龍軼映 張亮 祁芳 艾坤 劉梨 趙凌云 瞿啟睿 謝輝 何可

〔摘要〕 目的 對比觀察電針和艾灸對佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis， AA）大鼠足跖容積測量、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分及分化簇4 淋巴細(xì)胞（cluster of differentiation-4+T-cell， CD4+T）水平的影響，評價(jià)兩種干預(yù)措施治療AA的效應(yīng)機(jī)制。方法 選取健康雄性大鼠24只，隨機(jī)分為空白組、模型組、電針組和艾灸組，每組6只。艾灸組予以雙側(cè)“足三里”“關(guān)元”“阿是穴”懸灸20 min；電針組左側(cè)足三里與關(guān)元配穴，右側(cè)足三里與同側(cè)阿是穴配穴，干預(yù)20 min。于干預(yù)第21天進(jìn)行足跖容積測量及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，隔天于無菌操作臺進(jìn)行脾臟取材，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞。結(jié)果 與空白組相比，模型組的足跖容積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量均明顯增多（P<0.01）；與模型組相比，電針組、艾灸組的足跖容積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量均明顯減少（P<0.05或P<0.01）；與電針組相比，艾灸組的足跖容積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 電針與艾灸在改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀及免疫方面的作用機(jī)制具有類似效應(yīng)，均可抑制脾CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，改善病情。

〔關(guān)鍵詞〕 佐劑性關(guān)節(jié)炎；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；電針；艾灸；CD4+T細(xì)胞；免疫紊亂；療效對比

〔中圖分類號〕R245 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.04.020

Comparative study of effects of electroacupuncture and moxibustion on spleen

CD4+T cells in rats with adjuvant arthritis

LONG Yiying1， ZHANG Liang1， QI Fang1， AI Kun1， LIU Li2， ZHAO Lingyun1， QU Qirui1， XIE Hui3*， HE Ke4*

1. College of Acupuncture & Tuina Rehabilitation， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 3. The First People's Hospital of Chenzhou， Chenzhou， Hunan 423099， China; 4. The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of electroacupuncture and moxibustion on the plantar volume， arthritis index and the levels of cluster of differentiation-4+T-cell level in adjuvant arthritis （AA） rats. And to evaluate the mechanism of in the treatment of AA rats. Methods Twenty-four healthy male rats were randomly divided into blank group， model group， electroac？鄄upuncture group and moxibustion group， with 6 rats in each group. In the moxibustion group， the two sides of "Zusanli" （ST36）， "Guanyuan" （BL26） and "Ashi" acupoints were suspended moxibustion for 20 min， while in the electroacupuncture group， the same acupoint intervention was performed for 20 min. The left ST36 was combined with BL26 point and the right ST36 was combined with the same side "Ashi" acupoints for 20 min. On the last day of intervention， plantar volume and arthritis index were scored. On the second day， spleen were taken from the sterile operation table， and CD4+T lymphocytes were detected by flow cytometry. Results Compared with blank group， plantar volume， arthritis index and number of CD4+T lymphocyte of model group （P<0.01）. Compared with model group， plantar volume， arthritis index and number of CD4+T lymphocytes in electroacupuncture group and moxibustion group were significantly decreased （P<0.05， P<0.01）. Compared with electroacupuncture group， the moxibustion group had no significant differences in plantar volume， arthritis index and number of CD4+T lymphocyte （P>0.05）. Conclusion Electroacupuncture and moxibustion have similar effects on improving rheumatoid arthritis symptoms and immunity， both of which can inhibit the proliferation of CD4+T lymphocytes， maintain immune homeostasis and improve the disease.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 adjuvant arthritis; rheumatoid arthritis; electricacupuncture; moxibustion; CD4+T cells; immune disorders; comparison of curative effects

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要癥狀，病理過程難以控制的慢性、系統(tǒng)性自身免疫性疾病，且發(fā)病機(jī)制尚不明確[1-2]。該病目前尚無特效藥，患者需要長期服藥控制病情，費(fèi)用昂貴，是現(xiàn)階段臨床相關(guān)領(lǐng)域研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

RA的特征是以大量CD4+T細(xì)胞浸潤為主的慢性滑膜炎癥反應(yīng)。研究表明，針刺和艾灸治療RA均可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)免疫細(xì)胞的活性、細(xì)胞因子的表達(dá)等來調(diào)節(jié)RA患者自身的免疫反應(yīng)，發(fā)揮其治療作用[3-4]。針灸治療RA免疫調(diào)節(jié)機(jī)制是近年來的研究熱點(diǎn)，艾灸屬于溫?zé)岽碳?，針刺屬于機(jī)械刺激，對于機(jī)體效應(yīng)是否一致尚未明確。因此，本研究分別采用電針和艾灸“足三里”“關(guān)元”“阿是穴”干預(yù)佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis， AA）模型大鼠，以脾臟CD4+T細(xì)胞為切入點(diǎn)，觀察電針和艾灸治療AA大鼠免疫相關(guān)的對比療效，探討其對CD4+T細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動物與分組

健康SPF級SD雄性大鼠24只，來源于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物公司[動物合格證：4307272111

02588284，許可證號：SCXK（湘）2019-0004]，體質(zhì)量（100±10） g。24只大鼠以3只一籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，設(shè)置12 h/12 h的晝夜明暗交替環(huán)境，飼養(yǎng)室溫（25.0±2） ℃，相對濕度50%±10%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：空白組、模型組、電針組、艾灸組，每組6只。本實(shí)驗(yàn)所有過程均遵從《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》（2006年版）中的相關(guān)規(guī)定[5]。

1.2 ?主要試劑與儀器

滅活結(jié)核分枝桿菌（美國Becton-Dickinson公司，批號：231141）；礦物油（美國Sigma Aldrich公司，批號：M8410）；抗鼠CD4 抗體（美國BioLegend公司，批號：201505）；大鼠淋巴細(xì)胞分離液（深圳市達(dá)科為生物工程有限公司，批號：7211011）；紅細(xì)胞裂解液（Biosharp公司，批號：BL503B）；PBS溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號：P1022）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：21870076）。

35 mm培養(yǎng)皿（湖南比克曼生物公司，型號：110301019）；200目尼農(nóng)網(wǎng)（北京索萊寶科技有限公司，型號：YA0961）；5 mL流式管（美國Becton公司，Dickinson and Company，型號：352235）；移液槍（德國Eppendorf公司，型號：10～1000 μL）；電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品有限公司，型號：華佗牌 SDZ-Ⅱ型）；足跖容積測量儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司，型號：YLS-7C）；高速低溫離心機(jī)（美國SCILOGEX公司，型號：D3024R）；電熱恒溫槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備，型號：DK-8D）；流式細(xì)胞儀（美國Becton-Dickinson公司，型號：Celesta）。

1.3 ?模型制備

本實(shí)驗(yàn)采用以T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性炎癥動物模型——AA大鼠模型，免疫調(diào)節(jié)異常是其關(guān)鍵病理機(jī)制[6]。實(shí)驗(yàn)第1天，模型組、電針組、艾灸組大鼠進(jìn)行造模，將定量滅活結(jié)核分枝桿菌與礦物油放入高溫滅菌的研缽中充分研磨，直至溶液清透無雜質(zhì)，配制成2.5 mg/mL的完全弗氏佐劑備用，使用時(shí)需震蕩以充分混勻。將大鼠呼吸麻醉后，在尾根部皮下用乙醇棉球消毒后注射佐劑，劑量為0.1 mL/只。空白組同法注射0.1 mL礦物油。通過觀察大鼠關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，即模型大鼠造模第6天后出現(xiàn)尾根部紅腫，全身性關(guān)節(jié)繼發(fā)癥狀出現(xiàn)，第9～12天大鼠食欲減退、體質(zhì)量減輕、皮溫變高，關(guān)節(jié)紅腫明顯加劇，其余關(guān)節(jié)也出現(xiàn)癥狀，則為模型制備成功的標(biāo)志[7]。

1.4 ?干預(yù)方法

空白組、模型組大鼠不予任何治療，常規(guī)飼養(yǎng)，均僅以仰臥位固定于鼠板上20 min；電針組大鼠固定于自制的大鼠鼠板上，直刺雙后足“足三里”“關(guān)元”和“阿是穴”（雙側(cè)大鼠足跖關(guān)節(jié)腫脹明顯部位）[8]，各穴均用30號1寸針，穴位參照“十五”國家規(guī)劃統(tǒng)編教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中的大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜進(jìn)行定位，針刺0.2～0.3寸，進(jìn)針后接電子針療儀，左側(cè)足三里與關(guān)元配穴，右側(cè)足三里與同側(cè)阿是穴配穴，采用疏密波，強(qiáng)度通過觀察針柄端以出現(xiàn)輕微抖動，每次留針20 min；艾灸組大鼠固定于自制鼠板上（鼠板上安有固定艾條裝置）艾灸“足三里”“關(guān)元”和“阿是穴”，離穴位處皮膚2 cm處懸灸20 min。4組大鼠均于造模第2天開始干預(yù)，每天1次，7次為1個(gè)療程，共治療3個(gè)療程。

1.5 ?取材

干預(yù)結(jié)束后第2天，在無菌超凈臺下操作，將大鼠腹腔麻醉處死后開腹取出脾臟中段，放入裝有生理鹽水的試管備用。

1.6 ?指標(biāo)檢測

1.6.1 ?右后足跖容積測量 ?干預(yù)第21天，使用足跖容積測量儀測量足跖關(guān)節(jié)容積，每只足測量3次，記錄讀數(shù)取平均數(shù)。

1.6.2 ?關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分 ?炎癥出現(xiàn)后，每3天評估關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，以便觀察各組大鼠的繼發(fā)病變。評分標(biāo)準(zhǔn)[9]如下：0分，無紅腫；1分，跖關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕微腫脹；2分，踝關(guān)節(jié)到跖關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下足爪出現(xiàn)腫脹；4分，包括踝關(guān)節(jié)及以下足爪出現(xiàn)腫脹。分別記錄四肢關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，統(tǒng)計(jì)總分，每只大鼠最多評12分。

1.6.3 ?流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)據(jù) ?此操作在無菌超凈臺上完成，首先分離出脾臟淋巴細(xì)胞懸浮液，將取出的脾臟組織（從大鼠體內(nèi)取出脾臟到進(jìn)行分離不能超過1 h）放入培養(yǎng)皿上的200目尼龍網(wǎng)上，使用移液槍放入4～5 mL淋巴細(xì)胞分離液（取用前搖勻）到脾臟上，進(jìn)行研磨，研磨時(shí)幅度不宜過大，直至培養(yǎng)皿中的液體變色明顯且脾臟只剩些許結(jié)締組織。把研磨后懸有脾臟細(xì)胞的分離液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，立即覆蓋200～500 μL的RPMI-1640培養(yǎng)基后，室溫，放入離心機(jī)以800 r/min、半徑約為8 cm離心30 min。離心結(jié)束后會出現(xiàn)細(xì)胞分層，吸出淋巴細(xì)胞層后，加入10 mL RPMI-1640培養(yǎng)基后顛倒洗滌。室溫，250 r/min、半徑約為8 cm離心10 min后立即收集細(xì)胞，傾倒上清液，用PBS溶液重懸細(xì)胞得到淋巴細(xì)胞懸浮液。然后，進(jìn)行裂紅孵育，用移液槍將淋巴細(xì)胞懸浮液加入帶濾網(wǎng)的5 mL流式管中，加入1 μL CD4抗體；將樣本與抗體用渦旋振蕩器混勻，在室溫（25 ℃）下避光孵育15 min；所得混合物中加入3 mL PBS緩沖液，1000 r/min、半徑約為8 cm離心5 min，棄上清液；用500 μL PBS緩沖液重懸即得到待測樣品。同法不加抗體設(shè)置陰性管。最后，將待測樣品和陰性管冰上保存盡快進(jìn)行上機(jī)檢測，得出CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)據(jù)結(jié)果，使用Flowjo軟件進(jìn)行分析，得出結(jié)果。

1.7 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 26.0軟件處理，本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，以“ｘ±s”表示，符合正態(tài)分布且方差齊者，組間比較采用單因素方差分析，均以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?一般情況

空白組大鼠一般情況良好；模型組大鼠于造模第9天后足出現(xiàn)不均勻紅斑或紅腫，在第15～18天癥狀到達(dá)最高峰，全身出現(xiàn)繼發(fā)性炎癥，飲食減少，體質(zhì)量與其他3組相比增長緩慢；電針組和艾灸組飲食正常，且肉眼可見大鼠后足跖腫脹度明顯小于模型組。

2.2 ?各組大鼠足跖容積比較

干預(yù)第21天，與空白組相比，模型組足跖容積明顯增大（P<0.01）；與模型組相比，電針組足跖容積明顯減?。≒<0.05），艾灸組顯著減少（P<0.01）；而電針組與艾灸組足跖容積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖1。

2.3 ?各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較

干預(yù)第21天，空白組大鼠評分為0分，與空白組相比，模型組、電針組、艾灸組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分顯著增大（P<0.01）；與模型組相比，電針組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分顯著減?。≒<0.01），艾灸組明顯減少（P<0.05）；而電針組與艾灸組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖2。

2.4 ?各組大鼠CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量比較

干預(yù)第21天，與空白組相比，模型組大鼠CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增多（P<0.01）；與模型組相比，電針組、艾灸組CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量均顯著減少（P<0.01）；而電針組與艾灸組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖3—4。

3 討論

中醫(yī)學(xué)中，將RA歸入“痹病”范疇，病因多為正氣不足、復(fù)感外邪所致，中醫(yī)治療中針灸療效肯定，已成為重要治療手段之一。本課題組前期研究表明，電針治療AA大鼠能有效緩解大鼠足跖腫脹程度、降低致炎因子表達(dá)、緩解關(guān)節(jié)局部炎癥[10-11]。鐘玉梅等[12]發(fā)現(xiàn)艾灸通過調(diào)節(jié)脾臟膜型程序性細(xì)胞死亡配體1、血清可溶性程序性死亡蛋白1的表達(dá)，抑制T細(xì)胞的過度活化，緩解RA炎性反應(yīng)。與這些研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)中模型大鼠足跖容積明顯增大（P<0.01）、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分顯著增大（P<0.01），經(jīng)電針干預(yù)后足跖容積明顯降低（P<0.05）、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分明顯降低（P<0.01），艾灸干預(yù)后足跖容積明顯降低（P<0.01）、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分明顯降低（P<0.05）；而電針組與艾灸組相比后足跖容積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示電針與艾灸在緩解AA大鼠關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)具有類似效果。

多因素相互作用導(dǎo)致的免疫耐受紊亂是RA發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，RA的發(fā)病機(jī)制主要為T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤的慢性滑膜炎，且存在于滑膜下層的成纖維細(xì)胞增殖并導(dǎo)致軟骨損傷[13-14]。CD4+T細(xì)胞是其效應(yīng)細(xì)胞，在一定程度上影響RA的發(fā)生與發(fā)展[15]。大部分RA病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中均伴有CD4+T細(xì)胞活化[16]，且在關(guān)節(jié)積液中存在CD4+T細(xì)胞的高度擴(kuò)增[17]，提示CD4+T細(xì)胞可能是緩解滑膜炎癥的靶點(diǎn)之一。大鼠AA模型是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性炎癥動物模型[18-19]，結(jié)核分枝桿菌中一個(gè)相對分子量為65 kDa熱休克蛋白（heat shock protein 65， HSP65）與大鼠關(guān)節(jié)軟骨（cartilago articularis， CII）的自身抗原60 kDa熱休克蛋白（heat shock protein 60， HSP60）有高度相似的保守序列，可以通過分子模擬或交叉反應(yīng)，激活原來處于靜止?fàn)顟B(tài)的針對CII抗原為主的T淋巴細(xì)胞克隆，從而引起關(guān)節(jié)的自身免疫反應(yīng)[20-21]。研究證明，CD4+T細(xì)胞缺陷小鼠RA發(fā)病率更低[22]。進(jìn)一步研究提示，CD4+T細(xì)胞在RA發(fā)病過程中的重要性，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，對于維持正常免疫功能具有重要意義[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)，懸灸法能夠降低RA大鼠血清抗體類風(fēng)濕因子表達(dá)，從而改善免疫功能[25]。電針可以通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞改善機(jī)體免疫功能[26]。本研究也發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠脾臟CD4+T細(xì)胞顯著增多（P<0.01），電針、艾灸干預(yù)后，CD4+T細(xì)胞數(shù)量均顯著減少（P<0.01），提示電針與艾灸均可抑制CD4+T細(xì)胞增殖，緩解炎癥反應(yīng)；同時(shí)，電針組與艾灸組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這提示電針和艾灸在調(diào)節(jié)脾臟CD4+T細(xì)胞數(shù)量等方面表現(xiàn)出類似效應(yīng)。因此，本研究認(rèn)為電針、艾灸在改善RA炎性癥狀及其免疫方面的作用機(jī)制均與降低AA大鼠脾臟內(nèi)CD4+T細(xì)胞數(shù)量，抑制其增殖，進(jìn)而緩解炎性反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，本研究認(rèn)為電針和艾灸在改善RA癥狀及免疫方面的作用機(jī)制具有類似效應(yīng)，即均可通過抑制脾臟CD4+T細(xì)胞增殖，減輕促炎效應(yīng)，改善RA免疫功能，在一定程度上維持了機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，從而減輕病情，這為電針、艾灸治療RA提供了一定的證據(jù)基礎(chǔ)。此外，本研究尚存在一些局限性，CD4+T細(xì)胞的異常增殖、分化是RA早期免疫耐受紊亂的核心，本研究僅探討了電針與艾灸治療對CD4+T細(xì)胞增殖的影響，未涉及異常分化。因此，在后續(xù)的研究中，可增加CD4+T細(xì)胞異常分化相關(guān)指標(biāo)如Th1/Th2、Th17/Treg的檢測來完善研究，同時(shí)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行重復(fù)，以增加信度。

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〔收稿日期〕2022-06-30

〔基金項(xiàng)目〕國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82074565，82274627）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX20210704，CX20220798）。

〔第一作者〕龍軼映，女，碩士研究生，研究方向：常見疾病的中西醫(yī)結(jié)合康復(fù)的機(jī)理與臨床研究。

〔通信作者〕*何 ?可，男，副主任醫(yī)師，E-mail：178077878@qq.com；謝 ?輝，男，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：xiehui8663@163.com。