉片經(jīng)受高溫脅迫的過(guò)程中，多酚氧化酶活性的變化與多酚氧化酶基因cluster-7 148.531 8表達(dá)水平的變化趨勢(shì)一致，均為先上升后下降，過(guò)氧化物酶活性的變化總體上與過(guò)氧化物酶基因cluster-7 148.177和cluster-7 148.112 77表達(dá)水平的變化趨勢(shì)較為一致，均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，但是過(guò)氧化物酶基因cluster-7 148.326 45和cluster-7 148.152 9的變化趨勢(shì)與過(guò)氧化物酶活性的變化趨勢(shì)并不一致。過(guò)氧化物酶是一類(lèi)酶，具有多個(gè)成員，每個(gè)成員的功能不盡相同，因而推測(cè)cluster-7 148.326 45和cluster-7 148.152 9可能并不負(fù)責(zé)高脅迫下的花青素降解過(guò)程。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 陳大勝. 基于特色小鎮(zhèn)建設(shè)的蘇北多肉植物產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，44（6）：201-206.

[2] 蔣亞華，韓浩章，李素華，等. 彩葉系多肉植物培養(yǎng)及其營(yíng)銷(xiāo)模式研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2019，25（18）：47-48.

[3] 劉愷媛，王茂良，辛海波，等. 植物花青素合成與調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2021，37（14）：41-51.

[4] 王蕾，韋靈林，徐虹. 矮牽?；ㄉ剀蘸铣赏緩街械年P(guān)鍵酶及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志，2009，31（5）：641-650.

[5] 程怡. 月季‘仙境花色素組分及影響花色呈色因子分析[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[6] 肖偉，張銘芳，張秀海，等. 百合花青素合成調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 北方園藝，2018（20）：154-162.

[7] HOLTON T，CORNISH E. Genetics and Biochemistry of Anthocyanin Biosynthesis[J]. Plant cell，1995，7：1071-83.

[8] 高國(guó)應(yīng)，伍小方，張大為，等. MBW復(fù)合體在植物花青素合成途徑中的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2020，36（1）：126-134.

[9] MOVAHED N，PASTORE C，CELLINI A，et al. The grapevine VviPrx31 peroxidase as a candidate gene involved in anthocyanin degradation in ripening berries under high temperature. J Plant Res. 2016 May；129（3）：513-26.

[10] LUO H，LI W，ZHANG X，DENG S，et al. planta high levels of hydrolysable tannins inhibit peroxidase mediated anthocyanin degradation and maintain abaxially red leaves of Excoecaria Cochinchinensis[J]. BMC Plant Biol. 2019，19（1）：315.

[11] 李小方，張志良. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：高等教育出版社，2016.

[12] MONTGOMERY MW，SGARBIERI VC. Isoenzymes of banana polyphenol oxidase[J]. Phytochemistry，1975，14（5-6）：1245-1249.

[13] 許威. 紅花檵木CHS基因的克隆及表達(dá)分析[D]. 長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[14] 張圣美，劉曉慧，尚靜，等. 高溫脅迫對(duì)茄子花青素含量及其合成相關(guān)酶活性和基因表達(dá)的影響[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，36（6）：6-12.

[15] 方鵬. 高溫脅迫下‘紅陽(yáng)獼猴桃果實(shí)花青素合成與分解途徑解析[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[16] KADER F，HALUK J P，NICOLAS J，et al. Degradation of Cyanidin 3-Glucoside by Blueberry Polyphenol Oxidase： Kinetic Studies and Mechanisms[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry，1998，46（8）：3060-3065.

[17] AA CALDER?N，E GARC?A-FLORENCIANO，R MU?OZ，et al. Gamay grapevine peroxidase：Its role in vacuolar anthocyani（di）n degradation[J]. Vardfacket，1992，31（3）：3.

[18] MOVAHED N，PASTORE C，CELLINI A，et al. The grapevine VviPrx31 peroxidase as a candidate gene involved in anthocyanin degradation in ripening berries under high temperature[J]. Journal of Plant Research，2016，129（3）：513-526.

（責(zé)編：王慧晴）

基金項(xiàng)目 2021年宿遷學(xué)院省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（202114160039Y）；宿遷學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2021td05）。

作者簡(jiǎn)介 薛雅（2001—），女，江蘇鹽城人。研究方向：多肉植物種質(zhì)資源創(chuàng)新與應(yīng)用。

趙榮*通信作者

收稿日期 2022-04-05