肖霞霞　楊云　馬麗雅　馮發(fā)運(yùn)　葛靜　李勇　王亞　余向陽(yáng)　馬桂珍

摘要： 土壤鄰苯二甲酸酯（PAE）污染對(duì)生態(tài)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品安全均構(gòu)成威脅。為實(shí)現(xiàn)PAE污染土壤的生物修復(fù)，明確共代謝基質(zhì)對(duì)微生物降解PAE的影響機(jī)制，從PAE污染的大蒜中篩選獲得能降解PAE的內(nèi)生菌。通過(guò)生理生化特征和16S rRNA基因測(cè)序?qū)ζ浞N屬進(jìn)行了鑒定，并研究了內(nèi)生菌對(duì)6種PAE的共代謝降解特性，優(yōu)化了共代謝降解條件，初步探索了共代謝條件下內(nèi)生菌對(duì)PAE的降解代謝途徑。結(jié)果表明：從大蒜中共篩選出3株能降解PAE的內(nèi)生菌DGB-1、DGB-3和DGB-8，經(jīng)鑒定3者皆為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。3株菌株均能以6種PAE為碳源生長(zhǎng)，但處理3 d后PAE的降解率僅0.89%～10.40%，降解能力較弱。添加D-纖維二糖為共代謝基質(zhì)后，3株菌株對(duì)6種PAE的降解率均顯著提升，其中菌株DGB-1和DGB-3處理3 d后能完全降解20 mg/L質(zhì)量濃度的鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和鄰苯二甲酸丁芐酯（BBP）。以DGB-1為供試菌株，發(fā)現(xiàn)吐溫80添加量、碳源種類(lèi)、碳源濃度和接菌量對(duì)6種PAE的降解率均有顯著影響，最佳降解條件為吐溫80添加量0.025%，碳源為D-纖維二糖、濃度為10 mmol/L，接種菌液OD₆₀₀為0.2。最佳降解條件下，當(dāng)6種PAE質(zhì)量濃度為50 mg/L時(shí)，鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、DBP、BBP、鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）和鄰苯二甲酸二辛酯（DnOP）在MSM培養(yǎng)基中的降解半衰期分別為9.01 d、2.27 d、2.13 d、1.99 d、7.84 d和6.72 d。菌株DGB-1不攜帶質(zhì)粒，其PAE降解基因位于該菌染色體上；菌株DGB-1可通過(guò)水解作用完成對(duì)DBP、DEHP和DnOP的第一步降解，但水解作用均較弱；菌株DGB-1對(duì)6種PAE的降解代謝需要其細(xì)胞膜上的呼吸鏈系統(tǒng)參與，氧化還原反應(yīng)增強(qiáng)可顯著促進(jìn)菌株DGB-1對(duì)6種PAE的降解。本研究為進(jìn)一步利用內(nèi)生菌進(jìn)行PAE污染土壤的生物修復(fù)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 內(nèi)生菌；共代謝；鄰苯二甲酸酯；降解途徑

中圖分類(lèi)號(hào)： Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2023）01-0106-12

Co-metabolic degradation characteristics and metabolic pathways analysis of phthalic acid esters by endophytic Bacillus megaterium in garlic

XIAO Xia-xia^1，2， YANG Yun^1，2， MA Li-ya²， FENG Fa-yun²， GE Jing^2，3， LI Yong²， WANG Ya^2，3， YU Xiang-yang^2，3， MA Gui-zhen¹

（1.School of Food Science and Engineering， Jiangsu Ocean University， Lianyungang 222005， China;2.Institute of Food Safety and Nutrition， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;3.School of the Environment and Safety Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China）

Abstract： Soil phthalic acid esters （PAEs） pollution is a threat to the ecological environment and the safety of agricultural products. In order to realize the bioremediation of PAEs contaminated soil and clarify the influence mechanism of co-metabolic matrix on the degradation of PAEs by microorganisms， endophytic bacteria capable of degrading PAEs were screened from PAEs contaminated garlic. The strains were identified by physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequencing， and the co-metabolic degradation characteristics of six PAEs by endophytes were studied. The co-metabolic degradation conditions were optimized， and the degradation metabolic pathway of PAEs by endophytes under co-metabolic condition was preliminarily explored.The results showed that three endophytic bacteria DGB-1， DGB-3 and DGB-8 capable of degrading PAEs were screened from garlic， and they were identified as Bacillus megaterium. Although three strains of bacteria demonstrated the ability to utilize six different types of PAEs as carbon sources for growth， their capacity for PAEs degradation was limited. After a three-day treatment， degradation rates ranged from 0.89% to 10.40%. After adding D-cellobiose as co-metabolism substrate， the degradation rates of six PAEs by the three strains were significantly improved. Among them， DGB-1 and DGB-3 strains could completely degrade 20mg/L dibutyl phthalate （DBP） and butyl benzyl phthalate （BBP） after three days of treatment. Using DGB-1 as test strain， it was found that the addition amount of Tween 80， carbon source type， carbon source concentration and inoculation dose had significant effects on the degradation rates of six PAEs. The optimal degradation conditions were as follows： the addition amount of Tween 80 was 0.025%， the carbon source was D-cellobiose， the concentration was 10 mmol/L， and OD₆₀₀value of bacterial solution was 0.2. Under the optimal degradation conditions， when the initial concentrations of six PAEs were 50 mg/L， the degradation half-lives of dimethyl phthalate （DMP）， diethyl phthalate （DEP）， DBP， BBP， di-（2-ethylhexyl） phthalate （DEHP） and di-n-octyl phthalate （DnOP） in inorganic salt medium were 9.01 d， 2.27 d， 2.13 d， 1.99 d， 7.84 d and 6.72 d， respectively. The strain DGB-1 did not carry a plasmid， and its PAEs degradation genes were located on the chromosome. DGB-1 could complete the first step degradation of DBP， DEHP and DnOP through hydrolysis， but the hydrolysis reactions were weak. The degradation of six PAEs by the strain DGB-1 required the participation of the respiratory chain system on the cell membrane. The enhanced redox reaction could significantly promote the degradation of six PAEs by the strain DGB-1. This study provides a theoretical basis for further use of endophytic bacteria for bioremediation of PAEs contaminated soil.

Key words： endophytic bacteria;co-metabolism;phthalic acid esters;degradation pathways

鄰苯二甲酸酯（PAE）常作為增塑劑應(yīng)用于農(nóng)用地膜、棚膜等塑料制品的生產(chǎn)中，塑料產(chǎn)品中PAE含量約占總質(zhì)量的10%～60%^[1]。PAE在合成材料中常以非化學(xué)共價(jià)鍵形式存在^[2]，容易被釋放到大氣、水體等環(huán)境介質(zhì)中，并最終造成耕地土壤PAE污染^[3]。中國(guó)設(shè)施大棚土壤中PAE污染狀況不容樂(lè)觀，珠三角、長(zhǎng)三角、環(huán)渤海等地區(qū)的調(diào)查結(jié)果顯示，中國(guó)農(nóng)田土壤中的主要PAE污染種類(lèi)為鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP），平均含量高達(dá)9.23 mg/kg和11.00 mg/kg^[4]，遠(yuǎn)高于美國(guó)環(huán)保局制定的土壤PAE控制標(biāo)準(zhǔn)^[5]。PAE具有較強(qiáng)的生殖毒性和“三致”效應(yīng)^[6]，土壤PAE污染不但對(duì)生態(tài)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅，還可通過(guò)食物鏈積累放大進(jìn)一步增加人體PAE暴露風(fēng)險(xiǎn)。因此，如何實(shí)現(xiàn)耕地土壤中PAE的高效去除已成為生態(tài)環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

在土壤PAE治理技術(shù)中，物理修復(fù)工程量大、成本昂貴；化學(xué)修復(fù)效率高、降解譜廣，但降低地力并增加修復(fù)成本；植物修復(fù)效率低、周期長(zhǎng)^[6]。利用微生物修復(fù)土壤無(wú)二次污染，頗具優(yōu)勢(shì)，在降解土壤PAE中具有較好的應(yīng)用潛力^[7]。國(guó)內(nèi)外針對(duì)PAE降解菌的分離篩選及功能研究已開(kāi)展多年，目前已有包括假單胞菌（Pseudomonas sp.）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）和巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）在內(nèi)的超過(guò)80個(gè)PAE降解菌得到了詳細(xì)的研究報(bào)道^[6，8-9]。但這些 PAE降解菌主要從水體、土壤及污泥等環(huán)境介質(zhì)中分離獲得，而從植物體內(nèi)分離篩選具有降解PAE功能內(nèi)生菌的報(bào)道較少^[10]。在植物根際接種內(nèi)生菌不但顯著促進(jìn)了土壤中農(nóng)藥、多環(huán)芳烴等有機(jī)污染物降解，也明顯加速了植物體內(nèi)有機(jī)污染物降解速率^[11-13]。因此，利用植物內(nèi)生菌同時(shí)去除耕地土壤和作物體內(nèi)的PAE具有重要應(yīng)用潛力，對(duì)于PAE污染土壤的修復(fù)和降低人體PAE暴露風(fēng)險(xiǎn)具有十分重要的意義^[10]。

多數(shù)PAE降解菌能以一種或多種PAE為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝^[8]。然而，自然環(huán)境中碳源種類(lèi)繁多，降解菌對(duì)PAE的代謝途徑、降解速率等特征可能因其他碳源存在而發(fā)生顯著改變^[14]。此外，當(dāng)土壤中污染物濃度較低時(shí)，微生物生長(zhǎng)代謝所需的生長(zhǎng)基質(zhì)不足，微生物可能利用其他生長(zhǎng)基質(zhì)以提供生命活動(dòng)所需的碳源和能源^[15]，這些碳源物質(zhì)可提高土壤微生物活性和相關(guān)降解酶活性，從而加速污染物的共代謝降解^[16]。因此，開(kāi)展微生物對(duì)PAE的共代謝降解研究，對(duì)于強(qiáng)化功能細(xì)菌對(duì)PAE污染土壤的修復(fù)作用有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，大蒜及其產(chǎn)地土壤中存在PAE污染風(fēng)險(xiǎn)。其中，大蒜中的主要PAE污染種類(lèi)為DBP，大蒜產(chǎn)地土壤中主要PAE檢出種類(lèi)為DMP（鄰苯二甲酸二甲酯）、DEP（鄰苯二甲酸二乙酯）、DBP和DEHP等^[17]?；诖耍狙芯繌腜AE污染大蒜中篩選獲得具有降解PAE功能的內(nèi)生菌，通過(guò)生理生化試驗(yàn)、結(jié)合16S rRNA基因測(cè)序?qū)?nèi)生菌進(jìn)行種屬鑒定，考察了不同內(nèi)生菌對(duì)PAE的共代謝降解特性，優(yōu)化了共代謝降解條件，初步探索了內(nèi)生菌對(duì)中國(guó)土壤中主要PAE污染類(lèi)型的降解代謝途徑，分析了共代謝底物對(duì)PAE降解途徑的影響。研究結(jié)果可以豐富內(nèi)生菌強(qiáng)化PAE降解代謝理論，為進(jìn)一步利用內(nèi)生菌進(jìn)行PAE污染土壤的生物修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 主要儀器 氣相色譜儀（島津Nexis GC-2030，日本島津公司產(chǎn)品）、掃描電子顯微鏡（蔡司ZEISS EVO-LS10，德國(guó)蔡司集團(tuán)產(chǎn)品）、離子濺射儀（CRESSINGTON 108auto，英國(guó)cressington公司產(chǎn)品）、臨界點(diǎn)干燥儀（Quorum K850，英國(guó)Quorum公司產(chǎn)品）、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Biotek EPOCH2，美國(guó)BioTek公司產(chǎn)品）、超純水機(jī)（Millipore，美國(guó) Merck Millipore 公司產(chǎn)品）、數(shù)顯型多管式旋渦混合儀（DMT-2500，鄭州明天儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品）、超聲波清洗器（KQ-500DV，昆山超聲儀器有限公司產(chǎn)品）、高通量樣品磨樣機(jī)（CK-2000，北京托摩根生物有限公司產(chǎn)品）、高速冷凍離心機(jī)（中科中佳KDC-220HR，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品）。

1.1.2 化學(xué)試劑 99.0% DMP、99.5% DEP和99.0% DEHP，購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司；99.5%DBP購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；98%鄰苯二甲酸丁芐酯（BBP）和98%鄰苯二甲酸二辛酯（DnOP），購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

6種PAE（DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP）混合標(biāo)準(zhǔn)液：用天平稱(chēng)取6種PAE各1.0 g，用色譜級(jí)乙腈將其定容至100 ml，配置成6種PAE質(zhì)量濃度分別為10 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液。

色譜級(jí)正己烷購(gòu)自北京邁瑞達(dá)科技有限公司；色譜純乙腈購(gòu)自德國(guó)Merck公司；硫酸錳購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸鎳購(gòu)自成都科龍化工試劑廠；2.4-二硝基苯酚（DNP）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM）： MgSO₄·7H₂O 0.40 g、 K₂HPO₄0.20 g、 （NH₄）₂SO₄0.20 g、 CaSO₄0.08 g、微量元素溶液1 ml，去離子水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.2±0.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min備用。微量元素溶液參考Ma等^[18]的方法配制。

R2A培養(yǎng)基：胰蛋白胨0.25 g、酸水解酪蛋白0.50 g、酵母浸粉0.50 g、可溶性淀粉0.50 g、磷酸氫二鉀0.30 g、硫酸鎂0.10 g、丙酮酸鈉0.30 g、蛋白胨0.25 g、葡萄糖0.50 g，去離子水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.2±0.2。

LB液體培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g，去離子水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.0±0.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min備用。固體培養(yǎng)基分別在上述液體培養(yǎng)基中加瓊脂15 g，滅菌后備用。

20 mmol/L PBS緩沖液：NaH₂PO₄·2H₂O 0.592 8 g、Na₂HPO₄·12H₂O 5.799 6 g，超純水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.4。

1.2 PAE降解菌的分離篩選、純化與鑒定

1.2.1 菌株的分離篩選與純化 供試大蒜（Alliumstivum L.）品種為大青稞，采集自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜試驗(yàn)田。該試驗(yàn)田長(zhǎng)期用于PAE污染修復(fù)試驗(yàn)，PAE污染質(zhì)量分?jǐn)?shù)約80mg/kg。待大蒜生長(zhǎng)至鱗莖膨大期，隨機(jī)采集5株大蒜苗帶回實(shí)驗(yàn)室，自來(lái)水清洗后，參考馮發(fā)運(yùn)等^[19]的方法進(jìn)行莖葉部分表面消毒。用無(wú)菌剪刀將消毒后的大蒜莖葉樣品剪成2～3 cm小段，取4段樣品置于10 ml滅菌的塑料離心管中，添加1 ml無(wú)菌水和2顆滅菌的氧化鋯陶瓷珠，利用高通量樣品磨樣機(jī)700 r/min研磨5 min。取研磨液100 μl轉(zhuǎn)入100 ml的LB培養(yǎng)液中，30 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h，5 000 r/min離心5 min收集菌體， MSM清洗3次，將菌體重懸于MSM培養(yǎng)液中，取100 μl菌懸液均勻涂布于MSM固體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含6種質(zhì)量濃度均為20 mg/L的PAE。30 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落在以PAE為碳源的MSM固體培養(yǎng)基上劃線，對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行分離純化。重復(fù)操作5次后，挑選能以PAE為碳源生長(zhǎng)的菌株，轉(zhuǎn)入20%甘油中-80 ℃保藏。

1.2.2 菌株鑒定 將保藏的內(nèi)生菌轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)液中，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，獲得活化菌株。利用革蘭氏染色法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類(lèi)。

氨芐青霉素抗性：將內(nèi)生菌接種于氨芐青霉素終質(zhì)量濃度為50 mg/L的LB培養(yǎng)液中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

菌落形態(tài)：將活化的菌株在LB培養(yǎng)基上劃線，置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待菌落形成后，觀察并記錄其形態(tài)、大小、顏色。

細(xì)菌形態(tài)：內(nèi)生菌在LB培養(yǎng)液中30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，離心收集菌體，20 mmol/L的PBS緩沖液清洗菌體3次，每次10 min。通過(guò)光學(xué)顯微鏡初步觀察菌株的形態(tài)特征。然后，向菌體中加入終體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛，混勻后室溫下浸泡12 h，8 000 r/min離心5 min，棄上清液收集菌體，用酒精進(jìn)行梯度洗脫，最后用100%酒精浸泡3次，每次30 min，利用掃描電子顯微鏡進(jìn)一步觀察菌株的形態(tài)特征。

細(xì)菌16S rRNA基因測(cè)序委托北京擎科生物科技有限公司完成。將獲得的菌株16S rRNA序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列進(jìn)行同源性比較。利用MEGA7.0軟件采用鄰位連接法（Neighbour Joining）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將篩選出的菌株挑取單菌落接種于50 ml LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)30 h，獲得種子液，用滅菌的LB培養(yǎng)液調(diào)節(jié)種子液細(xì)菌含量，使其600 nm處吸光值（OD₆₀₀）為1.0。將種子液取1ml接種于100 ml LB培養(yǎng)基中，每隔2 h測(cè)定1次OD₆₀₀值，連續(xù)測(cè)定30 h，以O(shè)D₆₀₀為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.4 菌株對(duì)PAE的降解試驗(yàn)

1.4.1 共代謝降解試驗(yàn) 以篩選的菌株為供試菌株，以D-纖維二糖為生長(zhǎng)基質(zhì)、PAE為共代謝底物，開(kāi)展共代謝降解試驗(yàn)。將篩選得到的菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)14 h，離心收獲菌體，MSM清洗三遍。取197.6 ml MSM液體培養(yǎng)基，依次添加10%吐溫80（助溶劑）2 ml^[20]、10 mg/ml的6種PAE混合標(biāo)準(zhǔn)液0.4 ml，將其充分混勻后取20 ml分裝于玻璃錐形瓶中，作為未接種菌液樣品的對(duì)照組（CK），將清洗好的菌株重懸于剩余MSM培養(yǎng)液中，調(diào)整培養(yǎng)液初始OD₆₀₀為0.1，分裝于玻璃錐形瓶中，設(shè)置加D-纖維二糖和不加D-纖維二糖兩個(gè)處理。加糖濃度為10 mmol/L。將玻璃錐形瓶密封后于180 r/min、30℃搖床中培養(yǎng)3 d，取樣檢測(cè)MSM培養(yǎng)基中PAE質(zhì)量濃度。每處理3次重復(fù)。

1.4.2 共代謝降解條件優(yōu)化 選擇降解能力強(qiáng)，且具有氨芐抗性的菌株開(kāi)展共代謝降解條件優(yōu)化試驗(yàn)。以吐溫80添加量0.1%、10 mmol/L的D-纖維二糖、培養(yǎng)液初始OD₆₀₀0.1為初始值，開(kāi)展吐溫80添加量（0.006%、0.012%、0.025%、0.050%和0.100%），碳源種類(lèi)（D-葡萄糖、D-果糖、D-纖維二糖、蔗糖和麥芽糖），碳源添加量（1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L和50 mmol/L），細(xì)菌接種量（OD₆₀₀為0.05、0.10、0.20、0.30、0.40和0.50）對(duì)菌株生長(zhǎng)及PAE降解的單因素影響試驗(yàn)，依次確定最佳吐溫80添加量、最佳碳源種類(lèi)、最佳碳源添加量、最佳初始接菌量。試驗(yàn)步驟及其他試驗(yàn)條件參考方法1.4.1，以不接菌液處理為對(duì)照，每組3次重復(fù)。

在最優(yōu)條件下，進(jìn)一步研究了菌株對(duì)不同質(zhì)量濃度PAE（1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L）的降解能力。分別在1 d、2 d、3 d、5 d和7 d取樣測(cè)定菌株含量（OD₆₀₀）和MSM培養(yǎng)液中PAE殘留量，并計(jì)算PAE降解率和半衰期^[21]。

式中：C₀為初始PAE質(zhì)量濃度（mg/L）；C_t為t時(shí)間的PAE質(zhì)量濃度（mg/L）；k為降解速率常數(shù)（d^-1）；t₁/2為半衰期（d）。

1.5 PAE降解菌代謝途徑分析

1.5.1 細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取 將篩選獲得的菌株DGB-1轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)14 h，取2 ml菌液，根據(jù)AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒提取質(zhì)粒，菌塊中添加100 mg/ml的溶菌酶10 μl，供試菌株設(shè)置2個(gè)重復(fù)，枯草芽孢桿菌菌株W34為對(duì)照（該菌確認(rèn)含有質(zhì)粒）。取8 μl質(zhì)粒，加入2 μl的5×Loading buffer，混勻，在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，電壓為130 V。通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，與Marker比較確定質(zhì)粒大小。

1.5.2 胞內(nèi)粗酶液對(duì)6種PAE的降解 胞內(nèi)粗酶液制備：取10%的吐溫80 0.4 ml分別加入159.6 ml MSM和R2A培養(yǎng)基中，得到吐溫80含量為0.025%的MSM培養(yǎng)基和R2A培養(yǎng)基。將DGB-1接種于200 ml的LB中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)14 h。離心收獲菌體，MSM培養(yǎng)液清洗3遍，分別重懸于20 ml R2A和MSM培養(yǎng)基中，調(diào)整菌液含菌量，使得初始OD₆₀₀為0.1。設(shè)置加菌、菌+糖、菌+PAE、菌+糖+PAE 4個(gè)處理，加糖處理D-纖維二糖濃度為10 mmol/L，加PAE處理6種PAE處理質(zhì)量濃度均為20 mg/L。30℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3 d，離心收獲菌體，20 mmol/L PBS清洗3次，置于-20 ℃冰箱冷凍2 h后，取出菌體于滅菌研缽中，依次加入液氮和20 mmol/L的PBS緩沖液進(jìn)行研磨，研磨液（粗酶液）轉(zhuǎn)入5 ml容量瓶中并用PBS緩沖液定容后，置于冰浴中保存?zhèn)溆谩?/p>

PAE體外降解試驗(yàn)：取1.98 ml粗酶液，轉(zhuǎn)入10 ml玻璃試管中，添加20 μl 1 000mg/L的6種PAE標(biāo)液（溶劑為乙腈），使PAE終質(zhì)量濃度為10 mg/L，用無(wú)菌橡膠塞密封后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h后，向試管中添加2 ml正己烷提取PAE，利用氣相色譜法（GC）分析粗酶液中PAE含量。

1.5.3 DNP（2，4-二硝基苯酚）、Mn²⁺和Ni²⁺對(duì)6種PAE降解的影響 取10%吐溫80 0.4 ml、10 g/L的6種PAE混合液0.32 ml加入159.28 ml的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，得到吐溫80含量0.025%、PAE含量20mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基。將菌株DGB-1接種于LB培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)14 h，菌液離心棄上清液后獲得菌體，MSM培養(yǎng)基清洗3次，將清洗后的菌體重懸于上述無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)菌含量使得培養(yǎng)基初始OD₆₀₀為0.2。設(shè)置2組試驗(yàn)，第1組設(shè)置4個(gè)不同的處理，分別為不加糖不加DNP（-糖-DNP）、不加糖加DNP（-糖+DNP）、加糖不加DNP（+糖-DNP）和加糖加DNP（+糖+DNP）。其中，DNP終濃度為0.5 mmol/L，D-纖維二糖終濃度為10 mmol/L；第2組設(shè)置5個(gè)不同的處理，分別為加糖（+糖）、加糖加0.1 mmol/L Mn²⁺（+糖+0.1 mmol/L Mn²⁺）、加糖加1.0 mmol/L Mn²⁺（+糖+1.0 mmol/L Mn²⁺）、加糖加0.1 mmol/L Ni²⁺（+糖+0.1 mmol/L Ni²⁺）、加糖加1.0 mmol/L Ni²⁺（+糖+1.0 mmol/L Ni²⁺），D-纖維二糖終濃度為10 mmol/L。以不加細(xì)菌而加入等體積滅菌生理鹽水的處理為空白對(duì)照，每處理3次重復(fù)，搖床中振蕩培養(yǎng)，3 d后取樣測(cè)定OD₆₀₀、提取MSM培養(yǎng)基中的PAE，并利用GC法測(cè)定PAE含量。

1.6 樣品中PAE提取及檢測(cè)分析

MSM培養(yǎng)基中PAE提?。簠⒖糒i等^[22]的提取方法稍加改進(jìn)，移液器移取2 ml MSM培養(yǎng)基，移入10 ml玻璃管中，添加2 ml正己烷，多管式旋渦混合儀2 000 r/min渦旋2次，每次5 min，超聲提取2 min，離心5 min后取上層有機(jī)相，利用氣相色譜儀分析6種PAE含量。

采用GC法分析樣品中PAE含量，儀器色譜工作條件如下：色譜柱為SH-Rtx-5（30.00 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氮?dú)?，輔助氣體為高純氫氣 和普通空氣，色譜柱流量1.21 ml/min，分流比2.0，進(jìn)樣量1.0 μl，進(jìn)樣口溫度280 ℃。柱箱升溫程序：初始溫度120 ℃，保持1 min，以20 ℃/min速率升溫至220 ℃，以5 ℃/min速率升溫至235 ℃，以10 ℃/min速率升溫至245 ℃，以5 ℃/min速率升溫至255 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min速率升溫至275 ℃，保持2 min。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和Origin 2021軟件制圖。采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，不同試驗(yàn)組間差異性比較采用單因素方差分析或Tukeys多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 PAE降解菌的分離與鑒定

通過(guò)多次分離純化后，獲得3株可以PAE為碳源生長(zhǎng)的植物內(nèi)生細(xì)菌，分別命名為DGB-1、DGB-3和DGB-8。革蘭氏染色后3株菌株均呈現(xiàn)紅色。氨芐青霉素抗性試驗(yàn)結(jié)果顯示，DGB-1和DGB-8可耐受50 mg/L的氨芐青霉素，但DGB-3不具有氨芐青霉素耐受性。3株菌株的菌落均為圓形、乳白色、不透明，其中DGB-1、DGB-3菌落邊緣整齊（圖1a和圖1b），而DGB-8菌落邊緣呈鋸齒狀（圖1c）。

在光學(xué)顯微鏡下，3株菌株均為長(zhǎng)桿狀（圖1d～圖1f）；掃描電鏡結(jié)果進(jìn)一步證明3株菌株為桿狀細(xì)菌，其中DGB-1和DGB-3形態(tài)較為類(lèi)似，呈短鏈排列（圖1g和圖1h），而DGB-8則呈長(zhǎng)鏈排列（圖1i）。將3株細(xì)菌的16S rRNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，并通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。結(jié)果表明，3株菌株與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）相似度最高，其中DGB-1和DGB-3的親緣關(guān)系較近，DGB-8與上述2株菌株親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，而與巨大芽孢桿菌EGI278的親緣關(guān)系更為接近。DGB-1、DGB-3和DGB-8與同樣能利用DMP、DEP、DBP、DEHP和DnOP等多種PAE為碳源生長(zhǎng)的美人蕉內(nèi)生巨大芽孢桿菌YJB3^[10]的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)（圖2）?；?株菌株的生理生化特征和16S rRNA基因測(cè)序鑒定結(jié)果，DGB-1、DGB-3和DGB-8均鑒定為巨大芽孢桿菌。

2.2 菌株的生長(zhǎng)曲線

如圖3所示，LB培養(yǎng)基中菌株DGB-1、DGB-3和DGB-8在0～4 h生長(zhǎng)較慢，處于遲緩生長(zhǎng)期；4 h后細(xì)菌繁殖速度明顯加快，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；12 h時(shí)后3株菌株生長(zhǎng)速率又再次減慢并在24 h后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。此外，在細(xì)菌培養(yǎng)的30 h內(nèi)，DGB-1和DGB-3的生長(zhǎng)速率無(wú)顯著性差異；4～12 h，DGB-8的生長(zhǎng)速率顯著低于DGB-1和DGB-3，14 h后3株菌株的生長(zhǎng)速率無(wú)顯著性差異（圖3）?；?株菌株的生長(zhǎng)特點(diǎn)，選擇接種14 h菌齡的細(xì)菌開(kāi)展后續(xù)PAE降解試驗(yàn)。

2.3 菌株的共代謝降解

如圖4所示，不加糖的情況下，處理3 d后，加菌處理組MSM培養(yǎng)液中的PAE含量?jī)H比對(duì)照下降0.89%～10.40%，僅DGB-1菌株對(duì)DBP和BBP的降解率與CK有顯著差異。這說(shuō)明不加糖情況下DGB-1、DGB-3和DGB-8對(duì)6種PAE的降解能力均較差。添加D-纖維二糖后，菌株DGB-1對(duì)DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP的降解率分別為47.8%、89.5%、100.0%、100.0%、56.4%和79.4%；菌株DGB-3對(duì)DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP的降解率分別為50.7%、90.9%、100.0%、100.0%、53.2%和74.9%；菌株DGB-8對(duì)DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP的降解率分別為11.1%、20.8%、30.5%、29.4%、10.1%和13.2%。以D-纖維二糖為共代謝基質(zhì)，可顯著提高3株菌株對(duì)6種PAE的降解能力。DGB-1與DGB-3對(duì)6種PAE均有較高的降解能力，兩者之間無(wú)顯著差異，而DGB-8對(duì)6種PAE的降解率均顯著低于DGB-1和DGB-3。Feng等^[10]的研究結(jié)果也表明，添加醋酸鈉作為外源碳源可顯著促進(jìn)巨大芽孢桿菌YJB3對(duì)PAE的共代謝降解^[23]。這可能是由于PAE、多環(huán)芳烴（PAH）等有機(jī)污染物很難直接作為碳源被微生物利用^[23]，而糖類(lèi)、有機(jī)酸和氨基酸等化合物在為微生物提供營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，也可為微生物生長(zhǎng)代謝提供電子受體或供體，從而促進(jìn)微生物對(duì)有機(jī)污染物的降解能力，該共代謝現(xiàn)象在高分子量、難降解的有機(jī)污染物中較為常見(jiàn)^[16，24]。

由于DGB-1具有較好的PAE降解能力，且對(duì)氨芐青霉素有較高的抗性，所以選擇DGB-1開(kāi)展共代謝降解條件優(yōu)化試驗(yàn)。

2.4 菌株DGB-1的共代謝降解條件優(yōu)化

2.4.1 PAE生物降解的影響因素 吐溫80常作為增溶劑促進(jìn)介質(zhì)中PAE溶解^[20]。不同初始吐溫80添加量對(duì)6種PAE降解率的影響如圖5A所示。 吐溫80添加量在0.006%～0.100%，DBP和BBP的降解率均接近100%；而DMP、DEP、DEHP和DnOP的降解率隨著吐溫80添加量增加呈先增加后下降的趨勢(shì)。當(dāng)吐溫80添加量為0.025%時(shí)，6種PAE的降解率均達(dá)最大值（圖5A），因此最佳吐溫80添加量為0.025%。

在吐溫80添加量為0.025%條件下， 不同共代謝基質(zhì)（碳源種類(lèi)）對(duì)6種PAE降解率的變化如圖5B所示。與不加碳源的CK比，所有碳源處理組6種PAE的降解率顯著增加，說(shuō)明5種碳源均可促進(jìn)DGB-1對(duì)6種PAE的降解。這可能與添加碳源顯著促進(jìn)了細(xì)菌生長(zhǎng)有關(guān)。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)菌液的OD₆₀₀，發(fā)現(xiàn)添加碳源處理組OD₆₀₀（0.535～0.690）顯著高于CK（0.107），即添加碳源，DGB-1的生物量得到顯著提升。從碳源類(lèi)型看，二糖（麥芽糖、蔗糖和D-纖維二糖）對(duì)DBP、BBP、DEHP和DnOP的促降解效果顯著優(yōu)于單糖（葡萄糖和果糖）。然而，二糖處理組菌液OD₆₀₀（0.535～0.568）均低于單糖處理組（0.639～0.690），說(shuō)明細(xì)菌生物量增加不是促進(jìn)PAE降解的唯一原因，可能參與二糖水解的部分酶類(lèi)對(duì)PAE的降解有促進(jìn)作用^[25-26]。此外，添加D-纖維二糖后，DGB-1對(duì)DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP的降解率分別達(dá)34.6%、65.9%、100.0%、100.0%、50.5%和44.4%，對(duì)部分PAE降解率顯著優(yōu)于麥芽糖和蔗糖。因此，最佳碳源種類(lèi)為D-纖維二糖。

在最優(yōu)吐溫80添加量的條件下，不同D-纖維二糖濃度對(duì)6種PAE降解率的影響如圖5C所示。隨著D-纖維二糖濃度的增加，DEHP和DnOP的降解率不斷增加，而DMP、DEP、DBP和BBP的降解率呈先增加后降低的趨勢(shì)。檢測(cè)DGB-1菌液的OD₆₀₀，發(fā)現(xiàn)D-纖維二糖濃度為1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L和50 mmol/L時(shí)菌液OD₆₀₀值分別為0.207、0.464、0.585、1.373和1.423，說(shuō)明隨著碳源濃度增加DGB-1的生物量顯著增加。當(dāng)D-纖維二糖初始濃度為10 mmol/L時(shí)，除DEHP和DnOP外的4種PAE降解率均達(dá)到最大值，因此最優(yōu)碳源濃度為10 mmol/L。

不同接菌量對(duì)菌株DGB-1降解PAE的影響如圖5D所示。隨著初始接菌量增加，6種PAE的降解率均呈增加趨勢(shì)，證明細(xì)菌生物量增加可促進(jìn)PAE降解。此外，菌株DGB-1菌液的OD₆₀₀由0.05增加至0.50，6種PAE的降解率僅增加1.25%～21.0%，說(shuō)明細(xì)菌生物量增加不是影響6種PAE降解的主要因素。當(dāng)初始接菌量OD₆₀₀≥0.2時(shí)，菌株DGB-1對(duì)DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP 5種PAE的降解率增加不顯著，因此菌株DGB-1菌液的OD₆₀₀等于0.2為最優(yōu)初始接種量。

以上單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株DGB-1的共代謝優(yōu)化條件是吐溫80添加量0.025%、10mmol/L的D-纖維二糖為共代謝基質(zhì)、適宜接菌量是菌液的OD₆₀₀為0.20。此外，菌株DGB-1生物量的增加與PAE的降解率上升并不成比例，說(shuō)明菌液生物量增加并不是提高PAE降解率的主要原因，添加碳源作為共代謝底物，菌株DGB-1細(xì)胞中催化PAE降解的酶活性增強(qiáng)可能是PAE加速降解的重要原因之一。

2.4.2 最優(yōu)條件下菌株DGB-1對(duì)6種PAE的降解特性 基于最優(yōu)降解條件，菌株DGB-1對(duì)不同初始質(zhì)量濃度PAE處理3 d后的降解特性如圖6所示。當(dāng)PAE初始質(zhì)量濃度≤20 mg/L，DGB-1可完全降解DBP、BBP和DEHP；DMP、DEP和DnOP的降解率最高可達(dá)48.6%、92.8%和100.0%，說(shuō)明菌株DGB-1對(duì)6種PAE均具有良好的降解效果，且具備同時(shí)降解6種PAE的潛力。此外，6種PAE在MSM培養(yǎng)基中的降解動(dòng)態(tài)均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程（表1）。當(dāng)PAE質(zhì)量濃度為5 mg/L，DBP和BBP的t₁/2值分別為0.66 d和0.91 d，說(shuō)明菌株DGB-1對(duì)短鏈PAE（碳鏈長(zhǎng)度＜7）的降解速度較快。此外，菌株DGB-1對(duì)高相對(duì)分子質(zhì)量、難降解的長(zhǎng)鏈PAE如DEHP和DnOP的降解速度也很快（t₁/2值分別為1.08 d和0.67 d）。當(dāng)PAE質(zhì)量濃度增加至50 mg/L，DGB-1對(duì)PAE的降解半衰期均明顯延長(zhǎng)（DEP除外），其中DBP、BBP和DMP的半衰期延長(zhǎng)1～2 d，而DEHP和DnOP的降解半衰期延長(zhǎng)了6 d以上（表1）。這可能是由于高濃度PAE脅迫導(dǎo)致菌株DGB-1細(xì)胞生長(zhǎng)速率的變化所致^[27-28]。

2.5 菌株DGB-1的PAE降解途徑

微生物對(duì)PAE、PAH等有機(jī)污染物的降解主要依賴(lài)其降解酶^[10，29]，而酶的編碼基因可能位于其基因組或質(zhì)粒上^[30-31]，細(xì)菌對(duì)PAE的降解也可能是質(zhì)粒和染色體上基因共同作用的結(jié)果。然而，菌株DGB-1是否攜帶質(zhì)粒、質(zhì)?；蚪M中是否含有PAE降解基因尚不清楚。

2.5.1 菌株質(zhì)粒DNA提取 以含質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌W34為對(duì)照，提取了菌株DGB-1的質(zhì)粒DNA。如圖7所示，菌株W34存在質(zhì)粒，基因片段大小約2 kb，說(shuō)明質(zhì)粒提取方法適用于革蘭氏陽(yáng)性菌。然而，添加菌株DGB-1質(zhì)粒DNA的泳道無(wú)條帶，說(shuō)明菌株DGB-1不攜帶可降解PAE基因的質(zhì)粒。研究結(jié)果表明，菌株DGB-1的PAE降解基因位于該菌的染色體上。

2.5.2 粗酶液對(duì)PAE的降解作用 與細(xì)菌對(duì)其他有機(jī)污染物降解類(lèi)似，細(xì)菌對(duì)PAE的降解主要依賴(lài)其酶的催化作用^[27，32]。不同培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，菌株DGB-1的粗酶液對(duì)6種PAE的降解作用如圖8所示。PAE脅迫條件下，與不加糖的CK比，加糖處理組DBP含量（圖8A和8B）、DnOP含量（圖8A）和DEHP含量（圖8B）顯著下降，說(shuō)明PAE脅迫下加糖可激活DBP、DEHP和DnOP降解酶的活性。本研究發(fā)現(xiàn)加糖可以顯著促進(jìn)菌株DGB-1對(duì)DBP的降解（圖4A），并且菌株DGB-1的粗酶液也具有一定的DBP降解能力，但粗酶液對(duì)DBP的降解率僅8.1%～12.8%（圖8A和8B），說(shuō)明菌株DGB-1對(duì)DBP的水解作用較弱。此外，加糖處理組MSM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌制備的粗酶液不具備DEHP催化活性（圖8A），而寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基R2A培養(yǎng)細(xì)菌制備的粗酶液具有DEHP催化活性（圖8B），說(shuō)明菌株DGB-1降解酶基因的啟動(dòng)子可能為誘導(dǎo)型。然而，在PAE和D-纖維二糖的共同誘導(dǎo)下，雖然菌株DGB-1的粗酶液對(duì)DEHP和DnOP有一定的降解能力，但DEHP和DnOP的降解率僅為8.58%和7.78%，說(shuō)明菌株DGB-1對(duì)DEHP和DnOP的水解作用也較弱。

2.5.3 細(xì)菌呼吸鏈系統(tǒng)對(duì)菌株DGB-1降解6種PAE的影響 上述分析表明，加糖條件下菌株DGB-1對(duì)DBP的降解率可達(dá)100%（圖4A），但菌株DGB-1的胞內(nèi)酶粗提液對(duì)DBP的水解作用較弱（圖8），推測(cè)菌株DGB-1還存在其他的DBP降解代謝途徑。因此，進(jìn)一步研究了呼吸鏈系統(tǒng)（氧化還原酶系）對(duì)菌株DGB-1降解PAE的影響。

DNP作為解耦聯(lián)劑可以抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上的氧化磷酸化過(guò)程，從而抑制細(xì)菌的呼吸作用^[33]。如圖9A所示，與CK相比，加糖不加DNP處理下，DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP的降解率分別為41.10%、81.26%、100.00%、97.67%、41.25%和79.41%，加糖加DNP處理組6種PAE的降解率分別為24.81%、51.20%、60.00%、48.80%、30.37%、61.47%，比加糖不加DNP處理均顯著下降，說(shuō)明DNP抑制了6種PAE的降解。同樣不加糖時(shí)，加DNP處理的降解率亦低于不加DNP處理。此外，加糖不加DNP處理組與加糖加DNP處理組菌液OD₆₀₀分別為0.766和0.761，表明DNP對(duì)菌株DGB-1生長(zhǎng)的影響不顯著。說(shuō)明菌株DGB-1細(xì)胞膜上的呼吸鏈系統(tǒng)參與了6種PAE的降解代謝。

Mn²⁺和Ni²⁺屬于過(guò)渡金屬離子，具有可變的氧化數(shù)，可與底物（PAE）發(fā)生電子交換作用，從而促進(jìn)底物的氧化還原過(guò)程^[34-35]。如圖9B和9C所示，添加Mn²⁺和Ni²⁺顯著促進(jìn)了菌株DGB-1對(duì)6種PAE的降解，且隨著Mn²⁺和Ni²⁺濃度增加PAE降解率均呈增加趨勢(shì)。這說(shuō)明細(xì)胞膜氧化還原反應(yīng)的增強(qiáng)可促進(jìn)PAE降解。

3 結(jié)論

從大蒜中篩選獲得3株P(guān)AE降解菌DGB-1、DGB-3和DGB-8，鑒定分析均為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。雖然3株菌能以6種PAE為碳源生長(zhǎng)，但對(duì)6種PAE的降解能力均較弱。糖類(lèi)可顯著促進(jìn)3株細(xì)菌對(duì)PAE的共代謝降解。添加糖類(lèi)作為生長(zhǎng)基質(zhì)，菌株DGB-1和DGB-3對(duì)DBP和BBP的降解率可達(dá)100%。吐溫80添加量、碳源種類(lèi)、碳源濃度和細(xì)菌接種量對(duì)菌株DGB-1生長(zhǎng)及PAE降解均有顯著影響。最佳降解條件是吐溫80添加量0.025%，10 mmol/L的D-纖維二糖為共代謝基質(zhì)，菌株DGB-1接種量OD₆₀₀為0.2。研究還發(fā)現(xiàn)菌株DGB-1不攜帶質(zhì)粒，說(shuō)明該菌的PAE降解基因位于其染色體上。菌株DGB-1可同時(shí)通過(guò)水解和氧化還原2種途徑降解PAE。其中，在PAE和D-纖維二糖的共同誘導(dǎo)下，菌株DGB-1可通過(guò)水解途徑完成對(duì)DBP、DEHP和DnOP的第一步降解，但對(duì)這3種PAE的水解作用較弱；菌株DGB-1可通過(guò)氧化還原途徑降解DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP，添加Mn²⁺和Ni²⁺顯著提高了菌株DGB-1對(duì)這6種PAE的降解速率。

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（責(zé)任編輯：石春林）