梁曉翠 武強 靳繼蘇 裴怡銘 郭建英 萬方浩

摘要 蓮草直胸跳甲Agasicleshygrophila是世界性入侵雜草空心蓮子草Alternanthera philoxeroides的專食性天敵，冬季低溫和夏季高溫會影響其種群數(shù)量從而降低防控效果。為進一步探討蓮草直胸跳甲對溫度脅迫適應性的分子生態(tài)機制，本研究對其熱激蛋白90（AhHSP90）進行了蛋白結(jié)構(gòu)、磷酸化修飾及系統(tǒng)發(fā)育等生物信息學分析，并采用熒光定量PCR檢測了AhHSP90基因的時空表達動態(tài)及不同溫度脅迫后的表達。RT-qPCR結(jié)果顯示，AhHSP90在蓮草直胸跳甲整個生活史及雌成蟲各組織中均有表達;高溫（30、35和40℃）、低溫（-5、0、5、10、15和20℃）脅迫2 h后，AhHSP90在高溫40℃下表達顯著升高，但在其他溫度下無顯著差異。根據(jù)對AhHSP90分子特征、表達模式以及對溫度脅迫的響應等方面的綜合分析，推測其可能在蓮草直胸跳甲發(fā)育及抵抗高溫過程中發(fā)揮著重要的作用。

關(guān)鍵詞 蓮草直胸跳甲;?空心蓮子草;?熱激蛋白90;?表達模式;?溫度脅迫

中圖分類號： S 476.9

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2021674

Abstract Agasicles hygrophila is the natural enemy of Alternanthera philoxeroides， a worldwide invasive weed. Low temperature in winter and high temperature in summer can affect the population number of A. hygrophila， thus reducing its control effect. In order to further explore the molecular mechanism of temperature stress resistance in A. hygrophila， the structure， phosphorylation and phylogeny of heat shock protein 90 （AhHSP90） were analyzed by bioinformation methods， and RT-qPCR was performed to detect the temporal and spatial expression dynamics of AhHSP90 and the expression of AhHSP90 after exposure to different temperatures for 2 h. RT-qPCR results showed that AhHSP90 was expressed with different levels in the whole life cycle of A.hygrophila and tissues-specific in the female adult of A.hygrophila. Analysis of temperature stress response showed that the expression of AhHSP90 could be induced by high and low temperatures. The relative expression level of AhHSP90 was significantly upregulated after exposure to 40℃ for 2 h in A.hygrophila， however， no significant difference was observed at other temperatures. According to the comprehensive analysis， it is deduced that AhHSP90 may play an important role in the development and resistance to high temperature of A.hygrophila.

Key words Agasicles hygrophila;?Alternanthera philoxeroides;?heat shock protein 90;?expression pattern;?temperature stress

空心蓮子草Alternanthera philoxeroides是一種適應性很強的水生型入侵雜草，原產(chǎn)于南美洲［1］，20世紀30年代傳入我國，對我國農(nóng)林牧漁業(yè)造成巨大的威脅［2-4］，2003年被列為中國首批需要特別防治的入侵物種［5］。蓮草直胸跳甲Agasicles hygrophila屬鞘翅目葉甲科，是空心蓮子草的專食性天敵昆蟲，其幼蟲和成蟲取食空心蓮子草的葉片和嫩莖，老熟幼蟲鉆入莖稈內(nèi)化蛹，自1986年引入我國后，對空心蓮子草起到了明顯的控制效果［1］。昆蟲是變溫動物，溫度對其生長發(fā)育、種群數(shù)量及地理分布都會產(chǎn)生很大的影響，研究昆蟲對高溫和低溫脅迫的應對，有利于分析其地理分布和對環(huán)境的適應力［6］，尤其在利用引進的生防天敵控制入侵生物過程中發(fā)揮重要的作用，因此，研究蓮草直胸跳甲對溫度脅迫的響應機制對科學防控空心蓮子草具有重要意義。

熱激蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一種抗逆蛋白，在細胞受到脅迫時表達量會增加，對細胞起到一種保護作用，幫助生物機體適應不利環(huán)境條件［7-8］。熱激蛋白按分子量大小分為HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和小分子熱激蛋白［9-10］。HSP90最初是在果蠅 Drosophila中發(fā)現(xiàn)的，因其體內(nèi)只有一個分子量為83 kD的HSP90家族蛋白，故又稱HSP83家族［11］。目前熱激蛋白的相關(guān)研究已在鞘翅目、鱗翅目、雙翅目昆蟲及線蟲等多個物種中開展。例如，對沙棘木蠹蛾Eogystia hippophaecola進行-10、-5、0、5℃低溫處理2 h后，其EhHSP90的表達水平相較于25℃對照有顯著上升［12］;同樣地，草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda雌雄成蟲在36℃高溫和4℃低溫脅迫下SfHSP90表達量均顯著提高［13］。

蓮草直胸跳甲種群對溫度適應力較弱，冬季低溫影響其越冬使得種群數(shù)量在春季較低［14］，夏季高溫會使種群數(shù)量驟減［15-17］，造成空心蓮子草的暴發(fā)，降低對空心蓮子草的防控效果。前期已有研究表明將蓮草直胸跳甲成蟲在32.5～42.5℃下處理1 h后，AhHSP70均被顯著誘導表達，但其在37.5℃下相對表達量是最高的，超過40℃后其表達受到抑制，這說明AhHSP70對生物體的保護有一定范圍［18］;另外，對AhHSP90在蓮草直胸跳甲卵中高溫誘導表達的研究顯示，其表達先緩慢升高，至37.5℃時急劇上升，之后開始下降，表明其在卵的高溫耐受性中發(fā)揮一定作用［19］，而AhHSP90在蓮草直胸跳甲成蟲應對溫度脅迫中的作用有待進一步研究。

本研究利用生物信息學、RT-qPCR對AhHSP90蛋白的序列和結(jié)構(gòu)特征進行了分析，檢測了AhHSP90基因在蓮草直胸跳甲不同發(fā)育時期、雌成蟲不同組織及不同溫度脅迫下的表達模式，初步探討了AhHSP90在蓮草直胸跳甲成蟲應對溫度脅迫中的作用，為闡明蓮草直胸跳甲的溫度適應性分子機制及對空心蓮子草科學防控提供一定的理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

供試植物：空心蓮子草根莖于2018年6月采集于福建省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所南通中試基地，攜帶至河北省廊坊市中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所廊坊科研中試基地溫室，栽培溫度為（25±3）℃，采用扦插方式栽種于裝有營養(yǎng)土（黑土∶蛭石=1∶1）的塑料盒（30 cm×30 cm×30 cm）中，并不斷擴大種植規(guī)模用于試驗， 待空心蓮子草莖稈長至4～7節(jié)即可用于試驗。

供試昆蟲：蓮草直胸跳甲成蟲于2018年10月采自湖南省農(nóng)業(yè)科學院附近，攜帶至中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所廊坊科研中試基地進行室內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為（25±1）℃，相對濕度為（75±5）%，光周期為L∥D=12 h∥12 h，連續(xù)飼養(yǎng)3代以建立供試種群。

1.2?主要試劑

快速RNA小量提取試劑盒、快速RNA微量提取試劑盒，購自北京天漠科技開發(fā)有限公司;cDNA第一鏈合成試劑盒HifairⅢ 1st Stand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus），實時熒光定量PCR試劑盒Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox），均購自上海翊圣生物科技有限公司;TransStart Taq DNA Polymerase、10×TransStart Taq Buffer、dNTPs，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3?試驗方法

1.3.1?樣品采集和溫度脅迫處理

不同發(fā)育時期樣品采集：隨機選取蓮草直胸跳甲卵塊、1～3齡幼蟲、蛹、雌、雄成蟲。不同組織樣品采集：選取羽化6 d蓮草直胸跳甲雌成蟲頭、胸、消化道、卵巢、馬氏管和脂肪體6個組織。應用高低溫控溫設備（K6-CC-NR，德國Huber）進行溫度脅迫處理：將蓮草直胸跳甲羽化當天雌成蟲分別置于低溫（-5、0、5、10、15℃和20℃）及高溫（30、35℃和40℃）下處理2 h，以室溫25℃作為對照。共設置3個生物學重復，處理結(jié)束后立即液氮冷凍，保存于-80℃冰箱備用。

1.3.2?總RNA提取與cDNA第一鏈合成

利用快速RNA小量、微量提取試劑盒分別提取蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段、不同組織樣品及脅迫處理成蟲樣品總RNA，采用超微量紫外分光光度計（Nanophoto meter P330）和1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度和完整性。cDNA第一鏈的合成按照HifairⅢ 1st Stand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）說明書進行，RNA定量為1 μg，反轉(zhuǎn)錄合成后的cDNA立即用于后續(xù)試驗或-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3?AhHSP90基因生物信息學分析

在NCBI（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站下載已發(fā)表的AhHSP90核酸、氨基酸序列（MN685595.1）［19］，根據(jù)序列信息采用不同的在線網(wǎng)站或相關(guān)軟件對其結(jié)構(gòu)與功能進行分析。利用在線軟件預測AhHSP90編碼蛋白質(zhì)親疏水性（ProtScale、ProtParam）［20-21］、信號肽（SignalP 5.0）［22］、跨膜結(jié)構(gòu)域（TMHMM ver 2.0）［23］、磷酸化位點（NetPhos 3.1）［24］并進行分析。蛋白二級結(jié)構(gòu)預測利用SOPMA軟件采用自優(yōu)化序列預測方法［25］獲得。利用Phyre2 Server［26］進行蛋白三級結(jié)構(gòu)預測，三級結(jié)構(gòu)示意圖通過PyMol Molecular Graphics System（ver 2.2.3）軟件進行編輯和輸出，并利用PROCHECK 3.5［27］在線軟件獲得Ramachandran圖來評估蛋白質(zhì)3D模型的立體化學質(zhì)量和準確性。通過在線分析軟件ProDom［28］對不同物種HSP90的保守結(jié)構(gòu)域進行比對分析。AhHSP90氨基酸序列在NCBI中進行BLAST比對并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：∥www.uniprot.org/）搜索獲得不同目昆蟲、植物、細菌等HSP90的氨基酸序列，并以艱難梭菌Clostridioides difficile作為外源種群，利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法（neighbor-joining， NJ）進行聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4?實時熒光定量PCR

根據(jù)下載的AhHSP90基因序列（MN685595.1），并以蓮草直胸跳甲β-actin作為內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5.0 軟件設計熒光定量引物，具體見表1。將反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋10倍作為模板，反應體系（25 μL）：HieffqPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox）10 μL，模板1 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL。擴增程序采用兩步法：95℃預變性5 min;95℃變性10 s，60℃退火/延伸34 s，共40個循環(huán);熔解曲線為95℃變性15 s，60℃退火1 min，95℃變性30 s。以該基因表達量最低的時期或組織或25℃室溫作為對照。利用2-ΔΔCt方法［29-30］來計算AhHSP90基因在不同發(fā)育時期、不同組織和溫度脅迫下的相對表達量。 每個處理3個生物學重復。

1.4?數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，AhHSP90基因在不同發(fā)育時期、不同組織和溫度脅迫下的相對表達量差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA）的Tukey法（P＜0.05）。使用GraphPad Prism 8.0軟件對結(jié)果進行作圖，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。

2?結(jié)果與分析

2.1?AhHSP90基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能分析

2.1.1?AhHSP90的親/疏水性、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點分析

Protscale預測結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)的親水氨基酸占總氨基酸的66.0%，疏水氨基酸占34.0%，AhHSP90為親水性蛋白質(zhì)。經(jīng)SignalP 5.0 Server對AhHSP90的信號肽預測，結(jié)果顯示AhHSP90無信號肽，推測其為非分泌蛋白。通過在線程序TMHMM分析AhHSP90的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示所有氨基酸均位于細胞膜表面，表明AhHSP90無跨膜結(jié)構(gòu)域。通過NetPhos 3.1 Server對AhHSP90磷酸化位點進行預測，結(jié)果顯示其可能被磷酸化的位點包括：34個絲氨酸位點，18個蘇氨酸位點和8個絡氨酸位點（圖1）。

2.1.2?AhHSP90的二級結(jié)構(gòu)預測

利用SOPMA在線軟件預測AhHSP90的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示AhHSP90二級結(jié)構(gòu)中最豐富的構(gòu)成元件是α-螺旋（alpha helix， Hh），占比52.59%，包括376個氨基酸;β-折疊（beta turn， Tt）占總氨基酸的數(shù)量最少，僅為3.92%，包括28個氨基酸;無規(guī)則卷曲（random coil， Cc）占比28.11%，包括201個氨基酸;隨機延伸鏈（extended strand， Ee）占比15.38%，包括110個氨基酸（圖2）。

2.1.3?AhHSP90三級結(jié)構(gòu)預測

利用Phyre2 Server在線軟件預測AhHSP90的三級結(jié)構(gòu)，示意圖由PyMol Molecular Graphics System（ver.2.2.3）在線輸出（圖3a）。預測的三維結(jié)構(gòu)經(jīng)在線軟件PROCHECK 3.5評估，結(jié)果以拉氏圖（Ramachandran plot）的形式呈現(xiàn)，拉氏圖顯示87.9%的主鏈二面角位于最佳合理區(qū)域，12.1%位于額外允許區(qū)域（圖3b）。

2.2?AhHSP90系統(tǒng)發(fā)育分析及不同物種HSP90蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，蓮草直胸跳甲與赤擬谷盜Tribolium castaneum的HSP90氨基酸序列具有最高的同源性，其次是家蠶Bombyx mori，但其與艱難梭菌的HSP90分支距離最遠，被排除在其他物種之外（圖4a）。蓮草直胸跳甲與蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum、黑腹果蠅Drosophila melanogaster這兩種不同目昆蟲HSP90的距離較近，與斑馬魚Danio rerio、秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans、擬南芥Arabidopsis thaliana、釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae等4種不同物種的HSP90同源性距離不斷增大（圖4a），但仍歸于一簇。利用ProDom網(wǎng)站對不同物種HSP90蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行預測，結(jié)果顯示10條氨基酸序列具有相似的保守結(jié)構(gòu)域，均含有HSP90典型的ATPase功能域（PD000898），另外，除CdHSP90外，其余序列仍含有PD615635和PD618622這兩個單拷貝功能域（圖4b）。上述分析結(jié)果反映了熱激蛋白在核苷酸序列上高度同源及在蛋白結(jié)構(gòu)和功能上相近的這一特性。

2.3?AhHSP90基因的表達特征

熱激蛋白90基因在蓮草直胸跳甲整個發(fā)育階段均有表達，表達量存在顯著差異（P＜0.05），在卵期顯著高表達，其次是在蛹中，而在1～3齡幼蟲期、成蟲中相對表達量較低且差異不顯著，在雄成蟲中表達量最低（圖5a）。AhHSP90在雌成蟲不同組織中表達量差異顯著，在脂肪體中表達量最高，胸部的表達量次之，頭部、卵巢中表達量較低且二者差異不顯著，在馬氏管和消化道中表達量均很低且無顯著差異（圖5b）。

2.4?AhHSP90基因?qū)囟鹊捻憫治?/p>

不同溫度脅迫處理2 h后，以25℃為對照，分析蓮草直胸跳甲雌成蟲HSP90的相對表達量。RT-qPCR結(jié)果顯示，雌成蟲AhHSP90的相對表達量在40℃處理2 h后呈顯著上調(diào)，為對照組的8.95倍。除40℃外，AhHSP90在其他高、低溫下脅迫2 h的相對表達量發(fā)生一定程度的上調(diào)，但與對照相比均無顯著差異（圖6）。

3?結(jié)論與討論

熱激蛋白90的一個重要作用是參與多種信號轉(zhuǎn)導途徑，如與蛋白激酶和類固醇類激素受體等信號傳導蛋白結(jié)合形成復合體，激活它們的生物活性，其中，蛋白質(zhì)磷酸化調(diào)控著蛋白質(zhì)復合物的組裝，是調(diào)控蛋白質(zhì)功能的普遍機制 ［31-33］。由拉氏圖顯示的結(jié)果可以認為預測的AhHSP90結(jié)構(gòu)模型是合理可信的。由系統(tǒng)進化樹及保守結(jié)構(gòu)域可見HSP90在進化上高度保守，而蛋白質(zhì)折疊、構(gòu)象的轉(zhuǎn)換以及分子伴侶復合物的形成離不開ATPase功能域的參與［34］;通過C-末端含有的保守特征基序MEEVD，表明AhHSP90為胞質(zhì)型HSP90，而含有KDEL或HDEL特征基序表明其大多數(shù)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型，這種保守基序同樣存在于其他HSPs家族中［35-39］，進一步說明熱激蛋白家族具有高度保守的特性。

熱激蛋白在昆蟲的不同發(fā)育時期、不同組織中的表達模式具有多樣性［40］。熱激蛋白90基因在草地貪夜蛾幼蟲期表達量隨著發(fā)育時間增加逐漸降低，蛹期和成蟲期又逐漸上升，在頭（去除觸角和復眼）、觸角、復眼中的表達量顯著高于其他組織［13］;在蘋果蠹蛾Cydia pomonella 5齡幼蟲各組織中，CpHSP90在中腸和脂肪體中相對表達量顯著高于表皮和血淋巴［41］;在琥珀蠶Antheraea assamensis卵期先有較高表達后逐漸下降，幼蟲期隨齡期增加表達先上調(diào)后下降，在其5齡4日齡幼蟲的不同組織中差異表達［42］。本研究中蓮草直胸跳甲AhHSP90基因在不同發(fā)育時期表達的趨勢和琥珀蠶AaHSP90基因相似，其可能對卵期發(fā)育具有重要的作用;AhHSP90在脂肪體中表達量最高，而在消化道中表達量最低，不同于上述其他物種，進一步說明熱激蛋白90在不同物種的不同組織中表達具有特異性，在不同物種中所發(fā)揮的功能可能具有一定的差異性，后續(xù)應進一步探究其作用。

熱激蛋白的產(chǎn)生不僅可通過熱激誘導，當機體受到低溫、干旱、紫外輻射等非生物因素及細菌干擾、病蟲害等生物因素刺激都會使其表達［10，12］。HSP90最初因在熱應激時豐度增加被發(fā)現(xiàn) ［7，31］，目前，在許多昆蟲中已有報道，如在琥珀蠶5齡幼蟲應對低溫脅迫時HSP90的表達量顯著下降，在短時高溫下又隨溫度升高呈先顯著上調(diào)后下降的趨勢［42］，說明HSP90對機體的保護是有限的，熱激蛋白的過量表達會消耗能量并伴隨自身生理生化的變化［15，35，43］。馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata在高溫（38、44℃）下脅迫1 h后LdHSP90表達量均顯著上升，在低溫（0℃和-10℃）下脅迫1 h表達量稍有增加但均無顯著差異［35］，本研究中AhHSP90在高、低溫下脅迫2 h后表達量的變化與LdHSP90在高、低溫脅迫下的表達趨勢相似，在高溫下表達量呈上升趨勢，但40℃并未達到其表達量下降的高溫點，后續(xù)可通過設定更高的溫度及不同的脅迫時長來進一步闡明AhHSP90在抵御環(huán)境脅迫中的生物學功能，為研究蓮草直胸跳甲種群溫度適應機制提供新思路。

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（責任編輯：田?喆）