運(yùn)輸時間對高體鰤幼魚應(yīng)激、代謝、抗氧化和免疫的影響

王文雯,楊靜茹,付正祎,于剛,馬振華,4*

(1.三亞熱帶水產(chǎn)研究院,海南 三亞 572018;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,廣東 廣州 510300;3.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧 大連,116000; 4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外海漁業(yè)可持續(xù)利用重點(diǎn)實驗室,廣東 廣州 510300)

活魚運(yùn)輸是魚類生產(chǎn)過程中的重要環(huán)節(jié),通常魚類的生存環(huán)境突然改變會對魚體的生理機(jī)能產(chǎn)生影響[1]。氧氣袋充氧運(yùn)輸具有體積小、用水量少、成活率高等優(yōu)點(diǎn), 廣泛用于水產(chǎn)苗種運(yùn)輸, 而運(yùn)輸時間長會導(dǎo)致氧氣袋內(nèi)水質(zhì)惡化,氨氮濃度升高[2]。相比于正常情況,魚類在發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時,體內(nèi)激素分泌和物質(zhì)能量代謝等生理變化和生化反應(yīng)的過程會發(fā)生顯著的變化,使其免疫功能下降,影響魚體的健康甚至威脅生命。在魚類運(yùn)輸過程中,導(dǎo)致其產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的原因有很多,例如氨氮脅迫、溫度脅迫及酸堿度因子改變等[3]。

高體鰤(Serioladumerili),又名杜氏鰤、紫鰤,屬硬骨魚綱(Osteichthyes)、鱸形目(Perciformes)、鲹科(Carangidae)、鰤屬(Seriola)。體長圓形,吻大于眼徑,為暖水性中上層魚類,較適宜高體鰤生長的pH為7.8～8.4。生存水溫為9.0～33.0 ℃,適宜水溫為20～30.0 ℃。攝食的水溫范圍14.0～30.0 ℃[4],且具有生長速度快、養(yǎng)殖周期短的特點(diǎn)。

目前,隨著高體鰤養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展,對其魚苗的需求量也日漸增多,魚苗運(yùn)輸頻繁,因此探究運(yùn)輸時間對高體鰤幼魚應(yīng)激、代謝、抗氧化及免疫所產(chǎn)生的影響,保證運(yùn)輸過程中魚苗質(zhì)量顯得非常重要。目前關(guān)于高體鰤幼魚運(yùn)輸時間的研究報道較少,本實驗采用塑料袋密閉降溫充氧模擬運(yùn)輸,主要目的是為了進(jìn)一步了解其在運(yùn)輸時間的脅迫下,對高體鰤幼魚應(yīng)激、代謝、抗氧化和免疫的影響。量化了高體鰤幼魚在運(yùn)輸過程中的應(yīng)激程度,總結(jié)了最優(yōu)的高體鰤幼魚運(yùn)輸密度和運(yùn)輸時長,以便提供更科學(xué)的運(yùn)輸方法,減少運(yùn)輸過程中對高體鰤幼魚的傷害。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與材料

本研究所用高體鰤幼魚[體重(19.00±3.00) g,體長(10.34±1.33) cm]采集自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心陵水試驗基地,實驗前轉(zhuǎn)至室內(nèi)循環(huán)水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)一周,水的溫度、鹽度以及pH值分別為25.40 ℃、4.80和7.26。

本研究所用試劑主要包括:總RNA提取試劑Trizol(中國白鯊)、50×TAE電泳緩沖液(中國南京建成生物工程研究所)、核酸染料(上海生工生物工程股份有限公司)、EasyScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京金式金生物技術(shù)有限公司)、SYBR Green RealUniversal彩色熒光定量試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。丙二醛(中國南京建成生物工程研究所)、糖原(中國南京建成生物工程研究所)。

本研究所用儀器設(shè)備主要包括:勻漿機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司,Bioprep-24)、冷凍離心機(jī)(德國Biofuge公司, D-37520)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司,DYY-6C)、微紫外分光光度計(中國北京百泰克生物技術(shù)有限公司,ND5000),PCR熱循環(huán)儀(中國杭州晶格科學(xué)儀器有限公司,T960)、熒光定量PCR儀(Analytik Jena儀器公司,qTower3)、凝膠成像系統(tǒng)(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司,LG2020)

1.2 模擬運(yùn)輸實驗方法

實驗前先將高體鰤幼魚禁食24 h。設(shè)置3組運(yùn)輸時間分別為4、8和12 h,在運(yùn)輸時間不同的3個組中,每組設(shè)置3個平行,每袋放入大小相似的高體鰤幼魚5尾,共45尾。每個實驗組注入海水4 L,并把袋子內(nèi)空氣排空,充入純氧。充氧完畢后快速使用橡皮筋封口,置于溫度為25.40 ℃的泡沫箱中。模擬運(yùn)輸實驗期間禁止打開塑料袋,同時在24.70 kg/m3運(yùn)輸密度下進(jìn)行運(yùn)輸[5-7]。每隔1 h搖動一次箱子,每次晃動5下,用于模擬運(yùn)輸中的震動[8]。

1.3 采集和分析

運(yùn)輸后,記錄各組水的溫度、pH和溶解氧(Dissolved oxygen,DO)。每袋取500 mL水樣,使用多參數(shù)水質(zhì)儀測定氨氮濃度。從每個袋子隨機(jī)取出3條魚,用1 mL注射器從靜脈采血,3 500g離心10 min,收集血清并在-80 ℃下儲存,直至分析。在分析中,每組3個重復(fù),取適量的整魚組織,置于2 mL離心管中,以1∶9(v/v)的比例加入0.86%生理鹽水溶液,并用勻漿機(jī)勻漿。勻漿在3 500g下離心10 min,收集上清液并于-80 ℃保存待酶活性分析。

1.3.1 總RNA的提取和cDNA的合成

高體鰤幼魚鰓和肝臟研磨后,使用總RNA提取劑Trizol提取組織總RNA。通過瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳測試RNA。當(dāng)OD260/280在1.8～2.0范圍內(nèi)時,認(rèn)為該方法有效。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒EasyScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄[9],合成模板cDNA。

1.3.2 免疫基因熒光定量分析

實時定量PCR分析由PCR系統(tǒng)運(yùn)行。熱循環(huán)程序如下:①預(yù)變性:95 ℃初始變性15 min;②擴(kuò)增反應(yīng):95 ℃變性10 s,循環(huán)40次,56 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s;③熔解曲線分析為單峰,確定在每個PCR反應(yīng)結(jié)束時不存在非特異性產(chǎn)物。每個樣品反應(yīng)體系為20 μL,其中包含:10 μL 2×RealUniversal,上、下游引物各0.6 μL(10 μmol/L),2 μL模板cDNA和6.8 μL RNase-free ddH2O。將cDNA模板進(jìn)行10倍稀釋后建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,引物擴(kuò)增效率在90%～110%。β-actin作內(nèi)參基因,根據(jù)2-ΔΔCt計算法進(jìn)行相對熒光值計算。具體引物見表1。

表1 免疫相關(guān)引物序列

1.3.3 成活率計算公式

成活率(%)=100×(Nt/N0)

式(1)

公式中:Nt代表實驗結(jié)束時魚的尾數(shù),N0代表實驗開始時魚的尾數(shù)。

1.3.4 統(tǒng)計分析

采用Origin 2021作圖,SPSS 26.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均以標(biāo)準(zhǔn)差(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗。P<0.05認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同運(yùn)輸時間水質(zhì)和高體鰤幼魚成活率變化分析

不同運(yùn)輸時間下水體溫度、pH、溶解氧、氨氮值和高體鰤幼魚成活率如表2所示:在3個時間組中,運(yùn)輸12 h時的水溫顯著升高(P<0.05)。pH隨運(yùn)輸時間增長顯著降低(P<0.05),12 h組中pH最低。溶解氧在4 h組和8 h組中差異不顯著,但隨著時間增加,在達(dá)到12 h時溶解氧最低,顯著低于4 h和8 h(P<0.05)。氨氮濃度隨時間增長逐漸升高,但在8 h和12 h組中差異不顯著。隨著運(yùn)輸時間的增加對高體鰤幼魚的成活率沒有顯著影響。

表2 不同運(yùn)輸時長水質(zhì)指標(biāo)和高體鰤幼魚成活率變化分析

2.2 不同運(yùn)輸時間高體鰤幼魚應(yīng)激指標(biāo)變化分析

2.2.1 不同運(yùn)輸時間高體鰤幼魚肝應(yīng)激的影響

高體鰤幼魚經(jīng)過密閉充氧運(yùn)輸不同時間后,熱休克蛋白70(HSP70)、熱休克蛋白90(HSP90)和糖皮質(zhì)激素受體(GR)在肝臟中的表達(dá)水平如圖1所示,圖1(a)中HSP70在運(yùn)輸8 h的表達(dá)水平顯著高于4 h和12 h,具有顯著性差異(P<0.05)。圖1(b)中HSP90在運(yùn)輸4 h的表達(dá)水平顯著高于8 h、12 h,存在顯著性差異(P<0.05)。圖1(c)中GR在運(yùn)輸4 h時的表達(dá)水平顯著低于8 h和12 h(P<0.05)。

圖1 不同運(yùn)輸時間對高體鰤幼魚肝臟應(yīng)激的影響

2.2.2 不同運(yùn)輸時間高體鰤幼魚鰓應(yīng)激指標(biāo)的變化

高體鰤幼魚經(jīng)過密閉充氧運(yùn)輸不同時間后, HSP70、HSP90和GR在鰓中的表達(dá)水平如圖2所示,在圖2(a)中,HSP70在運(yùn)輸8 h時的表達(dá)水平最高,顯著高于4 h和12 h時的表達(dá)水平(P<0.05)。在圖2(b)中,HSP90在三組間不具有顯著性差異。在圖2(c)中,GR表達(dá)水平在三組間不具有顯著性差異。

圖2 不同運(yùn)輸時間對高體鰤幼魚鰓應(yīng)激的影響

2.3 不同運(yùn)輸時間高體鰤幼魚代謝指標(biāo)變化分析

2.3.1 不同運(yùn)輸時間高體鰤幼魚肝代謝指標(biāo)的變化

經(jīng)過密閉充氧運(yùn)輸不同時間后,丙酮酸激酶(PK)、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT-1)、糖原(GLY)和葡萄糖激酶(GK)在肝臟中的表達(dá)水平如圖3所示,8 h組PK的表達(dá)水平顯著低于4 h和12 h,并與4 h和12 h存在顯著性差異(P<0.05),4 h和12 h無顯著性差異;而在CPT-1表達(dá)水平可以看出,12 h時的CPT-1表達(dá)水平顯著高于4 h和8 h,并存在顯著性差異(P<0.05),但4 h和8 h的CPT-1表達(dá)水平無顯著性差異。從GLY表達(dá)水平中可以看出,4 h的GLY濃度顯著高于8 h和12 h,12 h的GLY濃度顯著高于8 h的GLY濃度,三組間均存在顯著性差異(P<0.05)。GK表達(dá)水平在12 h時顯著高于4 h和8 h,且三組間均具有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 不同運(yùn)輸時間高體鰤幼魚肝臟代謝的影響

2.3.2 不同運(yùn)輸時間高體鰤幼魚鰓代謝指標(biāo)的變化

經(jīng)過密閉充氧運(yùn)輸不同時間后, PK、CPT-1和GK在鰓中的表達(dá)水平如圖4所示,從圖4(a)可分析出8 h組的PK表達(dá)水平顯著高于4 h和12 h(P<0.05),4 h和12 h無顯著性差異;在圖4(b)中,8 h組的CPT-1表達(dá)水平顯著高于4 h和12 h(P<0.05),而4 h和12 h的CPT-1表達(dá)水平無顯著性差異;在圖4(c)中可以看出8 h組GK的表達(dá)水平顯著高于4 h和12 h,具有顯著性差異(P<0.05),而4 h和12 h的GK表達(dá)水平相比差異不顯著。

圖4 不同運(yùn)輸時間高體鰤幼魚鰓代謝的影響

2.4 不同運(yùn)輸時間高體鰤幼魚抗氧化指標(biāo)變化分析

2.4.1 不同運(yùn)輸時間高體鰤幼魚肝抗氧化的影響

經(jīng)過密閉充氧不同時長運(yùn)輸實驗后,銅超氧化物歧化酶(Cu-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和谷胱甘肽還原酶(GSR)在肝臟中的表達(dá)水平如圖5所示:Cu-SOD、Mn-SOD和CAT的表達(dá)水平在12 h均顯著高于4 h和8 h(P<0.05),4 h和8 h均不具有顯著性差異;在GSH-PX表達(dá)水平和GSR表達(dá)水平方面,12 h與4 h和8 h間均具有顯著性差異(P<0.05),4 h與 8 h的GSH-PX表達(dá)水平和GSR表達(dá)水平均不具有顯著性差異。圖6是在不同運(yùn)輸時間對高體鰤幼魚MDA濃度的影響,丙二醛(MDA)濃度在運(yùn)輸4 h時與8 h和12 h間無顯著性差異,但12 h的MDA濃度顯著高于8 h(P<0.05)。

圖5 不同運(yùn)輸時間對高體鰤幼魚肝臟抗氧化的影響

圖6 不同運(yùn)輸時間對高體鰤幼魚肝臟MDA濃度的影響

2.4.2 不同運(yùn)輸時間高體鰤幼魚鰓抗氧化的影響

經(jīng)過密閉充氧不同時間運(yùn)輸實驗后,在鰓中的表達(dá)水平如圖7所示,8 h的Cu-SOD的表達(dá)水平顯著高于4 h和12 h(P<0.05);4 h的Mn-SOD與8 h時無顯著性差異,4 h和8 h 時Mn-SOD的表達(dá)水平顯著低于12 h,12 h組與其他兩組具有顯著性差異(P<0.05); CAT表達(dá)水平中,4 h與12 h不存在顯著性差異,8 h顯著高于4 h和12 h,具有顯著性差異(P<0.05);在GSH-PX的表達(dá)水平和GSR的表達(dá)水平中可以看出,8 h與相鄰組間均存在顯著性差異(P<0.05);隨著運(yùn)輸時間的增加,丙二醛(MDA)濃度也逐漸升高,12 h時高于4 h和8 h,三組間差異顯著(P<0.05)。

圖7 不同運(yùn)輸時間對高體鰤幼魚鰓抗氧化的影響

2.5 不同運(yùn)輸時間高體鰤幼魚免疫指標(biāo)變化分析

2.5.1 不同運(yùn)輸時間高體鰤幼魚肝免疫的影響

經(jīng)過密閉充氧運(yùn)輸不同時長后,肝臟中免疫基因的表達(dá)水平如圖8所示:在抗體方面,12 h的免疫球蛋白T(IGT)和主要組織相容性復(fù)合物(MHC-1)的表達(dá)水平顯著高于4 h和8 h,三組具有顯著性差異(P<0.05)。在細(xì)胞因子方面,腫瘤壞死因子(TNF-α)在12 h的表達(dá)水平顯著高于4 h和8 h(P<0.05),8 h的表達(dá)水平顯著低于4 h和12 h(P<0.05);在轉(zhuǎn)錄因子方面,三組間核因子KB(NF-KB1)的相對表達(dá)量無顯著性差異。

圖8 不同運(yùn)輸時間對高體鰤幼魚肝免疫的影響

2.5.2 不同運(yùn)輸時間高體鰤幼魚鰓免疫的影響

經(jīng)過密閉充氧運(yùn)輸不同時長后,鰓中免疫基因的表達(dá)水平如圖9所示:在抗體方面,12 h的MHC-1表達(dá)水平顯著低于4 h和8 h,具有顯著性差異(P<0.05),而4 h與8 h 的MHC-1表達(dá)水平無顯著性差異。在轉(zhuǎn)錄因子方面,三組間8 h 的NF-KB1表達(dá)量顯著高于相鄰兩組,且12 h同樣顯著高于4 h,三組間均具有顯著性差異(P<0.05)。在細(xì)胞因子方面,干擾素(IFN-γ)4 h的表達(dá)水平顯著高于8 h和12 h,與其他兩組有顯著性差異(P<0.05),8 h與12 h無顯著性差異。

圖9 不同運(yùn)輸時間對高體鰤幼魚鰓免疫的影響

3 討論

3.1 不同運(yùn)輸時間對水質(zhì)的影響

氧氣在魚類保活運(yùn)輸過程中起著至關(guān)重要的作用。在運(yùn)輸過程中,塑料袋內(nèi)含氧量過低會對活魚造成低氧脅迫,發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[3],對魚體抗氧化、免疫等有著關(guān)鍵影響。運(yùn)輸水質(zhì)會隨著時間的增加而惡化,對魚類的存活、?；顣r間、魚苗體質(zhì)健康等有著至關(guān)重要的影響[10-11]。研究表明,黑尾近紅鲌(Ancherythroculternigrocauda)[5]和翹嘴鲌(Culteralburnus)[12]幼魚在運(yùn)輸過程中,氨氮會隨著時間的增加而升高,溶解氧和pH降低,與本研究結(jié)果一致。本研究在實驗開始前水體清澈見底,隨著運(yùn)輸時間的增加,高體鰤幼魚自身呼吸代謝釋放出過多二氧化碳,導(dǎo)致pH降低,氨氮濃度增加。在運(yùn)輸過程中,魚體代謝產(chǎn)物及體表粘液是水體中氨氮的主要來源,而氨氮也是主要的環(huán)境脅迫因子,氨氮值因為水的pH、溫度不同,分為離子氨和非離子氮,離子氨極易造成水體渾濁,阻礙魚體正常攝入氧氣;而非離子氮作為脂溶性物質(zhì),容易對魚鰓造成傷害,使魚體形成氨中毒,造成魚體應(yīng)激反應(yīng)。過低的溶解氧含量同樣會導(dǎo)致魚體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),短時間缺氧在溶解氧濃度恢復(fù)后,魚的肝臟損傷雖然略有恢復(fù)但無法恢復(fù)到初期[13-14]。

3.2 不同運(yùn)輸時間對高體鰤幼魚應(yīng)激的影響

運(yùn)輸應(yīng)激是魚類在運(yùn)輸過程中,由于禁食、振動的水體、溫度和溶解氧等突然發(fā)生改變從而引起不同程度的氧化應(yīng)激反應(yīng)[15]。氧化應(yīng)激發(fā)生時,可導(dǎo)致魚體的脂類、蛋白質(zhì)、碳水化合物和核酸的氧化損傷[16]。

熱休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPS)是一個蛋白家族,其中包括熱休克蛋白70(HSP70)和熱休克蛋白90(HSP90)。HSP70能增強(qiáng)細(xì)胞對環(huán)境變化的耐受性,提高細(xì)胞存活率[17]。有研究表明,隨著運(yùn)輸時間的增加,溶解氧逐漸降低,導(dǎo)致斑馬魚(Daniorerio)肝臟中的HSP70表達(dá)水平在其環(huán)境下顯著升高,出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)[18]。HSP90也是一種重要的應(yīng)對氧氣改變的應(yīng)激蛋白,HSP90抗體與輔助分子共同調(diào)節(jié)ATP的水解過程,促使HSP90抗體分子伴侶開始循環(huán),為該過程提供能量[19]。有研究表明虹鱒(Oncorhynchusmykiss)在受到環(huán)境脅迫時,肝臟中HSP70的表達(dá)水平顯著上升[20]。在本研究中,運(yùn)輸8 h時高體鰤幼魚的肝臟和鰓中HSP70的表達(dá)水平最高,表明由于運(yùn)輸時間的增加,此時高體鰤幼魚肝臟和鰓受到運(yùn)輸環(huán)境脅迫使體內(nèi)HSP70的表達(dá)水平升高,與虹鱒的研究結(jié)果相似。在田照輝等[21]的研究中發(fā)現(xiàn),西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)體內(nèi)的HSP70基因在不同組織中,鰓最先表達(dá)。在本研究中,高體鰤幼魚鰓中HSP70的表達(dá)水平高于肝臟內(nèi)的表達(dá)水平,表明HSP70基因在鰓組織最先有較高的誘導(dǎo)表達(dá),與西伯利亞鱘研究結(jié)果相似。HSP90對應(yīng)激的適應(yīng)也起到了重要作用,保護(hù)蛋白質(zhì)不被降解,維持細(xì)胞生存[22]。在本研究中,高體鰤幼魚肝臟內(nèi)HSP90在運(yùn)輸4 h時表達(dá)水平最高,表明當(dāng)受到脅迫時,肝臟細(xì)胞通過增加HSP90的表達(dá)來抵抗應(yīng)激。在肝臟組織中,測定了GR的表達(dá)水平,GR有著極其重要的生理功能,其在肝臟內(nèi)的表達(dá)水平最強(qiáng),可減輕對細(xì)胞的損傷。有研究表明,糖皮質(zhì)激素調(diào)控小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)[24]。GR的表達(dá)水平升高表示保護(hù)外來刺激對肝臟造成的傷害,從而減輕氧化應(yīng)激,對魚體呼吸起到一定的干預(yù)作用。在本研究中,運(yùn)輸時間越長,高體鰤幼魚肝臟內(nèi)GR的表達(dá)水平越高。

3.3 不同運(yùn)輸時間對高體鰤幼魚代謝的影響

糖原(GLY)是獲取能量的主要來源,對維持機(jī)體的能量代謝和重要功能物質(zhì)的合成有著重要的作用[23]。有研究表明,當(dāng)軍曹魚(Rachycentroncanadum)受到脅迫后,肝臟中糖原的含量會顯著下降[25],說明魚類在應(yīng)激過程中通過改變自身代謝為機(jī)體提供能量。在本研究中,運(yùn)輸8 h 和12 h的高體鰤幼魚中GLY濃度與4 h的濃度相比顯著降低,說明在運(yùn)輸過程中,高體鰤幼魚大量分解糖原,維持血糖濃度,隨著時間增加通過各種生理生化調(diào)節(jié)逐漸適應(yīng),代謝趨于正常。丙酮酸激酶(PK)和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT-1)是調(diào)節(jié)新陳代謝的酶。有研究表明在草魚(Ctenopharyngodonidella)中PK主要在肝臟中表達(dá)[26],本研究中高體鰤幼魚在運(yùn)輸8 h時其PK在鰓中表達(dá)水平最高,在肝臟中的表達(dá)水平最低,可能是運(yùn)輸時間增加,肝功能代謝受損。CPT-1是脂肪酸氧化的限速酶,在機(jī)體或組織能量不足時,催化脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化,維持血糖和能量供應(yīng)平衡。有研究表明大黃魚(Larimichthyscrocea)CPT-1在肝臟中表達(dá)水平最高[27]。本研究中,高體鰤幼魚CPT-1主要在肝臟中表達(dá),與大黃魚研究結(jié)果相似。在不同運(yùn)輸時間下,肝臟中CPT-1的表達(dá)水平在12 h時最高,表明12 h時幼魚體內(nèi)最需要血糖和能量平衡。GK是血糖調(diào)控核心器官細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝的一個關(guān)鍵酶,GK功能受損會導(dǎo)致整個機(jī)體調(diào)節(jié)系統(tǒng)失常,糖代謝紊亂[28]。在本研究中,高體鰤幼魚肝臟內(nèi)GK的表達(dá)水平隨著運(yùn)輸時間的增加顯著升高,表明此時GK抑制肝臟內(nèi)糖原分解,在維持血糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。

3.4 不同運(yùn)輸時間對高體鰤幼魚抗氧化的影響

魚體具有抗氧化防御系統(tǒng),其主要由各種抗氧化物酶類及抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽組成,可維持魚體內(nèi)自由基平衡。若長時間運(yùn)輸,導(dǎo)致應(yīng)激過強(qiáng),魚體組織因承受過大壓力而受到嚴(yán)重?fù)p傷,則機(jī)體抗氧化水平隨之降低,導(dǎo)致機(jī)體平衡被打破[10, 29]。魚類在受到外界環(huán)境刺激時,抗氧化防御體系會起到重要的作用,清除過多的活性氧離子(ROS),其中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)等物質(zhì)在免疫調(diào)節(jié)過程中也扮演著重要角色。在抗氧化酶方面,CAT、GSH-PX、Cu-SOD、Mn-SOD是重要的抗氧化酶,保護(hù)機(jī)體免受傷害。

有研究表明正常情況下機(jī)體不斷生成自由基,由于SOD的存在,又不斷的清除自由基,將其轉(zhuǎn)化為H2O2和O2保護(hù)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[30],使SOD和自由基處于一種平衡的狀態(tài),具有抑制應(yīng)激、減輕炎癥的作用。體內(nèi)SOD表達(dá)量越高,抗氧化能力越強(qiáng)[31]。在張美東等[32]的研究中發(fā)現(xiàn),鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)在受到脅迫時,其肝臟中Cu-SOD和Mn-SOD的表達(dá)水平顯著上升。在本研究中,隨著運(yùn)輸時間的增加,水中溶解氧濃度逐漸降低,高體鰤幼魚體內(nèi)Mn-SOD的表達(dá)水平隨著運(yùn)輸時間的增加不斷上升,與研究結(jié)果一致。說明運(yùn)輸時間越久,溶解氧越低,在受到低氧脅迫時,高體鰤幼魚體內(nèi)自由基水平上升,激活了體內(nèi)的抗氧化體系,使體內(nèi)過多的自由基被清除。過氧化氫酶(CAT)可以將SOD產(chǎn)生的H2O2轉(zhuǎn)化為H2O,維持氧化還原反應(yīng)的平衡。研究表明鯽(Carassiusauratus)受到脅迫時,會導(dǎo)致大量活性氧的產(chǎn)生,隨著時間的增加,肝臟和鰓組織SOD活性顯著升高[33],說明SOD在抵御脅迫時發(fā)揮了重要作用。在本實驗中運(yùn)輸時間越久,高體鰤幼魚的CAT表達(dá)量越高,可以得出存在污染物攝入情況,在一定程度上反應(yīng)機(jī)體的氧化還原狀態(tài),保護(hù)機(jī)體免受過多損傷。

GSH-PX可以將有毒的過氧化物還原為無毒的羥基化合物,從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能免受氧化物的損傷[34]。有研究表明泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)幼魚在受到脅迫時,GSH-PX的表達(dá)水平在肝臟中顯著增加[35]。本研究中高體鰤幼魚肝臟中GSH-PX的表達(dá)水平較高,在運(yùn)輸6 h時肝臟中GSH-PX的表達(dá)水平達(dá)到最高值,表明此時肝臟通過消耗機(jī)體GSH-PX來抵抗氧化應(yīng)激。MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,反映機(jī)體的氧化損傷程度[36]。在郝晨光等[37]研究中發(fā)現(xiàn),克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)在模擬運(yùn)輸時,體內(nèi)的MDA含量顯著升高。本實驗中,高體鰤幼魚受到運(yùn)輸脅迫后,鰓中MDA濃度呈逐漸上升趨勢,并在12 h時顯著高于其余兩組,說明隨著運(yùn)輸時間的增加,高體鰤幼魚體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度加劇,與郝晨光等研究結(jié)果一致。在這過程中產(chǎn)生大量的ROS來不斷激活自身的抗氧化系統(tǒng),所以導(dǎo)致SOD活性升高來清除ROS。盡管抗氧化酶活性不斷升高,但仍不能清除過多的自由基。谷胱甘肽還原酶(GSR)是一種重要的抗氧化酶,其在生物體的抗氧化系統(tǒng)中起著關(guān)鍵的作用,參與機(jī)體內(nèi)的多種生物過程[38]。在本研究中,高體鰤幼魚肝臟內(nèi)GSR酶活性隨著運(yùn)輸時間增加不斷升高,可能是由于環(huán)境因素的變化使幼魚產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),運(yùn)動加劇促使體內(nèi)發(fā)生氧化還原反應(yīng),從而使GSH酶活性升高。

3.5 不同運(yùn)輸時間對高體鰤幼魚免疫的影響

免疫是動物以維持自身穩(wěn)態(tài)為目的而進(jìn)行的一種特異性的生理反應(yīng),分為先天性免疫和適應(yīng)性免疫。先天免疫構(gòu)成魚類抵御外界病原體感染的第一道防線。適應(yīng)性免疫是負(fù)責(zé)對特定病原體產(chǎn)生特異性免疫的應(yīng)答,兩者在防御中起著重要的作用。在細(xì)胞因子方面,腫瘤壞死因子(TNF-α)是一種巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和分化T細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子,還是一種能夠直接殺傷有害細(xì)胞卻對正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子。在王維政等[25]研究中發(fā)現(xiàn),軍曹魚在受到脅迫時,TNF-α的表達(dá)水平在鰓和肝臟中均出現(xiàn)了顯著下降的趨勢。本研究高體鰤幼魚在運(yùn)輸過程中,TNF-α的表達(dá)表達(dá)水平在12 h鰓中出現(xiàn)了顯著上升的趨勢,但在肝臟中呈先上升后下降趨勢,表明運(yùn)輸脅迫中TNF-α參與高體鰤幼魚鰓和肝臟的免疫調(diào)控,與軍曹魚研究結(jié)果不一致。

核因子KB(NF-KB1)是機(jī)體重要的轉(zhuǎn)錄因子,抑制下游促炎性因子,激活后產(chǎn)生細(xì)胞因子。本研究中,NF-KB1在模擬運(yùn)輸12 h后在高體鰤幼魚肝臟中表達(dá)量最高,隨著時間的增加而升高,其在鰓的表達(dá)中,8 h時表達(dá)量最高,12 h時開始下降,說明在氧化應(yīng)激的狀態(tài)下,導(dǎo)致高體鰤幼魚機(jī)體炎癥反應(yīng)發(fā)生,使機(jī)體受到損傷。免疫球蛋白重變量(IGT)和主要組織相容性復(fù)合物(MHC-1)屬于抗體,IGT是適應(yīng)性免疫分子之一;MHC-1分子在抗原呈遞和免疫調(diào)節(jié)中起重要作用,在脊椎動物免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用,主要識別細(xì)胞內(nèi)抗原,引發(fā)適應(yīng)性免疫。在劉桓君等[39]的研究中發(fā)現(xiàn),大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)在受到脅迫時肝臟中的MHC-1表達(dá)水平顯著上升。在虹鱒魚病毒感染期間檢測到MHC-1具有相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用[40]。在本研究中,運(yùn)輸12 h后高體鰤幼魚鰓中MHC-1的表達(dá)水平顯著下調(diào),在肝臟中MHC-1的表達(dá)水平顯著上調(diào),說明在高體鰤幼魚在受到運(yùn)輸脅迫時,鰓已經(jīng)適應(yīng)此時的運(yùn)輸環(huán)境,而肝臟中MHC-1基因在幫助魚體內(nèi)清除病毒和其他病原體的感染。與研究結(jié)果相似,表明MHC-1在免疫應(yīng)答的過程中起著重要作用。IGT的表達(dá)量隨著時間的增加而升高,說明應(yīng)激導(dǎo)致IGT受環(huán)境刺激影響,起到防御作用。有研究表明,在模擬運(yùn)輸時,會導(dǎo)致牛血清中IFN-γ濃度升高[41],但在本研究中,高體鰤幼魚鰓中IFN-γ濃度呈下降趨勢,表明在模擬運(yùn)輸4 h時受到應(yīng)激刺激,導(dǎo)致魚體為增強(qiáng)免疫功能使谷胱甘肽還原酶濃度升高,但隨著時間增加,由于適應(yīng)此時環(huán)境,體內(nèi)IFN-γ濃度也隨之下降,與肉牛血清研究結(jié)果不一致。

4 結(jié)論

本實驗研究了運(yùn)輸時間對高體鰤幼魚應(yīng)激、代謝、抗氧化和免疫的影響,得出以下結(jié)論:在相同密度(24.7 kg/m3)、不同運(yùn)輸時間下(4 h、8 h、12 h)的模擬運(yùn)輸實驗中,總死亡尾數(shù)不超過一尾,說明了高體鰤幼魚對運(yùn)輸脅迫具有一定的抗逆性。但為了減少運(yùn)輸脅迫對魚苗肝臟、鰓造成的損傷,建議運(yùn)輸時間不應(yīng)超過8 h。