胡小華 王振營 何康來 解海翠 王月琴
摘要 篩選對靶標害蟲高效的Bt殺蟲蛋白、評價蛋白組合對靶標害蟲的殺蟲作用,對于轉(zhuǎn)基因抗蟲新品種的研發(fā)具有重要的指導意義。本文采用人工飼料混合法評價了Cry1Ab、Cry1Fa、Cry1Ca、Cry1Ba、Cry2Aa、Vip3Aa11、Vip3Aa20、Vip3Aa19共8種Bt殺蟲蛋白對亞洲玉米螟的毒力;同時評估了Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19混合蛋白對亞洲玉米螟的殺蟲作用,篩選出毒力最佳的組合比例。結(jié)果表明:Cry1Ab、Cry1Fa、Cry2Aa對亞洲玉米螟的LC50在0.24~0.72 μg/g之間,其中Cry1Ab的毒力最強,顯著高于Cry1Fa和Cry2Aa蛋白,Cry1Fa與Cry2Aa毒力無顯著性差異。Cry1Ca、Cry1Ba、Vip3Aa11、Vip3Aa20、Vip3Aa19對亞洲玉米螟的LC50均大于50 μg/g。當Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19混合比例為1∶1時,增效作用最強,增效因子分別為3.18和1.58。本研究結(jié)果為多價轉(zhuǎn)基因玉米的研發(fā)提供了重要依據(jù)。
關(guān)鍵詞 Bt;?Cry;?Vip3Aa;?亞洲玉米螟
中圖分類號: S 433.4
文獻標識碼:?A
DOI:?10.16688/j.zwbh.2021671
Abstract Selection of Bt toxin with high efficiency and evaluation of insecticidal effects between toxins against target pests is very important for development of new transgenic insect-resistant varieties. We evaluated the toxicities of Cry1Ab, Cry1Fa, Cry1Ca, Cry1Ba, Cry2Aa, Vip3Aa11, Vip3Aa19 and Vip3Aa20 against Ostrinia furnacalis by diet-incorporation bioassay, as well as the possible interaction between Cry1Ab and Vip3Aa19, Cry1Fa and Vip3Aa19 toxins, and select the proportion of the best combination of toxins. The LC50 values of Cry1Ab, Cry1Fa and Cry2Aa ranged from 0.24 to 0.72 μg/g. Among them, Cry1Ab had the highest toxicity, significantly different from Cry1Fa and Cry2Aa, and Cry1Fa and Cry2Aa had no significant difference. The LC50 values for Cry1Ca, Cry1Ba, Vip3Aa11, Vip3Aa20 and Vip3Aa19 were all higher than 50 μg/g. When bioassays were performed with toxin mixture at the ratio of 1∶1, the Cry1Ab/Vip3Aa19 and Cry1Fa/Vip3Aa19 showed synergistic effect, with synergism factors of 3.18 and 1.58, respectively. The above results could be useful for developing of pyramided transgenic maize.
Key words Bacillus thuringiensis;?Cry;?Vip3Aa;?Ostrinia furnacalis
自1996年美國首次批準商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米防治歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis以來,轉(zhuǎn)基因作物在全球范圍內(nèi)已經(jīng)連續(xù)種植25年。截至2019年,全球26個國家種植了1.904億hm2轉(zhuǎn)基因作物[1]。轉(zhuǎn)基因抗蟲作物不僅有效防治了靶標害蟲,減少了殺蟲劑的使用量,而且保護了天敵和生物多樣性,增加了農(nóng)民的收入[2-4]。然而,轉(zhuǎn)基因作物的大面積推廣使靶標害蟲長期處于一定的篩選壓力之下,導致田間抗性種群的產(chǎn)生,如亞澳白裙夜蛾Busseola fusca和地中海玉米蛀莖夜蛾Sesamia nonagrioides對Cry1Ab、西部玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera 對Cry3Bb1、小蔗螟Diatraea saccharalis 對Cry1F 和Cry1A.105等[5-8]。
第一代轉(zhuǎn)基因玉米主要表達Cry1Ab蛋白(‘MON810‘Bt11‘Bt176)、Cry1Ac蛋白(‘DBT-418)、Cry1F蛋白(‘TC1507)、Cry9C蛋白(‘CHB-351);第二代轉(zhuǎn)基因抗蟲作物是將兩個或者多個基因同時導入同一植株內(nèi),用來防治同一種害蟲,達到延緩抗性產(chǎn)生、擴大殺蟲譜的目的[9]。如‘MON89034(表達Cry2Aba/Cry1A.105蛋白)、‘MON88017(表達Cry1Fa/Cry1Ab蛋白)、‘Bt11×MIR162(表達Cry1Ab/Vip3Aa20蛋白)等[10]。選擇蛋白組合時,不僅要考慮蛋白的互補性、蛋白結(jié)合受體位點的能力,同時需要考慮蛋白間的協(xié)同增效作用或拮抗作用[11]。增效作用能提高防治效力,達到1+1>2 的效果;相反,拮抗作用削弱了聚合多種Bt殺蟲蛋白的優(yōu)勢,降低防治效果。蛋白之間的相互作用可以通過評價單個蛋白的毒力和蛋白混合物的毒力效果來判斷[12]。
亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis是為害我國玉米的重要害蟲,對玉米生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)安全造成嚴重的威脅[13-14]。室內(nèi)生測表明多種Cry1類蛋白對玉米螟具有較高的毒力,如Cry1Aa、Cry1Ac、Cry1Ah、Cry1Ie[15-17]等;田間抗性鑒定結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米‘Bt799‘Bt11和‘MON810對亞洲玉米螟有很高的殺蟲效果和良好的田間抗螟性[18-20]。草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda 是世界性重大遷飛害蟲,自2019年1月入侵我國云南省后,進一步蔓延擴散至黃淮海夏玉米主產(chǎn)區(qū),對我國玉米等作物生產(chǎn)安全構(gòu)成嚴重威脅。室內(nèi)生測結(jié)果表明:轉(zhuǎn)cry1Ab基因玉米和轉(zhuǎn)cry1Ab/vip3Aa玉米對草地貪夜蛾具有良好的控制效果[21]。2020年1月21日,國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米‘DBN9936(表達Cry1Ab蛋白)和‘瑞豐125(表達Cry1Ab和Cry2Aj蛋白)獲得了在北方春玉米區(qū)的生產(chǎn)應(yīng)用安全證書;2021年1月11日,‘DBN9936擴區(qū)審批至黃淮海夏玉米區(qū)、西南玉米區(qū)、南方玉米區(qū)。2021年,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對轉(zhuǎn)基因玉米開展了產(chǎn)業(yè)化試點。
Cry1Ab、Cry1Fa和Vip3A是目前國際上商業(yè)化應(yīng)用最廣泛的防治鱗翅目害蟲的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米表達的 Bt 殺蟲蛋白,因此,本文評估了8種殺蟲蛋白(Cry1Ab、Cry1Fa、Cry1Ba、Cry1Ca、Cry2Aa、Vip3Aa11、Vip3Aa19、Vip3A20)和2個組合(Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19)對亞洲玉米螟的毒力,篩選出Cry1Ab和Cry1Fa分別與Vip3Aa19組合的最佳毒力的比例,為多價轉(zhuǎn)基因玉米的研發(fā)提供科學依據(jù)。
1?材料與方法
1.1?供試昆蟲
亞洲玉米螟室內(nèi)敏感種群:原始種群于2015年6月采集自吉林省松原市普通玉米種植田,在室內(nèi)無瓊脂人工飼料[22]上連續(xù)飼養(yǎng)多代,飼養(yǎng)過程中未接觸任何殺蟲劑或Bt殺蟲蛋白。
幼蟲在溫度(27±1)℃、相對濕度70%~80%、光周期L∥D=16 h∥8 h的條件下飼養(yǎng)。
1.2?供試Bt殺蟲蛋白
Cry1Ab、Cry1Fa、Cry1Ca、Cry1Ba、Cry2Aa活化蛋白購自北京樂士寧科技有限公司(由美國Case Western Reserve University的Marianne P. Carey實驗室生產(chǎn),經(jīng)胰蛋白酶活化的毒素),純度為98%的白色粉末晶體,均用50 mmol/L、pH=10的Na2CO3溶解。Vip3Aa19、Vip3Aa20分別由北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司和先正達生物科技有限公司提供,均用1 mmol/L、pH=10的PBS溶解。Vip3Aa11購自美延(北京)農(nóng)業(yè)科技有限責任公司,用1 mmol/L、pH=10的PBS溶解。
1.3?毒力測定
采用人工飼料混合法測定Bt殺蟲蛋白對亞洲玉米螟幼蟲的毒力,人工飼料配方具體參考宋彥英等[22]。主要步驟如下:
1)將Bt殺蟲蛋白設(shè)置6~9個濃度梯度,保證幼蟲死亡率在10%~90%。Cry1Ab和Cry1Fa的濃度設(shè)置為0、0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5 μg/g;Cry2Aa的濃度設(shè)置為0、0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、12.5、25.0 μg/g;Cry1Ba、Cry1Ca、Vip3Aa11、Vip3Aa19、Vip3Aa20的濃度設(shè)置為0、0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、12.5、25.0、50.0 μg/g。
2)混合蛋白與飼料。將對應(yīng)劑量的蛋白加入蒸餾水中,混合均勻后與無瓊脂半人工干粉飼料攪拌混勻,同時設(shè)置蒸餾水作為空白對照。
3)接入幼蟲并封口。將混合均勻的人工飼料分裝到 48孔培養(yǎng)板中,每孔用毛筆挑入1頭初孵幼蟲(孵化時間<12 h),每個蛋白濃度3個重復,每個重復48頭,共144頭。然后用封口膜覆蓋(Cat# 3M-9733, Minnesota Mining and Manufacturing Company, Minnesota, USA),防止試蟲逃逸。并用解剖針扎孔,保證空氣流通,避免濕度太大造成幼蟲死亡。
4)飼養(yǎng)并調(diào)查結(jié)果。將所有培養(yǎng)板放置在溫度(27±1)℃、相對濕度70%~80%、光周期L∥D=16 h∥8 h的培養(yǎng)箱內(nèi),飼養(yǎng)期間無需更換或添加飼料,7 d后調(diào)查試驗結(jié)果,記錄每板幼蟲死亡數(shù)量。幼蟲死亡評判標準:用毛筆輕觸蟲體尾部,蟲體無反應(yīng)或單頭存活幼蟲體重<0.1 mg。
1.4?數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
用對數(shù)-幾率值法模擬劑量-死亡率反應(yīng)曲線,統(tǒng)計計算過程采用PoloPlus Probit軟件。根據(jù)95%置信區(qū)間判斷差異性,如果置信區(qū)間有重疊,則無顯著差異;如果置信區(qū)間無重疊,則有顯著差異。
通過比較實際死亡率和預期死亡率,評價Cry類和Vip3A類蛋白間的相互作用。預期死亡率是在兩種蛋白間不存在相互作用且獨立發(fā)揮作用的假設(shè)下得到的死亡率[23]。根據(jù)Tabashnik的方法[11]:
LC50(m)=1raLC50(a)+rbLC50(b)
其中,LC50(m):混合蛋白預期致死中濃度;LC50(a)和LC50(b)分別是蛋白a和蛋白b對靶標害蟲的致死中濃度;ra和rb分別是a蛋白和b蛋白在混合蛋白中的比例。增效因子(synergism factor,SF)按如下公式計算:
SF=LC50(m)LC50
其中,LC50為混合蛋白對靶標害蟲的實際致死中濃度。當SF>1時,表現(xiàn)為增效作用;當SF=1時,表現(xiàn)為疊加作用;當SF<1時,表現(xiàn)為拮抗作用。
2?結(jié)果與分析
2.1?8種Bt殺蟲蛋白對亞洲玉米螟的毒力
8種Bt殺蟲蛋白對亞洲玉米螟幼蟲的毒力測定結(jié)果如表1所示。LC50從0.24 μg/g到大于50 μg/g,其中Cry1Ab對亞洲玉米螟的毒力最強,LC50僅為0.24 μg/g。Cry1Fa和Cry2Aa對亞洲玉米螟的毒力顯著低于Cry1Ab,LC50分別為0.52 μg/g和0.72 μg/g,但是兩種蛋白的毒力不存在顯著差異。Cry1Ba、Cry1Ca、Vip3Aa11、Vip3Aa19、Vip3Aa20對亞洲玉米螟的致死效果差,LC50均大于50 μg/g (表1)。
2.2?Cry1Ab和Vip3Aa19蛋白混合后對亞洲玉米螟的毒力
為了進一步明確Cry1Ab和Vip3Aa19之間的相互作用,評價了兩種蛋白在不同混合比例下對亞洲玉米螟初孵幼蟲的毒力,結(jié)果見表2。當Cry1Ab和Vip3Aa19混合的比例分別為1∶1和1∶2時,SF分別為3.18和1.32,均大于1,表明存在增效作用。其他比例組合的實際LC50均高于預期LC50,SF值范圍為0.49~0.96,說明存在一定的拮抗作用。
2.3?Cry1Fa和Vip3Aa19蛋白混合對亞洲玉米螟的毒力
Cry1Fa/Vip3Aa19在不同混合比例下對亞洲玉米螟初孵幼蟲的毒力測定結(jié)果表明:當Cry1Fa/Vip3Aa19混合比例為1∶1和1∶2時,實際LC50均低于預期LC50,SF分別為1.58和1.32,均大于1,存在較弱的增效作用。當兩種蛋白的混合比例為5∶1時,SF為1,表現(xiàn)為簡單的相加作用。當兩種蛋白的混合比例為2∶1和1∶5時,SF均小于1,說明存在一定的拮抗作用(表3)。
3?結(jié)論與討論
不同Bt殺蟲蛋白的殺蟲譜不同,且對靶標害蟲的毒力不同。因此,在研發(fā)轉(zhuǎn)基因作物時,有必要評估不同Bt殺蟲蛋白對靶標害蟲的毒力。本文采用飼料混合法評價了8種Bt殺蟲蛋白對亞洲玉米螟的毒力,其中Cry1Ab對玉米螟初孵幼蟲的毒力效果最好,顯著高于另外7種蛋白。Cry1Ab除了對亞洲玉米螟具有較強的毒力外,對其他鱗翅目害蟲也具有較強的毒力,包括歐洲玉米螟、小菜蛾P(guān)lutella xylostella、草地貪夜蛾等[24-26]。1996年,以歐洲玉米螟和巨座玉米螟D.grandiosella為靶標害蟲的轉(zhuǎn)單價Bt玉米在美國商業(yè)化種植,包括轉(zhuǎn)cry1Ab玉米(‘Bt11‘MON810)和轉(zhuǎn)cry1Ac玉米(‘DBT-418)[9]。2002年,為了擴大殺蟲譜、延緩抗性產(chǎn)生,美國和澳大利亞率先批準種植轉(zhuǎn)雙價基因棉花‘Bollgard II(表達Cry1Ac/Cry2Ab蛋白)防治美洲棉鈴蟲 Helicoverpa zea 和棉鈴蟲H.armigera。2011年,阿根廷開始種植‘Bt11×MIR162,主要防治草地貪夜蛾、小蔗螟等鱗翅目害蟲[8,27-28]。前期研究結(jié)果表明,Vip3Aa對黏蟲Mythimna separata、草地貪夜蛾、粉紋夜蛾Trichoplusia ni、煙芽夜蛾Heliothis virescens等鱗翅目害蟲均具有較好的毒力[29-31],本研究結(jié)果顯示Cry1Ba、Cry1Ca、Vip3Aa對亞洲玉米螟沒有毒力,可能是因為這些蛋白在玉米螟幼蟲中腸上不存在相應(yīng)的特異性結(jié)合位點。但是Vip3Ca對亞洲玉米螟敏感品系和Cry1Ab抗性品系均具有很好的毒力[32]。該試驗結(jié)果為新基因的挖掘、轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)提供了重要的參考信息。
隨著轉(zhuǎn)基因作物的不斷推廣,靶標害蟲的抗性問題引起越來越多的重視。但在選擇多個基因疊加時,不僅要考慮單個基因的毒力,還要考慮蛋白之間的相互作用[11, 33]。多個研究表明,當Cry類和Vip類蛋白混合時,存在增效、拮抗或者疊加作用。Bergamasco等[34]報道了Cry1Ia10和Vip3Aa相互作用的物種特異性。體外競爭結(jié)合試驗表明,在草地貪夜蛾體內(nèi),Cry1Ia10和Vip3Aa具有不同的結(jié)合位點,表現(xiàn)為增效作用。在灰翅夜蛾S.eridania體內(nèi),兩種蛋白競爭結(jié)合同一個受體位點,表現(xiàn)為明顯的拮抗作用[34]。Cry9Aa和Vip3Aa蛋白在水稻二化螟Chilo suppressalis體內(nèi)存在特異性結(jié)合并具有不同的受體結(jié)合位點是協(xié)同增效作用的主要因素[35]。本研究發(fā)現(xiàn)當Cry1Ab和Vip3Aa19、Cry1Fa和Vip3Aa19為1∶1混合時,表現(xiàn)為增效作用,表明共表達兩種蛋白將提高轉(zhuǎn)基因作物對亞洲玉米螟的防治效果,延緩抗性的產(chǎn)生。Vip3Aa和Cry1Ab對草地貪夜蛾具有顯著的增效作用[36];Cry1Fa和Vip3Aa19對黏蟲亦有顯著的增效作用[30, 37]。除了受體位點的不同,蛋白間氨基酸序列的差異也可能是產(chǎn)生增效作用的原因[38]。同種蛋白組合的相互作用可能因為受試靶標的不同而不同。比如Cry1Ca 和Vip3Aa對草地貪夜蛾表現(xiàn)為拮抗作用,而對小蔗螟表現(xiàn)為增效作用。
不同蛋白組合的增效作用是提高蛋白毒力的方法之一。評價混合蛋白的相互作用,利用啟動子調(diào)控Bt殺蟲蛋白的表達量,可以最大程度地提高轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲作用,實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因作物與Bt生物資源的可持續(xù)利用。本研究結(jié)果將為中國的轉(zhuǎn)基因玉米研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),促進轉(zhuǎn)基因玉米的可持續(xù)應(yīng)用。
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(責任編輯:田?喆)