于子健 楊冰 謝國(guó)駟 史成銀
摘 要:卵黃抗體(IgY)是一種存在于卵黃中的免疫球蛋白,具有性質(zhì)穩(wěn)定、安全高效、綠色環(huán)保、不產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn),在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。文章介紹了卵黃抗體的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和作用機(jī)制以及卵黃抗體在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治中的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景,以期為今后卵黃抗體在水產(chǎn)養(yǎng)殖的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用提供參考。
關(guān)鍵詞:卵黃抗體;水產(chǎn)養(yǎng)殖;病害防治
我國(guó)是漁業(yè)大國(guó),也是水產(chǎn)養(yǎng)殖第一大國(guó)。2021年,全國(guó)水產(chǎn)品總產(chǎn)量6 690.29萬(wàn)噸,養(yǎng)殖產(chǎn)品占比達(dá)到了80.63%,中國(guó)養(yǎng)殖水產(chǎn)品占世界水產(chǎn)品養(yǎng)殖總產(chǎn)量的60%以上[1]。但隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展,養(yǎng)殖產(chǎn)量的增加以及養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,導(dǎo)致水體環(huán)境污染嚴(yán)重,水產(chǎn)動(dòng)物病害頻發(fā),病害發(fā)生的時(shí)間增長(zhǎng)、規(guī)模增大,病害種類增加,使得水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的防治工作難度加大。嚴(yán)重的病害問(wèn)題不僅造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,制約著水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,而且嚴(yán)重威脅到水產(chǎn)品的質(zhì)量以及人類的安全。因此,加強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治的研究有著至關(guān)重要的意義??股赜休^強(qiáng)的抑制生長(zhǎng)和殺滅細(xì)菌的作用,被廣泛用于水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的防治。但抗生素的濫用也會(huì)給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來(lái)一定程度的副作用及危害,不僅會(huì)產(chǎn)生耐藥菌株,破壞水體環(huán)境,藥物殘留問(wèn)題更會(huì)直接危害到人體健康。2020年7月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布了“禁抗令”,在禁止抗生素使用后,尋找安全、綠色、高效的抗生素替代品成為水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的研究熱點(diǎn)。卵黃抗體具有穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)和使用方便等優(yōu)勢(shì),是預(yù)防和治療疾病的理想藥物,其作為一種抗生素藥物的替代品,具有廣闊的應(yīng)用前景。
1 卵黃抗體研究進(jìn)展
卵黃免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,IgY)又稱卵黃抗體,是指從免疫后的禽類卵黃中提取的針對(duì)特定抗原的抗體[2]。1893年,Klemperer[3]首次發(fā)現(xiàn)通過(guò)免疫產(chǎn)蛋母雞可以從其卵黃中獲得具有中和作用的特異性抗體;1969年,Leslie和Clem[4]將這種富集于卵黃中的免疫球蛋白命名為IgY。然而,在之后的很長(zhǎng)一段時(shí)間里,卵黃抗體的發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有引起學(xué)者們的重視。直到20世紀(jì)末期,動(dòng)物福利問(wèn)題逐漸受到重視,卵黃抗體才再次進(jìn)入學(xué)者們的視野。目前,卵黃抗體在畜禽養(yǎng)殖、免疫檢測(cè)、疾病防治等領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。近年來(lái),隨著對(duì)IgY研究的不斷深入,卵黃抗體在水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病、病毒性疾病防治領(lǐng)域也有相關(guān)應(yīng)用的報(bào)道。
1.1 卵黃抗體的分子結(jié)構(gòu)
IgY呈Y型結(jié)構(gòu),由兩條輕鏈和兩條重鏈組成,分子量約為180 ku。輕鏈約為22~30 kDa,由1個(gè)可變區(qū)VL和1個(gè)恒定區(qū)CL構(gòu)成;重鏈約為67~70 kDa,由1個(gè)可變區(qū)VH和4個(gè)恒定區(qū)Cυ1、Cυ2、Cυ3、Cυ4構(gòu)成[5-6]。輕鏈(VL-CL)和重鏈(VH-Cυ1)之間通過(guò)二硫鍵連接,構(gòu)成了IgY的抗原結(jié)合區(qū)(Fab區(qū)),其可變末端(VL和VH)共同構(gòu)成了IgY的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn),決定了抗體的抗原特異性[7]。重鏈間存在3個(gè)重鏈間二硫鍵[8],重鏈的Cυ2、Cυ3、Cυ4區(qū)為可結(jié)晶片段(Fc區(qū)),是IgY與細(xì)胞表面受體或補(bǔ)體系統(tǒng)蛋白相互作用的部位,在涉及去除病原體的補(bǔ)體系統(tǒng)中起主要作用,例如裂解入侵細(xì)胞、經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活和吞噬外來(lái)病原等[9-10]。
1.2 卵黃抗體的理化性質(zhì)
IgY性質(zhì)穩(wěn)定,即使作為一種生物蛋白大分子,也具有較強(qiáng)的耐熱、耐酸以及抗酶降解能力。IgY在30~70 ℃的溫度范圍內(nèi)也能保持穩(wěn)定,但在70 ℃或更高溫度下加熱15 min后活性會(huì)明顯下降[11-12];干燥處理后的IgY制劑可以在4 ℃條件下儲(chǔ)存5~10年,在室溫條件下放置6個(gè)月其活性也不會(huì)明顯改變[13]。IgY在pH值4.0~11.0時(shí)比較穩(wěn)定,當(dāng)pH值<4.0或pH值>12.0時(shí)活性會(huì)迅速下降[14]。研究顯示,pH值和酶與底物的比例不同,卵黃抗體對(duì)胃蛋白酶的耐受程度也會(huì)發(fā)生變化;卵黃抗體抗胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶的水解能力要強(qiáng)于胃蛋白酶,在胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化8 h后,仍能保留部分活性[15]。
1.3 卵黃抗體的作用機(jī)制
關(guān)于IgY防治疾病的具體機(jī)制尚未闡明,但是根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果來(lái)看,卵黃抗體在防治疾病過(guò)程中,主要通過(guò)以下幾種機(jī)理發(fā)揮作用[16]:一是卵黃抗體可以通過(guò)凝集作用使細(xì)菌凝集,破壞細(xì)菌表面結(jié)構(gòu),抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和定植。靖凱霖等[17]通過(guò)透射電鏡、免疫熒光電鏡和掃描電鏡實(shí)驗(yàn)表明,特異性IgY可以使?fàn)N爛弧菌凝集,改變其細(xì)胞結(jié)構(gòu),破壞細(xì)胞完整性致菌體死亡。二是卵黃抗體可以通過(guò)黏附作用,抑制細(xì)菌的生長(zhǎng),進(jìn)而減少毒素的產(chǎn)生和釋放。靖凱霖等[17]的研究顯示,特異性IgY能夠有效阻止?fàn)N爛弧菌在固體培養(yǎng)基上黏附,抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。三是卵黃抗體可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用,清除有害物質(zhì),避免病原的擴(kuò)散。Li等[18]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),與非特異性卵黃抗體相比,抗鰻弧菌卵黃抗體可顯著提高巨噬細(xì)胞對(duì)鰻弧菌的體外吞噬活性,表明特異性IgY可通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用來(lái)降低組織中的細(xì)菌負(fù)荷。四是當(dāng)卵黃抗體進(jìn)入體內(nèi)后,會(huì)被腸道內(nèi)的消化酶降解為小肽,這些小肽可以與特定病原體結(jié)合達(dá)到中和病毒的作用[19]。五是卵黃抗體可以識(shí)別病毒表面的結(jié)構(gòu)蛋白或整個(gè)病毒粒子,并與之結(jié)合后破壞病毒的結(jié)構(gòu),影響病毒與細(xì)胞結(jié)合,從而避免宿主受到病毒的侵染。Li等[20]的研究證實(shí),抗rVP60-N IgY可以很好地識(shí)別和檢測(cè)到RHDV(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)感染的肝臟中的病毒粒子,阻斷病毒的傳播與感染。
2 卵黃抗體在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中的應(yīng)用
目前的研究表明,卵黃抗體能夠有效防治水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病和病毒性疾病。卵黃抗體的應(yīng)用方式有注射、浸泡和口服,不同的使用方式,所產(chǎn)生的免疫保護(hù)效果也會(huì)有所差異。其中,注射方式的免疫效果最好,可直接提高血清中的抗體水平,適用于因病原體感染引起的全身性病變[21]。浸泡免疫對(duì)于很多水生動(dòng)物體表病原引起的感染效果更好,與注射免疫相比,浸泡免疫雖然能在一定程度上減小對(duì)水生動(dòng)物的刺激,但是也存在抗體需求量大、生產(chǎn)成本較高等問(wèn)題??诜庖吒m用于防治腸道微生物引起的感染[22],通過(guò)口服卵黃抗體的方式來(lái)靶向消除病原的感染是有顯著療效的。因此,在考慮動(dòng)物福利和實(shí)際生產(chǎn)可行性的同時(shí),口服免疫是一種更理想的預(yù)防策略[23]。
2.1 防治水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病
近年來(lái),將卵黃抗體用于防治水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的研究已有較多報(bào)道。Zhang等[23]在抗哈維氏弧菌特異性IgY對(duì)日本河豚的被動(dòng)免疫保護(hù)研究中發(fā)現(xiàn),注射、口服和浸泡的方式均能夠增強(qiáng)日本河豚的抵抗力。攻毒后特異性卵黃抗體組的存活率分別為80%、50%和60%,均顯著高于非特異性卵黃抗體組和對(duì)照組,表明特異性卵黃抗體能夠有效預(yù)防日本河豚哈維氏弧菌病。Li等[24]的實(shí)驗(yàn)表明,注射和浸泡抗?fàn)N爛弧菌特異性IgY能夠顯著降低仿刺參呼吸樹(shù)、體壁、腸和體腔液中的細(xì)菌載量,增強(qiáng)體腔細(xì)胞的吞噬活性,將感染仿刺參的存活率提高了60%,具有良好的預(yù)防和治療的作用。Xu等[25]在飼料中添加5%、3%和1%殼聚糖-藻酸鹽包被的特異性IgY,連續(xù)投喂7 d后,對(duì)大菱鲆進(jìn)行愛(ài)德華氏菌的注射攻毒,并在攻毒后對(duì)大菱鲆頭腎和脾臟組織的免疫相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示,口服微囊化IgY可以顯著降低脾臟和頭腎中促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-8、TNF-α)和補(bǔ)體C3的轉(zhuǎn)錄水平,減輕炎癥反應(yīng),并將大菱鲆的存活率由0%提高到63.3%、56.7%和20%。王仁寶等[26]用添加了含0.2%和0.5%抗致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus associated with acute hepatopancreatic necrosis disease,VpAHPND)卵黃抗體制劑的飼料來(lái)投喂凡納濱對(duì)蝦,測(cè)定了對(duì)蝦肝胰腺免疫酶活和免疫基因的相對(duì)表達(dá)水平,并通過(guò)浸浴感染實(shí)驗(yàn)對(duì)特異性IgY的保護(hù)效果進(jìn)行了研究。研究結(jié)果顯示,添加0.2% VpAHPND卵黃抗體制劑可顯著提高凡納濱對(duì)蝦肝胰腺酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)活力和抗菌肽基因(Crustin)的相對(duì)表達(dá)水平,增強(qiáng)對(duì)蝦免疫機(jī)能。在浸浴感染實(shí)驗(yàn)中,0.2%免疫組對(duì)蝦的存活率為72.22%,0.5%免疫組對(duì)蝦的存活率為48.89%,兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的存活率均高于對(duì)照組的23.33%,但0.5%免疫組與對(duì)照組的差異不顯著;結(jié)果表明,卵黃抗體的抗病效果與其添加劑量密切相關(guān),適量添加卵黃抗體制劑可顯著提高患病對(duì)蝦的存活率,提高對(duì)蝦抗VpAHPND感染的能力。
2.2 防治水產(chǎn)動(dòng)物病毒性疾病
目前,關(guān)于卵黃抗體在防治水產(chǎn)動(dòng)物病毒性疾病的研究主要集中在了對(duì)蝦白斑綜合征(white spot disease,WSD)上,對(duì)于病毒性神經(jīng)壞死?。╲iral nervous necrosis,VNN)和錦鯉皰疹病毒?。╧oi herpes virus disease,KHVD)也有少量報(bào)道。王仁寶等[27]的人工感染結(jié)果顯示,添加了0.2%和0.5%抗白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的卵黃抗體制劑實(shí)驗(yàn)組的存活率分別為48.89%和87.78%,均顯著高于對(duì)照組。免疫功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,添加0.5% WSSV卵黃抗體制劑能夠明顯提高對(duì)蝦的PO、SOD活力和熱休克蛋白70基因(Hsp70)相對(duì)表達(dá)水平。研究表明,口服特異性卵黃抗體,能夠增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦的免疫力,提高對(duì)蝦抗WSSV感染的能力,在一定程度上延緩對(duì)蝦的死亡。盧亞楠等[28]通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒制備了抗WSSV特異性IgY,并且采用注射、口服、浸泡的方式對(duì)抗WSSV特異性卵黃抗體的保護(hù)效果進(jìn)行了評(píng)估。研究結(jié)果顯示,注射、口服、浸泡滅活疫苗的IgY各實(shí)驗(yàn)組累計(jì)存活率相對(duì)陽(yáng)性對(duì)照顯著提升80%、46.7%及66.7%,表明IgY能夠很好地中和病毒,降低感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率,表現(xiàn)出很好的免疫保護(hù)效果。Liu等[29]發(fā)現(xiàn)制備的特異性卵黃抗體能夠中和病毒,有效阻斷赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒(red spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)對(duì)石斑魚鰭細(xì)胞系(grouper fin cell line,GF-1)的侵襲。用含10%特異性卵黃粉的飼料投喂石斑魚幼魚,治療組和連續(xù)喂養(yǎng)組的相對(duì)保護(hù)率分別達(dá)到了68%和70%,組織中的病毒載量也顯著降低,表明抗RGNNV-IgY能夠有效地保護(hù)石斑魚免受RGNNV感染。Liu等[30]通過(guò)免疫蛋雞獲得了抗鯉皰疹病毒3型特異性卵黃抗體,并在連續(xù)投喂10 d含0.05%特異性IgY的顆粒飼料后,對(duì)鯉進(jìn)行攻毒。經(jīng)IgY口服被動(dòng)免疫后,鯉的死亡率由85%下降至30%。結(jié)果表明,抗CyHV-3 IgY可以有效降低鯉皰疹病毒3型(cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)感染的鯉的死亡率,為鯉提供被動(dòng)保護(hù)。
3 展望
卵黃抗體具有性質(zhì)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、綠色安全、符合動(dòng)物福利要求等優(yōu)勢(shì),在水產(chǎn)動(dòng)物病害防治方面得到了廣泛應(yīng)用。目前的研究表明,用特異性抗原免疫蛋雞制備出的特異性卵黃抗體,通過(guò)注射、口服、浸泡的方式均可以引發(fā)動(dòng)物機(jī)體的被動(dòng)免疫機(jī)制,起到預(yù)防、治療動(dòng)物疾病的作用。卵黃抗體口服應(yīng)用中,IgY在進(jìn)入動(dòng)物腸道后會(huì)受到胃蛋白酶和胰蛋白酶的影響,但是利用β-環(huán)糊精[31]、卵磷脂、膽固醇[32]、海藻酸鈉[25,33]等進(jìn)行包被處理后,能極大提高IgY抗水解能力,充分保證了IgY的活性。雖然口服的效果不如注射和浸泡,但是口服的方式不會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生刺激,勞動(dòng)強(qiáng)度小,節(jié)約成本,具有很強(qiáng)的可行性。同時(shí),將卵黃抗體作為添加劑添加到飼料中,不僅可以促進(jìn)水生動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育,改善水產(chǎn)品的品質(zhì),還能在一定程度上提高機(jī)體的免疫功能,對(duì)預(yù)防和治療水產(chǎn)動(dòng)物疾病具有積極作用。
目前,卵黃抗體在生產(chǎn)應(yīng)用中也存在以下幾個(gè)問(wèn)題:一是,卵黃抗體的免疫保護(hù)效果受添加劑量的影響,不同抗原的卵黃抗體的最適添加劑量難以確定;二是,目前卵黃抗體產(chǎn)業(yè)還未形成標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程,生產(chǎn)出的產(chǎn)品參差不齊,實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中的保護(hù)效果差異明顯;三是,卵黃抗體的大規(guī)模應(yīng)用仍受到提純工藝的限制,目前的卵黃抗體提純工藝差,生產(chǎn)成本高,還沒(méi)有一種適用于工業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)高效的提純方法。因此,今后應(yīng)在如何提高抗體的免疫保護(hù)效果、降低生產(chǎn)成本等方面展開(kāi)深入研究,充分發(fā)揮卵黃抗體在水產(chǎn)動(dòng)物病害防治方面的作用,推動(dòng)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的綠色健康、可持續(xù)發(fā)展。
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(收稿日期:2022-12-11)