血清4型禽腺病毒TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法的建立與應用

吳雙 　張聰 　袁慧莎 　戴利霞 　林夢舟 　吳植 　朱善元

摘要： 為建立快速檢測血清4型禽腺病毒?。‵owl aviadenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4）的基于TaqMan探針的Quantitative real-time PCR（qPCR）檢測方法，本研究根據(jù) Hexon基因序列，設計相關的qPCR特異性引物和探針，經(jīng)特異性、敏感性和重復性試驗以及反應程序等系列優(yōu)化后，最終建立熒光定量檢測方法并應用于臨床樣品的病原檢測。FAdV-4的qPCR結(jié)果表明，優(yōu)化后標準曲線決定系數(shù)（R²）為0.998，擴增效率（E）為95.226%，該方法效果良好。利用該方法，除FAdV-4外其他禽類常見病原均未檢測到，該方法具有良好的特異性。該qPCR方法檢出陽性的最低拷貝數(shù)為100個拷貝，而普通PCR方法檢出陽性的最低拷貝數(shù)為10 000個拷貝，說明其具有良好的靈敏度。組內(nèi)和組間變異系數(shù)均≤0.22%，該方法的重復性較高。對180份從江蘇、安徽、江西和廣西等省份采集的臨床疑似樣品進行檢測，結(jié)果顯示，qPCR方法檢出率為51.1%，而普通PCR方法檢出率為32.8%；同時基于qPCR引物的檢出符合率為100.00%，而基于普通PCR特異性引物檢出的符合率為82.35%，表明該qPCR方法針對臨床疑似樣品的檢測準確性更高。該方法的建立有助于推動禽腺病毒病的分子流行病學研究和防控。

關鍵詞： 血清 4 型禽腺病毒；熒光定量PCR；臨床應用

中圖分類號： S831.7 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）01-0134-08

Establishment and application of quantitative real-time PCR detection method for fowl aviadenovirus serotype 4 based on TaqMan probe

WU Shuang¹， ZHANG Cong^1，2， YUAN Hui-sha^1，2， DAI Li-xia²， LIN Meng-zhou¹， WU Zhi¹， ZHU Shan-yuan¹

（1.Jiangsu Provincial Key Laboratory of Veterinary Bio-pharmaceutical High-Tech Research， Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College， Taizhou 225300，China；2.Hesheng Food Group Co.， Ltd.， Taizhou 225300，China）

Abstract： To establish rapid detecting method for fowl aviadenovirus serotype 4 （FAdV-4） detection based on quantitative real-time PCR （qPCR） with TaqMan probe， specific primers and TaqMan probe for qPCR were designed based on Hexon gene sequence of FAdV-4 in GenBank. After a series of optimization operations of specificity， sensitivity， repetitive experiments and reaction procedure， the fluorescence quantitative detection method was finally established and was applied to the pathogen detection of clinical samples. qPCR results of FAdV-4 showed that， coefficient of determination （R²） of the optimized standard curve was 0.998， and the amplification efficiency （E） was 95.226%， which indicated that the method had good effect. Other common avian pathogens were not detected except for FAdV-4 by using the detecting method. The lowest copy for detecting sensitivity by qPCR method was 100， while the lowest copy for detecting sensitivity by conventional PCR method was 10 000， which indicated that the qPCR method had good sensitivity. The variation coefficients between and within groups were all ≤0.22%， which showed high repeatability of the method. 180 clinical suspected samples collected from Jiangsu province， Anhui province， Jiangxi province and Guangxi Zhuang Autonomous Region were detected. The results showed that， positive detection rate of qPCR method was 51.1%， while the value of conventional PCR method was 32.8%. The positive detection rate based on qPCR primers was 100.00%， and the value based on conventional PCR specific primers was 82.53%， which revealed that the qPCR method had higher positive detection rate for clinical suspected FAdV-4 sample detection. The establishment of quantitative real-time PCR with TaqMan probe detection method is conducive to promote molecular epidemiological investigation and control of fowl aviadenovirus.

Key words： fowl aviadenovirus serotype 4;fluorescent quantitative PCR;clinical application

禽腺病毒（Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）屬于腺病毒科禽腺病毒屬，是無囊膜的雙鏈DNA病毒^[1]。FAdV分為A～E 5個種，1～7、8a、8b、9～11等12個血清型^[2]，其中血清 4 型禽腺病毒致病能力較強，臨床表現(xiàn)為心包積液綜合征和/或包涵體肝炎，可以垂直傳播及水平傳播，沒有明顯的季節(jié)性，主要感染3～6周齡的雞，死淘率高達30%～80%，是目前給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大損失的重要病原之一^[3-5]。

然而，目前針對FAdV-4的研究成果較少，能用于臨床的有效免疫防控措施更少，國內(nèi)商品化禽腺病毒滅活苗僅有新流腺三聯(lián)滅活疫苗。因此，效率高、速度快、特異性強的病原診斷方法對該病的防控十分重要。目前已有的FAdV-4的檢測方法有血清學檢測、病毒的分離培養(yǎng)、普通PCR等，這些方法存在易出現(xiàn)假陽性、特異性低等缺點^[6]。敏感性好和特異性高是TaqMan探針實時熒光定量PCR（qPCR）方法的獨特亮點，因此常被用于病原核酸檢測^[7]。由于FAdV-4給養(yǎng)禽業(yè)造成日益嚴重的經(jīng)濟損失且相關檢測方法匱乏，因此本研究旨在建立一種能特異針對FAdV-4 Hexon基因的病原快速檢測以及病毒載量測定的qPCR方法，為該病的防控提供新方法。

1 材料與方法

1.1 生物材料

特異性驗證試驗中涉及的生物材料包括商品化活疫苗毒：新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）、傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus， IBV）、雞傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus， IBDV）、雞痘病毒（Fowlpox virus， FPV）、傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus， ILTV）。以及本實驗室鑒定、分離和保存的毒株：血清4型禽腺病毒（Fowl aviadenovirus serotype 4， FAdV-4）、H9亞型禽流感病毒（Avian influenza virus of type H9， H9N2-AIV）、禽白血病病毒（Avian leukemia virus， ALV）和傳染性貧血病病毒（Chicken anaemia virus， CIAV）。

1.2 試劑和儀器

本研究所用試劑和儀器主要包括：南京諾唯贊生物科技有限公司生產(chǎn)的凝膠回收、質(zhì)粒提取試劑盒；康為世紀生物科技有限公司生產(chǎn)的病毒核酸提取試劑盒；寶生物工程有限公司生產(chǎn)的Premix Taq（品名：TaKaRa Taq version 2.0 plus dye）DNA 酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix Ex Taq、DH5α、克隆載體pMD 19-T Vector、DNA marker；美國ABI公司生產(chǎn)的QuantStudio Q3 實時熒光定量PCR系統(tǒng)；美國MP公司生產(chǎn)的高速組織破碎儀。

1.3 引物和探針的設計與合成

參考GenBank數(shù)據(jù)庫中的FAdV-4基因序列（登錄號：MN102413.1），用BioEdit軟件對其進行比對分析，針對Hexon基因序列的保守區(qū)，利用Primer Express設計1對qPCR引物與探針序列以及1對標準品引物，同時參照考文獻[8]合成1對普通PCR特異性引物，引物序列見表1。本研究所涉及引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 核酸提取及反轉(zhuǎn)錄

選取疑似陽性的新鮮臨床樣品0.2 g加入到2 ml研磨管中，然后加入9倍量的含有4種常用抗生素的PBS（磷酸鹽緩沖液），使用勻漿機將樣品打碎，10 min，12 000 r/min高速離心后吸取上清液。參照病毒核酸提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，進行核酸提取并對其中的RNA病毒核酸進行反轉(zhuǎn)錄。提取的核酸和反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組質(zhì)粒標準品制備

以提取的FAdV-4核酸為模板進行Hexon基因擴增，回收條帶后電泳檢測正確的條帶。將回收產(chǎn)物與pMD 19-T Vector連接后，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑平板篩選后挑取白斑進行擴增培養(yǎng)并進行菌落PCR鑒定。提取菌液PCR陽性質(zhì)粒，測定濃度并進行雙酶切鑒定，由南京擎科生物科技有限公司對檢測合格的質(zhì)粒進行測序，剩余質(zhì)粒-80 ℃保存，備用。

1.6 qPCR方法的建立與優(yōu)化

1.6.1 反應條件優(yōu)化 進行反應體系與反應條件的系列優(yōu)化，確定最佳引物濃度、最適退火溫度以及最合理的探針濃度。

1.6.2 標準曲線驗證 質(zhì)粒拷貝數(shù)=6.02×10²³×質(zhì)粒質(zhì)量濃度/（質(zhì)粒DNA長度×660），重組質(zhì)粒質(zhì)量濃度為120 ng/μl，按公式換算可知重組質(zhì)?？截悢?shù)為1 μl 3.89×10¹⁰拷貝。首先將重組質(zhì)粒稀釋至1 μl 1×10¹⁰ 拷貝，再按照10倍梯度進行倍比稀釋，分別取1 μl 1×10¹⁰ 拷貝至1 μl 10拷貝濃度質(zhì)粒作為模板，按上述優(yōu)化的反應條件進行qPCR擴增。最終以質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)值為X軸，循環(huán)數(shù)（Ct值）為Y軸，建立標準曲線^[9]。

1.6.3 特異性驗證 分別取NDV、IBV、IBDV、FPV、ILTV、FAdV-4、H9N2-AIV、ALV、CIAV的 DNA 或 cDNA，按照最優(yōu)反應條件進行qPCR檢測，用滅菌超純水作陰性對照。陽性判定標準為有“S”形擴增曲線且Ct≤35，陰性判定標準為無“S”形擴增曲線且Ct>35，當陰性和陽性對照檢測結(jié)果均成立時樣品結(jié)果才有效。

1.6.4 靈敏度驗證

1.6.4.1 陽性質(zhì)粒靈敏度驗證 以10倍梯度稀釋的陽性質(zhì)粒（1 μl 1×10¹ ～1×10⁶拷貝）作為模板進行qPCR，確定其檢測限，即靈敏度。

1.6.4.2 病料靈敏度 提取陽性新鮮病料的DNA，按已建立的標準曲線進行定量，然后進行10倍梯度倍比稀釋，用作模板驗證靈敏度。

1.6.5 重復性試驗 使用1 μl 1×10⁴ 拷貝、1 μl 1×10⁵ 拷貝、1 μl 1×10⁶ 拷貝 3個濃度的標準質(zhì)粒來驗證重復性。

1.7 臨床樣品檢測

對2020年9月至2022年4月來自江蘇鹽城、安徽阜陽、江西贛州、廣西南寧等地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)雞場的疑似具有雞心包積液－肝炎綜合征（Hydropericardium hepatitis syndrome， HHS）的病雞組織樣（共計180份）分別應用qPCR方法和普通PCR方法進行檢測分析。其中樣品采集嚴格按照2016年修訂的獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范（NY/T 541-2016）要求進行^[10]。比較2種方法的陽性率，同時用普通PCR特異性引物對疑似樣品進行檢測，對擴增產(chǎn)物進行測序分析，比較普通PCR特異性引物與qPCR引物的精確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 qPCR反應條件的優(yōu)化

首先將引物和探針均稀釋至10 μmol/L，經(jīng)矩陣法進行系列優(yōu)化，qPCR的最佳引物濃度為0.3 μmol/L，最佳探針濃度為0.3 μmol/L。最佳反應程序為： 95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s， 60 ℃退火31 s，共計40 個循環(huán)。

2.2 標準曲線的繪制

以標準質(zhì)粒作為模板，濃度為1 μl 1×10¹～1×10¹⁰ 拷貝，按照優(yōu)化的反應條件進行qPCR，其標準曲線見圖1，其線性關系表達式為Y=-3.442x+44.991，R²=0.998，擴增效率（E）=95.226% ，可見該qPCR方法效果良好^[11]，可以用來標定測試品的拷貝數(shù)。

2.3 qPCR的特異性驗證

應用qPCR方法對NDV、IBV、IBDV、FPV、ILTV、FAdV-4、H9N2-AIV、ALV、CIAV的 DNA 或 cDNA進行檢測，結(jié)果顯示，出現(xiàn)典型“S”形擴增曲線且Ct≤35的病毒僅有FAdV-4（圖2），其他病毒均無“S”形擴增曲線，證明此qPCR檢測FAdV-4的方法具有特異性。

2.4 qPCR的靈敏度檢測

2.4.1 檢測標準質(zhì)粒靈敏度 以濃度為1 μl 1×10¹～1×10⁶拷貝的標準質(zhì)粒為模板，進行普通PCR檢測與qPCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FAdV-4的普通PCR檢測靈敏度為1×10⁴ 拷貝（圖3），qPCR檢測靈敏度為1×10² 拷貝（圖4）。

2.4.2 檢測病料靈敏度 將FAdV-4陽性病料的DNA按已建立的標準曲線進行定量，并稀釋得到濃度為1 μl 1×10¹～1×10⁶拷貝的病料DNA。結(jié)果（圖5、圖6）顯示，普通PCR檢測病料靈敏度在1 μl 1×10⁴拷貝，qPCR檢測靈敏度為1 μl 1×10²拷貝，qPCR檢測靈敏度比普通PCR提升100倍，說明本方法能有效提高臨床檢測的靈敏度。

2.5 FAdV-4 qPCR的重復性試驗

以不同濃度的標準質(zhì)粒為模板，進行3次平行重復qPCR，該試驗重復3個批次，最終驗證組內(nèi)和組間變異系數(shù)。結(jié)果（表2）顯示，組內(nèi)變異系數(shù)最大為0.18%，組間變異系數(shù)最大為0.22%，說明該方法重復性良好。

2.6 臨床樣品檢測

應用本研究中建立的qPCR檢測方法和普通的PCR方法對臨床疑似樣品進行檢測。結(jié)果顯示，qPCR的FAdV-4檢出率為51.1%（92/180），普通PCR方法的FAdV-4檢出率為32.8%（59/180），其中qPCR陽性且普通PCR陽性樣品50份，僅qPCR陽性樣品42份，僅普通PCR陽性樣品9份，具體結(jié)果見表3。

對59份普通PCR檢測為陽性的病料的擴增產(chǎn)物進行測序分析，同時取僅qPCR陽性的42份樣品和10份雙陽性樣品中的qPCR擴增產(chǎn)物進行測序分析，以確定本研究建立的qPCR方法的準確性，并比較普通PCR引物與本研究設計的qPCR引物的特異性。結(jié)果顯示，普通PCR的59份擴增產(chǎn)物中51份測序成功，通過BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)，其中9份擴增片段比目的片段長18 bp，且與GenBank中收錄的FAdV-3或FAdV-9序列相似度較高，最高可達98.83%。另外僅qPCR陽性的42份樣品BLAST比對分析結(jié)果顯示，片段大小為667 bp，且與GenBank中收錄的FAdV-4毒株相似，相似度高達100.00%。綜上可知，普通PCR特異性引物檢出符合率為82.35%，而選取的52份qPCR擴增產(chǎn)物測序成功49份，BLAST比對分析結(jié)果顯示，目的條帶大小一致，均為122 bp，且與GenBank中收錄的FAdV-4序列相似度達100%。qPCR特異性引物檢出的符合率為100.00%。

3 討論

雞心包積液-肝炎綜合征，又稱“安卡拉”病，1986首次暴發(fā)于巴基斯坦安卡拉地區(qū)^[12]。該病癥狀典型，流行較快，病原為FAdV-4。相關病例在世界上多個國家相繼被報道^[13-14]。2015年以來FAdV感染在國內(nèi)多個省份的雞群中暴發(fā)，山東省、河南省、江蘇省、安徽省等養(yǎng)殖大省無一幸免^[15-16]，極大地增加了中國雞群的飼養(yǎng)難度。

目前，禽腺病毒不僅多血清型共流行且相對應的診斷方法有限^[17-18]，臨床癥狀還與雞包涵體肝炎病極為相似，這提高了該病的臨床診斷難度。雪上加霜的是禽類感染禽腺病毒后又能繼發(fā)感染大腸桿菌病、禽流感、傳染性法氏囊病等^[19]，此時單憑簡單臨床診斷手法難以確診。此外，禽腺病毒不同的血清型的同源性存在差異，相同血清型的不同毒株也存在致病性的不同，阻礙了疫苗研制的步伐，目前中國僅有1種商品化滅活疫苗用于該病的免疫預防^[20]。及時發(fā)現(xiàn)并確診FAdV的感染，準確評估流行趨勢，是防范此病流行的最有利措施之一，再加上存在臨床癥狀類似的疾病發(fā)生，因此，建立一種高效、靈敏的檢測方法顯得十分重要^[11]。相較于普通PCR檢測特異性差、靈敏度低等問題^[21]，qPCR優(yōu)勢更為突出，定性與定量兼顧且耗時更短，適用于大規(guī)模樣品檢測^[22]。六鄰體蛋白（Hexon）是腺病毒最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，帶有血清型特異性抗原決定簇，學者常以此為靶標設計qPCR檢測方法^[23-24]。在已報道的研究中，張云丹等^[9]發(fā)現(xiàn)普通PCR檢測靈敏度只有約1×10⁵拷貝；劉琳等^[7]開發(fā)的FAdV-4的qPCR檢測方法，檢測限為1 μl 50拷貝，組內(nèi)和組間重復試驗的變異系數(shù)分別為0.75%～1.71%和0.60%～1.74%；竇硯國^[25]建立了一種針對FAdV-4的qPCR檢測方法，檢測靈敏度為20 拷貝，其組內(nèi)和組間重復試驗的變異系數(shù)分別為0.12%～0.39%和0.30%～0.60%。本研究中建立的 qPCR檢測方法線性關系良好，靈敏度為100 拷貝，組內(nèi)變異系數(shù)均≤0.18%，組間變異系數(shù)均≤0.22%，本研究建立的qPCR檢測方法的重復性更高。

為了評估該方法，對2020年9月至2022年4月來自江蘇鹽城、安徽阜陽、江西贛州、廣西南寧等地區(qū)的疑似感染樣品進行檢測，結(jié)果顯示，F(xiàn)AdV-4檢出率為51.1%，且抽取測序成功的49份樣品測序結(jié)果與目的序列一致。上述試驗結(jié)果證明，該qPCR檢測方法比常規(guī)PCR具有更強的靈敏度、更高的重復性以及更好的準確性。因此，本研究建立的qPCR檢測方法，可作為一種檢測和診斷FAdV-4感染的可靠工具，有助于對血清4型禽腺病毒進行臨床診斷和防控。

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（責任編輯：陳海霞）