王李寶　黎慧　于志君　史文軍　馮衛(wèi)　趙然　沈輝　成婕　管小平　秦亞兵　萬夕和

摘要： 為評(píng)估微流控芯片法在蝦肝腸胞蟲（EHP）、致急性肝胰腺壞死病副溶血性弧菌（VpAHPND）、十足目虹彩病毒1（DIV1）和白斑綜合征病毒（WSSV）4種南美白對(duì)蝦常見病原聯(lián)檢中的各項(xiàng)性能，設(shè)計(jì)針對(duì)上述4種病原擴(kuò)增反應(yīng)的引物，對(duì)已有芯片進(jìn)行新的功能劃分，同時(shí)優(yōu)化該基因芯片的反應(yīng)體系及恒溫?cái)U(kuò)增條件。結(jié)果表明，優(yōu)化的聯(lián)檢方法可同時(shí)檢測(cè)上述4種病原，特異性好，30 min反應(yīng)時(shí)間即可給出病原聯(lián)檢結(jié)果。EHP、 DIV1、WSSV、VpAHPND指標(biāo)檢出限分別為1 μl 0.57拷貝、0.43拷貝、2.12拷貝 、3.18拷貝，已達(dá)到甚至超過了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）檢測(cè)的靈敏性。本次測(cè)試中的南美白對(duì)蝦4種病原微流控芯片聯(lián)檢方法所用的檢測(cè)試劑盒具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏、特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短、設(shè)備要求簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，適合整個(gè)養(yǎng)殖過程中對(duì)南美白對(duì)蝦EHP、VpAHPND、DIV1和WSSV的監(jiān)測(cè)與篩查工作。

關(guān)鍵詞： 南美白對(duì)蝦；病原；微流控芯片；聯(lián)檢

中圖分類號(hào)： S945.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2023）02-0471-08

Testing of microfluidic chip for joint detection of four common pathogens of Litopenaeus vannamei

WANG Li-bao¹， LI Hui¹， YU Zhi-jun^1，2， SHI Wen-jun¹， FENG Wei¹， ZHAO Ran^1，2， SHEN Hui¹， CHENG Jie¹， GUAN Xiao-ping³， QIN Ya-bing⁴， WAN Xi-he¹

（1.Jiangsu Institute of Oceanology and Marine Fisheries， Nantong 226007 China;2.National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China;3.Yili Yueran Ecological Agriculture Co.， Ltd. Yili? 835300， China;4.Comprehensive Service Center of Dayu Town， Rudong County， Nantong 226412， China）

Abstract： To evaluate the performance of microfluidic chip method in the joint detection of four common pathogens of Litopenaeus vannamei including Enterocytozoon hepatopenaei （EHP）， acute hepatopancreas necrosis disease caused by Vibrio parahaemolyticus （VpAHPND）， Decapod iridescent virus 1 （DIV1） and white spot syndrome virus （WSSV）， primers for the amplification reactions of the above four pathogens were designed， new functional divisions were made for the existing chips， and the reaction system and constant temperature amplification conditions of the microfluidic chip were optimized. The results showed that， the optimized combined detection method could detect the above four pathogens simultaneously with good specificity， and the joint detection results could be obtained within 30 min reaction time. The detection limits of EHP， DIV1， WSSV and VpAHPND were 0.57 copies/μl， 0.43 copies/μl， 2.12 copies/μl and 3.18 copies/μl， respectively. Some of the limits had reached or even exceeded the testing sensitivity of loop-mediated isothermal amplification （LAMP） method. The detection kit used in the joint detection method of microfluidic chip for the four pathogens of L. vannamei in this test is characterized by simple operation， sensitive detection， strong specificity， short detection time and simple equipment requirements， and is suitable for the monitoring and screening of EHP， VpAHPND， DIV1 and WSSV of L. vannamei in the whole breeding process.

Key words： Litopenaeus vannamei;pathogens;microfluidic chip;joint detection

病害對(duì)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的影響與臺(tái)風(fēng)、洪澇等自然災(zāi)害產(chǎn)生的影響不相上下^[1]。對(duì)蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）、對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病副溶血性弧菌（AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus，VpAHPND）、十足目虹彩病毒1（Decapod iridescent virus 1，DIV1）和白斑綜合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）等病原成為許多地區(qū)對(duì)蝦大批量死亡或生長(zhǎng)延滯的主要原因之一^[2]。簡(jiǎn)化傳統(tǒng)分子檢測(cè)過程中繁瑣的樣品處理程序和擴(kuò)增步驟，研發(fā)采樣現(xiàn)場(chǎng)適用的便攜式分析儀器及配套試劑，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速即時(shí)檢測(cè)（Point-of-care testing，POCT）是當(dāng)務(wù)之急。該聯(lián)檢方法的研發(fā)，將為在養(yǎng)殖各個(gè)環(huán)節(jié)實(shí)時(shí)監(jiān)控病原體的攜帶情況，并有效防控?cái)U(kuò)散、減少經(jīng)濟(jì)損失提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。

微流控芯片技術(shù)（Microfluidic chip technology）是人們?yōu)榱藢悠非疤幚?、分離及檢測(cè)等過程集成到數(shù)平方厘米的芯片上，利用芯片內(nèi)部流體完成微升/納升級(jí)別的體系反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)后續(xù)分析的自動(dòng)化、微型化、集成化的一種追求極致的方法技術(shù)^[3-5]。該技術(shù)誕生至今因其反應(yīng)體系固有的微量化、集約化等優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用領(lǐng)域早已遍及醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)和化學(xué)等學(xué)科和領(lǐng)域^[6-8]。微流控芯片技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用仍停留在水產(chǎn)致病菌和養(yǎng)殖水體關(guān)鍵環(huán)境因子的檢測(cè)層面^[9-11]，針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖常見病原，尤其是對(duì)蝦常見病毒性和寄生蟲性病原的微流控芯片技術(shù)應(yīng)用尚未有相關(guān)報(bào)道。

目前對(duì)蝦常見病原體檢測(cè)仍沿用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的PCR法或巢式PCR（Nested PCR）法，但PCR法的靈敏度不高^[12]，巢式PCR的操作步驟較為繁瑣，檢測(cè)指標(biāo)相對(duì)單一，且易受到環(huán)境氣溶膠的污染^[13-15]。熒光定量PCR法在核酸提取過程中無法進(jìn)行質(zhì)量控制，且熔解曲線易干擾多指標(biāo)聯(lián)檢的檢測(cè)結(jié)果^[16]。與檢測(cè)成本最高的多通道熒光定量PCR法相比，熒光定量PCR法無法同時(shí)檢測(cè)4個(gè)以上病原體指標(biāo)^[17-18]，不利于大規(guī)模普及。本研究擬設(shè)計(jì)針對(duì)EHP、VpAHPND、DIV1和WSSV的特異性引物，構(gòu)建微流控芯片與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）相結(jié)合的檢測(cè)體系，完善一種高效、快速、準(zhǔn)確并適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的針對(duì)上述4種病原的聯(lián)檢方法。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

快速吸附柱法DNA提取試劑盒為寧波愛基因科技有限公司產(chǎn)品，型號(hào)：ZMTQ002；對(duì)蝦微流控芯片4聯(lián)檢快速檢測(cè)試劑盒由江蘇省海洋水產(chǎn)研究所獨(dú)立研發(fā)；微流控恒溫?cái)U(kuò)增儀為寧波愛基因科技有限公司產(chǎn)品，型號(hào)：MA2000E。

1.2 樣品

含有EHP、VpAHPND、DIV1和WSSV病原體的對(duì)蝦組織樣本由江蘇省海洋水產(chǎn)研究所生物技術(shù)研究室保存，無病原體的健康對(duì)蝦組織樣本從南通當(dāng)?shù)孬@取。病原體的對(duì)蝦組織樣本經(jīng)過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法 《白斑綜合征（WSD）診斷規(guī)程第2部分：套式PCR檢測(cè)法》（GB/T 28630.2-2012）^[19]、地方標(biāo)準(zhǔn)《南美白對(duì)蝦肝腸胞蟲巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)方法》（DB32/T 3802-2020）^[20]或世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）和亞太水產(chǎn)養(yǎng)殖中心網(wǎng)（NACA）推薦方法檢測(cè)為陽性；無病原體的健康對(duì)蝦組織經(jīng)上述檢測(cè)方法檢測(cè)為陰性。同時(shí)采集江蘇省省內(nèi)的南美白對(duì)蝦仔蝦樣品（85份）和成蝦樣品（100份）進(jìn)行實(shí)測(cè)樣本驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.3 病原DNA提取

樣本DNA模板提取方法與步驟參照《快速吸附柱法DNA抽提試劑盒的產(chǎn)品說明書》。仔蝦取頭胸部組織提取DNA，成蝦取鰓和肝胰腺組織混樣提取DNA。

1.4 微流控芯片聯(lián)檢方法的建立和結(jié)果判定

本研究設(shè)計(jì)針對(duì)上述4種病原體擴(kuò)增的特異性引物（表1），將其預(yù)埋至微流控芯片對(duì)應(yīng)的反應(yīng)池孔內(nèi)。

芯片含8個(gè)加樣孔和32個(gè)反應(yīng)池，均勻分布于4個(gè)獨(dú)立單元。加樣孔和反應(yīng)池通過毛細(xì)管相連，反應(yīng)池彼此互不相通。將提取的DNA模板和反應(yīng)液混勻后注入加樣孔，用配套的封口膜封閉微流控芯片，利用離心力驅(qū)動(dòng)反應(yīng)液分別均勻地注入反應(yīng)池（圖1）。

用微流控恒溫?cái)U(kuò)增儀對(duì)封裝好的微流控芯片進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，讀取反應(yīng)后的實(shí)時(shí)熒光數(shù)值和循環(huán)閾值（Ct值），進(jìn)行結(jié)果判定。30 min內(nèi)，待檢樣品出現(xiàn)特異性S形擴(kuò)增曲線，且Ct值<30時(shí)判定為陽性結(jié)果；30 min內(nèi)，待測(cè)樣品未擴(kuò)增出特異性曲線，且Ct值<30時(shí)判定為陰性結(jié)果。

1.5 特異性試驗(yàn)

將上述4種病原的陽性樣品提取的DNA模板作為反應(yīng)液模板，并設(shè)定陰性對(duì)照組，利用微流控芯片恒溫?cái)U(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，考察在同一個(gè)擴(kuò)增程序中能否同步特異性地?cái)U(kuò)增出4種擴(kuò)增曲線。

1.6 靈敏度和檢出限

選擇已經(jīng)確定含有EHP、VpAHPND、DIV1和WSSV病原體的對(duì)蝦組織樣本，按照方法1.3中所述DNA提取方法，提取樣本中DNA作為后續(xù)靈敏度和檢出限試驗(yàn)的模板。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real time fluorescent quantitative PCR，RT-FQ PCR）法確定DNA模板中的目標(biāo)病原拷貝濃度，并以此已知濃度DNA模板作為靈敏度和檢出限測(cè)試測(cè)驗(yàn)的初始樣本，通過對(duì)該樣本進(jìn)行10倍梯度稀釋以進(jìn)行下一步靈敏度和檢出限測(cè)試試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)立陰性空白對(duì)照組。以出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線的最低稀釋濃度的DNA模板中對(duì)應(yīng)病原的拷貝濃度作為最終靈敏度和檢出限的結(jié)果。

1.7 重復(fù)性

按照方法1.3的方法準(zhǔn)備4種病原陽性樣品，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，對(duì)每種陽性樣品進(jìn)行8次測(cè)定，以8次樣品測(cè)定Ct值的變異系數(shù)（CV）來評(píng)估本檢測(cè)體系的重復(fù)性^[21]。

1.8 實(shí)測(cè)樣本驗(yàn)證

采集江蘇省省內(nèi)南美白對(duì)蝦仔蝦樣品85份和成蝦樣品100份，進(jìn)行微流控芯片法與傳統(tǒng)PCR方法檢測(cè)的結(jié)果對(duì)比試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 聯(lián)檢方法的建立

通過反復(fù)優(yōu)化試驗(yàn)條件[包括Mg²⁺濃度，正反向引物比例和納米金顆粒（Gold nanoparticles，AuNPs）種類、粒徑和濃度等]確定了每個(gè)反應(yīng)池5.0 μl 恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系中各組分組成如下：20 mmol/L Tris-HCl 0.1 μl，20 mmol/L KCl 0.8 μl，40 mmol/L （NH₄）₂SO₄0.3 μl，40 mmol/L MgSO₄0.3 μl，2.8 mmol/L dNTPs 0.3 μl，8 000 U/ml DNA聚合酶0.2 μl，50 μmol/L SYBR Green熒光染料 0.2 μl，8×10^-6mol/L Na₃Ct- AuNPs（檸檬酸三鈉-納米金） 0.4 μl，ddH₂O 0.4 μl，測(cè)試樣品DNA模板 1.0 μl。引物濃度均為 50 μmol/L，各0.5 μl，以凍干粉形式提前預(yù)埋到反應(yīng)池內(nèi)。隨后63.5 ℃恒溫?cái)U(kuò)增30 min。在圖1樣品加樣孔位置，加入總反應(yīng)預(yù)混液（15.0 μl熒光預(yù)混液和10.0 μl核酸模板）。初步混勻后，用配套的封口膜封閉微流控芯片，將微流控芯片安裝入微流控恒溫?cái)U(kuò)增儀，1 500 r/min離心3 min，5 000 r/min離心3 min，將反應(yīng)液均勻分布到各個(gè)反應(yīng)池中，隨后63.5 ℃恒溫?cái)U(kuò)增30 min。如圖2所示，陽性對(duì)照樣品30 min內(nèi)相應(yīng)的反應(yīng)孔出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且Ct<30；陰性對(duì)照相應(yīng)的反應(yīng)孔未出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，且Ct<30。

2.2 檢測(cè)結(jié)果特異性

根據(jù)上述反應(yīng)體系和恒溫?cái)U(kuò)增程序，將提取的4種對(duì)蝦病原陽性樣品DNA模板按照?qǐng)D1中樣品分布孔進(jìn)行上樣分析，在30 min內(nèi)能在不同的時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增曲線并加以區(qū)分（圖3）。

本檢測(cè)體系在同一恒溫?cái)U(kuò)增條件下，對(duì)上述4種病原在30 min內(nèi)均能實(shí)現(xiàn)特異性的有效檢出，但針對(duì)每一種病原檢測(cè)具體的靈敏度和檢測(cè)限還需要進(jìn)一步試驗(yàn)來驗(yàn)證。

2.3 檢測(cè)結(jié)果靈敏度和檢出限

用已經(jīng)確定含有EHP、VpAHPND、DIV1和WSSV病原體的對(duì)蝦組織樣本參照方法1.3提取試驗(yàn)用DNA模板，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法確定DNA模板中的EHP、VpAHPND、DIV1和WSSV 4種目標(biāo)病原拷貝數(shù)分別為1 μl 5 736拷貝、3 183拷貝、4 327拷貝和2 117拷貝。將該溶液進(jìn)行10倍梯度稀釋作為靈敏度和檢出限的樣品，同時(shí)設(shè)立陰性空白對(duì)照組。

根據(jù)最低稀釋倍數(shù)下出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線的DNA含量來確定本檢測(cè)方法針對(duì)每種病原檢測(cè)指標(biāo)的靈敏度和檢出限。結(jié)果（圖4）顯示，4種病原檢測(cè)指標(biāo)中DIV1原液出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線的時(shí)間點(diǎn)最早，但隨著陽性樣本含量的降低，其特征擴(kuò)增曲線出現(xiàn)時(shí)間會(huì)延遲直至消失。

其余病原檢測(cè)靈敏度和檢出限試驗(yàn)結(jié)果都呈現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)，根據(jù)出現(xiàn)典型陽性擴(kuò)增曲線的最大陽性樣本稀釋倍數(shù)，最終本檢測(cè)方法中VpAHPND、WSSV、EHP和DIV1 4種病原聯(lián)檢的檢出限依次為：1 μl 3.18拷貝、2.12拷貝、0.57拷貝和0.43拷貝。結(jié)果顯示，本檢測(cè)方法對(duì)于EHP和DIV1的檢測(cè)較為靈敏，并可通過進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系和條件來提升WSSV和VpAHPND檢測(cè)的靈敏度。

微流控芯片法對(duì)EHP的檢出限要低于傳統(tǒng)PCR方法，據(jù)報(bào)道傳統(tǒng)PCR方法檢出限為1 μl 3.30拷貝^[22]。而微流控芯片法對(duì)VpAHPND的檢出限又高于傳統(tǒng)PCR方法，據(jù)報(bào)道用傳統(tǒng)PCR方法的檢出限為1 μl 0.32拷貝^[22]。其他2種病原PCR法的檢出限暫未見報(bào)道。

2.4 檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性

為了評(píng)估本檢測(cè)體系的重復(fù)性，選擇已經(jīng)確定為病原陽性的樣品提取DNA模板，并設(shè)立陰性對(duì)照，對(duì)陽性樣品進(jìn)行8次測(cè)定，4種病原陽性樣品測(cè)定的Ct值的CV值為2.22%～3.47%（表2），均≤5.00%，具有較好的重復(fù)性。

2.5 微流控芯片法與PCR方法檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比

如表3所示，利用微流控芯片法與傳統(tǒng)PCR法蝦肝腸胞蟲（EHP）、對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病副溶血性弧菌（VpAHPND）、十足目虹彩病毒1（DIV1）、白斑綜合征病毒（WSSV）的循環(huán)閾值（Ct值）的變異系數(shù)分別為3.18%、3.47%、2.55%、2.22%。

檢測(cè)成蝦樣品100份，蝦苗樣品85份，在成蝦樣品中4種病原的微流控芯片法檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)PCR法檢測(cè)結(jié)果保持了高度的一致性；而蝦苗樣品中，分別使用微流控芯片法與傳統(tǒng)PCR法檢測(cè)，微流控芯片法陽性檢出率略低于傳統(tǒng)PCR法。對(duì)比兩者從DNA模板提取開始到完成4種病原檢測(cè)所用時(shí)間，微流控芯片法（用時(shí)1 h）要比傳統(tǒng)PCR法（用時(shí)6 h）節(jié)約近5 h。

3 討論

20世紀(jì)90年代初，微流控芯片技術(shù)首次被報(bào)道^[3]，這一技術(shù)在微米尺度芯片上實(shí)現(xiàn)了制備、反應(yīng)、分離和檢測(cè)等基本操作單元的功能集成，在短時(shí)間內(nèi)完成上百個(gè)樣品的平行自動(dòng)分析，滿足現(xiàn)場(chǎng)快速即時(shí)檢測(cè)的需求^[23-24]。隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，至今已衍生出解旋酶依賴性擴(kuò)增（HDA）微流控芯片、碟式微流控芯片、POC微流控芯片、數(shù)字微流控芯片、卡式微流控芯片等多種微流控芯片^[25-27]。由于微流控芯片法自身具有微型化、集成化和自動(dòng)化等特點(diǎn)，以及消耗樣品和試劑量少、反應(yīng)迅速、可大量平行處理等優(yōu)點(diǎn)，該項(xiàng)技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)和免疫學(xué)等領(lǐng)域表現(xiàn)出無限的發(fā)展?jié)摿?sup>[28^-31]。微流控芯片的應(yīng)用范圍從單純的基因擴(kuò)增與分析^[32]拓展到了細(xì)胞培養(yǎng)^[33]、蛋白質(zhì)檢測(cè)^[34]和特征化合物分析^[35]等領(lǐng)域。

本病原檢測(cè)體系是基于微流控芯片與LAMP技術(shù)相結(jié)合的一種新型檢測(cè)技術(shù)，具有傳統(tǒng)LAMP技術(shù)所具有的步驟簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短、特異性和靈敏度高^[36-37]、不需要特殊儀器等特點(diǎn)^[38]，除了可以用于突發(fā)水產(chǎn)疫情的POCT外^[39]，還可以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖日常管理關(guān)鍵時(shí)期的病原實(shí)時(shí)監(jiān)控。在試驗(yàn)前期本檢測(cè)體系利用2對(duì)特異性恒溫?cái)U(kuò)增引物，并選擇檸檬酸三鈉-納米金（Na₃Ct- AuNPs）作為提升恒溫?cái)U(kuò)增效率和特異性的輔助劑^[40]，通過優(yōu)化恒溫?cái)U(kuò)增體系和擴(kuò)增溫度，4種常見病原在本次微流控芯片聯(lián)檢方法中均出現(xiàn)了特征性擴(kuò)增，且該檢測(cè)方法檢測(cè)限除了 VpAHPND指標(biāo)外，其他3項(xiàng)指標(biāo)的最低檢測(cè)限已經(jīng)處于較為領(lǐng)先的水平^[41-42]，可與目前應(yīng)用較廣的Nested PCR ^[43]和RT-FQ PCR ^[44]、數(shù)字PCR（Digital PCR）和等溫聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）等相媲美^[45-46]。本檢測(cè)方法中所用的試劑、儀器、芯片等均享有國(guó)內(nèi)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，可以自主化生產(chǎn)，能有效避免國(guó)際專利間的技術(shù)糾紛，具備良好的適用性和市場(chǎng)價(jià)值。

本檢測(cè)方法在檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性上優(yōu)勢(shì)顯著。已有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法或者是OIE/NACA推薦的經(jīng)典PCR方法，尤其是多重PCR（Multiplex PCR）和Nested PCR方法，仍可能產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，從而影響最終的結(jié)果判定。其中氣溶膠污染是產(chǎn)生假陽性擴(kuò)增的主要原因^[47]，而本聯(lián)檢體系始終在一個(gè)相對(duì)密閉的環(huán)境中進(jìn)行目的基因序列的恒溫?cái)U(kuò)增，有效降低了氣溶膠污染的概率，增強(qiáng)了聯(lián)檢體系的可靠性和穩(wěn)定性。在本檢測(cè)方法建立時(shí)，檢測(cè)全程加入4種病原指標(biāo)的陽性樣本用于全程質(zhì)量控制，既驗(yàn)證了本檢測(cè)方法中核酸提取試劑盒的有效性，又進(jìn)一步驗(yàn)證了后續(xù)微流控恒溫?cái)U(kuò)增和病原結(jié)果研判的有效性。本檢測(cè)方法不僅適用于養(yǎng)殖塘口對(duì)蝦常見病原的POCT，還為對(duì)蝦大型養(yǎng)殖企業(yè)全程監(jiān)控養(yǎng)殖病害發(fā)生提供了技術(shù)支持，這為有效預(yù)警并控制對(duì)蝦養(yǎng)殖病害的發(fā)生提供了經(jīng)濟(jì)、便捷、快速和有效的手段，同時(shí)對(duì)中國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的綠色健康發(fā)展起到了保駕護(hù)航的重要作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 宋居易，劉昱辰，張?zhí)K楠，等. 南美白對(duì)蝦4種病原體可視化快速檢測(cè)試劑盒（生物芯片法）的研發(fā)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2020， 36（3）： 656-665.

[2] 李 超，馬立鳴，曹 潔，等. 2021年度我國(guó)北方對(duì)蝦病害流行情況及下一步防控建議[J]. 中國(guó)水產(chǎn)， 2022（2）：103-106.

[3] MANZ A， GRABER N， WIDMER H. Miniaturized total chemical analysis systems： a novel concept for chemical sensing[J]. Sensors and Actuators B： Chemical， 1990， 1（1）： 244-248.

[4] SRINIVASAN V， PAMULA V K， FAIR R B. An integrated digital microfluidic lab-on-a-chip for clinical diagnostics on human physiological fluids[J]. Lab on a Chip， 2004，4（4）： 310-315.

[5] MARK D， HAEBERLE S， ROTH G， et al. Microfluidic lab-on-a-chip platforms： requirements，characteristics and applications[J]. Chemical Society Reviews， 2010， 39（3）： 1153-1182.

[6] 朱 琦，王凱娟，曹云霞，等. 基于微流控芯片的胚胎體外培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 中華生殖與避孕雜志， 2022， 42（2）： 209-212.

[7] 歐英琪，薛 堃. 微流控芯片在昆蟲研究中的應(yīng)用[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào)， 2022， 59（1）： 1-15.

[8] 陳 港，張夢(mèng)麗，魏 淵，等. 紙基微流控芯片的構(gòu)建及在亞硝酸鹽檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2021， 49（12）： 1-7.

[9] 郭建江，張榮標(biāo)，楊 寧，等. 基于磁控分離的水產(chǎn)致病菌微流控檢測(cè)方法[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)， 2015， 46（4）： 277-281， 308.

[10]時(shí)家輝，于亞光，楊 普，等. 基于微流控和比色光譜法的水產(chǎn)養(yǎng)殖海水氨氮含量檢測(cè)[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)， 2020， 51（S1）： 397-404.

[11]董 峰，時(shí)家輝，楊 普，等. 養(yǎng)殖水體氨氮濃度威力克和水楊酸分光光度法檢測(cè)[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)， 2021， 52（S1）： 229-236， 343.

[12]TANG K F J， DURAND S V， WHITE B L， et al. Post larvae and juveniles of a selected line of Penaeus stylirostris are resistant to infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus infection[J]. Aquaculture， 2000， 19（3/4）： 203-210.

[13]JAROENLAK P， SANGUANRUT P， WILLAMS B A P， et al. A nested PCR assay to avoid false positive detection of the microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei （EHP） in environmental samples in shrimp farm[J]. PLoS One， 2016， 11（11）： 1-5.

[14]DANGTIP S， SIRIKHARIN R， SANGUANRUT P， et al. AP4 method for two-tube nested PCR detection of AHPND isolates of Vibrio parahaemolyticus[J]. Aquaculture Reports， 2015， 2（2）： 158-162.

[15]NATIVIDAD K D T， NOMURA N， MATSUMURA M. Detection of white spot syndrome virus DNA in pond soil using a 2-step nested PCR[J]. Journal of Virological Methods， 2008， 149（1）： 28-34.

[16]劉 珍，張慶利，萬曉媛，等. 蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法的建立及對(duì)蝦樣品的檢測(cè)[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展， 2016， 37（2）： 119-126.

[17]HAN J E， TANG K F J， PANTOJA C R， et al. qPCR assay for detecting and quantifying a virulence plasmid in acute hepatopancreatic necrosis disease （AHPND） due to pathogenic Vibrio parahaemolyticus[J]. Aquaculture， 2015， 442： 12-15.

[18]QIU L， CHEN M M， WAN X Y， et al. Detection and quantification of shrimp hemocyte iridescent virus by TaqMan probe based real-time PCR[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2018， 157： 95-101.

[19]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).白斑綜合征（WSD）診斷規(guī)程第2部分：套式PCR檢測(cè)法：GB/T 28630.2-2012 [S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[20]江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局.南美白對(duì)蝦肝腸胞蟲巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)方法：DB32/T 3802-2020 [S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2020.

[21]邵 靚，陳弟詩(shī)，陳 斌，等. 微流控芯片法在非洲豬瘟病毒核酸快速檢測(cè)中的性能分析[J]. 畜牧與獸醫(yī)， 2021， 53（7）： 107-111.

[22]龔晗悅. 蝦肝腸胞蟲和急性肝胰腺壞死病雙重qPCR/ddPCR檢測(cè)方法的建立[D]. 廣州：暨南大學(xué)， 2021.

[23]SANJAY S T， DOU M， SUN J， et al. A paper/polymer hybrid microfluidic microplate for rapid quantitative detection of multiple disease biomarkers[J]. Scientific Reports， 2016， 6（1）： 30474.

[24]LIU F F，ZHANG C S. A novel paper-based microfluidic enhanced chemiluminescence biosensor for facile， reliable and highly-sensitive gene detection of Listeria monocytogenes[J]. Sensors and Actuators B： Chemical， 2015， 209： 399-406.

[25]周 杰，黃文勝，鄧婷婷，等. 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)微流控恒溫?cái)U(kuò)增芯片的研制[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2017， 33（6）： 293-302.

[26]COELHO B J， VEIGAS B， GUAS H， et al. A digital microfluidics platform for loop-mediated isothermal amplification detection[J]. Sensors， 2017， 17（11）： 2616.

[27]YASMIN R， ZHU H， CHEN Z， et al. A modifiable microarray based universal sensor：providing sample-to-results automation[J]. Heliyon， 2016， 2： e00179.

[28]曹 寧，申炳陽，喻梓瑄，等. 用于3種食源性致病菌核酸提取的微流控芯片制備[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2022， 41（1）： 28-35.

[29]李 敏，豆小文，熊 丹，等. 新型微流控芯片在循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集與鑒定中研究進(jìn)展[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2021， 44（12）： 1195-1198.

[30]徐林龍，金志明，范一強(qiáng). 微針與微流控芯片的結(jié)合應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 分析化學(xué)，2022，50（4）：506-515.

[31]吁子賢，林樹靖，王 菲，等. 基于MEMS技術(shù)的外泌體磁分離微流控芯片[J]. 維納電子技術(shù)， 2021， 58（6）： 496-500.

[32]JALILI A， BAGHERI M， SHAMLOO A， et al. A plasmonic gold nanofilm-based microfluidic chip for rapid and inexpensive droplet-based photonic PCR[J]. Scientific Reports， 2021， 11（1）： 23338.

[33]LI R， ZHANG X J， LV X F， et al. Microvalve controlled multi-functional microfluidic chip for divisional cell co-culture[J]. Analytical Biochemistry， 2017， 539： 48-53.

[34]ZHAO Y， HU X G， HU S， et al. Applications of fiber-optic biochemical sensor in microfluidic chips： a review[J]. Biosensors & Bioelectronics， 2020， 166： 112447.

[35]張 昱. 基于分子印跡技術(shù)在微流控芯片上檢測(cè)4-硝基苯酚和四環(huán)素[D]. 煙臺(tái)：煙臺(tái)大學(xué)， 2021.

[36]王 華，王君瑋，徐天剛，等. 非洲豬瘟病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增診斷方法的建立[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)， 2010， 40（9）： 940-944．

[37]田純見，楊舒展，段喻燕，等. 非洲豬瘟病毒非結(jié)構(gòu)基因?qū)崟r(shí)熒光LAMP 檢測(cè)方法的建立[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2017， 38（11）： 1-5.

[38]FANG X E， LIU Y Y， KONG J L， et al. Loop mediated isothermal amplification integrated on microfluidic chips for point of care quantitative detection of pathogens[J]. Analytical Chemistry， 2010， 82（7）： 3002-3006.

[39]趙 陽，王 喆，賈舒麟，等. 基于LAMP的微流控芯片病原體快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)， 2020， 24（4）： 701-704.

[40]姚 晶，林 燕，李 佳，等. 三種納米金顆粒對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增效率和特異性的影響[J]. 環(huán)境化學(xué)， 2012， 31（1）： 1-8.

[41]KRISTINE Y， RICHARD F. Real-time quantitative PCR and fast QPCR have similar sensitivity and accuracy with HIV cDNA late reverse transcripts and 2-LTR circles[J]. Journal of Virological Methods， 2008， 153（2）： 253-256.

[42]WANG J， WANG J， LI R， et al. Rapid and sensitive detection of canine distemper virus by real-time reverse transcription recombinase polymerase amplification[J]．BMC Veterinary Research， 2017， 13（1）： 241-247.

[43]楊萱桐. 十二指腸賈第蟲ELISA、巢式PCR和LAMP診斷方法的建立[D]. 哈爾濱： 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2019.

[44]溫書香，安利民，趙 協(xié)，等. 豬偽狂犬病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2019， 47（7）： 1654-1659.

[45]TADMOR A D， OTTESEN E A， LEADBETTER J R， et al. Probing individual environmental bacteria for viruses by using microfluidic digital PCR[J]. Science， 2011， 333（6038）： 58-62.

[46]OLSEN J B， LEWIS C J， MASSEMGILL R L， et al. An evaluation of target specificity and sensitivity of three qPCR assay for detecting environmental DNA from Northern Pike （Esox lucius）[J]. Conservation Genetics Resources， 2015， 7（3）： 615-617.

[47]李云龍，張 健，魏艷秋，等．分子診斷實(shí)驗(yàn)室去除核酸污染的方法學(xué)研究[J]. 生物工程學(xué)報(bào)， 2021， 37（2）： 673-679.

（責(zé)任編輯：陳海霞）