張 釗, 盧 宇, 楊長亮, 陽 光, 王 麗, 彭 婉,王 超, 黃成成, 曹婧媛, 陳睿堯, 孫 藝

耳聾是造成人類殘疾的常見原因,隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究的深入,遺傳性耳聾逐步被人們重視。根據(jù)是否合并其他系統(tǒng)的病變,可分為綜合征型耳聾和非綜合征型耳聾[1]。鐙骨強(qiáng)直伴拇指(趾)寬大綜合征(stapes ankylosis with broad thumbs and toes,SABTT)(OMIM#184460)是一種導(dǎo)致綜合征型耳聾的常染色體顯性遺傳疾病,其特征是繼發(fā)于鐙骨強(qiáng)直的雙側(cè)傳導(dǎo)性聽力損失、明顯的遠(yuǎn)視、寬拇指(趾)[2-3]。該綜合征的發(fā)病與NOG基因突變相關(guān)。NOG基因(OMIM#602991)定位于17q22的D17S790～D17S794之間,只有一個外顯子(https://www.genenames.org)。Noggin由NOG基因編碼,是一種由232個氨基酸殘基組成的分泌蛋白[3],是一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)功能拮抗劑,通過結(jié)合和掩蓋位于BMP上的Ⅰ型和Ⅱ型受體位點(diǎn)與BMP-7相互作用[4-5]。BMP和Noggin之間的平衡對于骨骼的正常形成至關(guān)重要[6-8]。NOG基因突變可能影響Noggin蛋白的分泌、二聚體的形成以及與BMP的結(jié)合能力[9]。NOG基因中已確定的突變與表型相關(guān),傳導(dǎo)性聽力損失、多發(fā)的骨發(fā)育異常、關(guān)節(jié)粘連是這種綜合征患者的常見癥狀。本研究分析了被診斷為傳導(dǎo)性聽力損失的先證者的臨床表現(xiàn),對患者家系的樣本進(jìn)行了生物學(xué)分析,致病突變是NOG基因的新雜合突變,診斷為SABTT。報告如下。

1 資料與方法

1.1家系臨床資料 家系的先證者是一名34歲女性,湖北武漢人,因“雙耳聽力下降30余年”在我院耳鼻咽喉頭頸外科就診。對先證者進(jìn)行了體格檢查、聽力學(xué)測試,包括純音聽閾測定(頻率250～8 000 Hz)、聲導(dǎo)抗鼓室壓圖、手和腳的X線、顳骨CT檢查。對其父母進(jìn)行詳細(xì)的病史詢問、體格檢查、純音測聽、聲導(dǎo)抗檢查,并采集外周血樣本10 ml。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批號:[2018]016-1)。所有參與研究的家系成員簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1 目標(biāo)序列捕獲與測序 用先證者的靜脈血10 ml,標(biāo)準(zhǔn)流程提取基因組DNA(MagPure Buffy Coat DNA Midi KF Kit)。將基因組DNA打斷并制備文庫,然后通過BGI V4芯片對目標(biāo)基因外顯子及鄰近剪切區(qū)的DNA進(jìn)行捕獲和富集,最后使用MGISEQ-2000測序平臺進(jìn)行突變檢測。測序數(shù)據(jù)質(zhì)控指標(biāo)為:目標(biāo)區(qū)域平均測序深度≥180X,其中目標(biāo)區(qū)深度>20X的位點(diǎn)所占比例>95%。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 通過BWA將測序的片段與hg19人類參考基因組進(jìn)行比較,然后刪除重復(fù)項(xiàng)。GATK用于堿基質(zhì)量校正SNV、INDEL和基因型檢測。通過ExomeDepth檢測外顯子水平的拷貝數(shù)變化。生成目標(biāo)區(qū)域的堿基多態(tài)性結(jié)果,然后與數(shù)據(jù)庫(NCBI dbSNP、gnomAD)進(jìn)行比對,對發(fā)現(xiàn)的可疑突變進(jìn)行注釋和篩選。

1.2.3 Sanger測序 根據(jù)全外顯子組測序生物信息學(xué)分析結(jié)果對NOG基因致病突變進(jìn)行驗(yàn)證,經(jīng)先證者及家系成員Sanger測序證實(shí)該位點(diǎn)是否在家系中共分離。

1.2.4 致病性分析 根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(American Society for Medical Genetics and Genomics,ACMG)指南,對檢測出的突變位點(diǎn)進(jìn)行致病性分析。

2 結(jié)果

2.1家系臨床特征 先證者女性,34歲,3歲時由父母發(fā)現(xiàn)其雙耳聽力下降,言語發(fā)育正常,無眩暈、耳鳴,無耳悶、耳道流膿等癥狀,雙手小指遠(yuǎn)端指間關(guān)節(jié)不能屈曲,弱視及遠(yuǎn)視,生長及智力發(fā)育正常。查體:眼裂窄,眼距正常,半圓柱形鼻,鼻翼發(fā)育不良(見圖1?),雙側(cè)拇指及小指短小,雙拇趾寬且短,第1、2腳趾間隙過深,扁平足(見圖1?),雙耳廓無畸形,雙外耳道通暢,雙鼓膜完整,標(biāo)志清晰。輔助檢查:雙耳純音聽閾測定提示雙耳傳導(dǎo)性聾,氣骨導(dǎo)差平均50 dB(見圖1?)。聲導(dǎo)抗:鼓室壓圖雙耳A型。鐙骨肌反射雙耳均未引出。顳骨CT顯示聽骨形態(tài)正常,聽骨鏈完整。雙手X線正位片:雙側(cè)拇指遠(yuǎn)節(jié)短小,雙側(cè)小指中節(jié)指骨短小畸形,中節(jié)與近節(jié)指關(guān)節(jié)融合,雙側(cè)第5掌骨短小。雙足X線正位片:雙側(cè)第1跖骨短小,右側(cè)較明顯,扁平足(見圖1?)。該家系2代,共計成員3人,繪制家系圖(見圖2?)。僅先證者表現(xiàn)為傳導(dǎo)性聽力損失,聽力損失的特點(diǎn):幼年發(fā)病,隨著年齡增長聽力逐漸下降,并伴有骨發(fā)育異常,弱視及遠(yuǎn)視。先證者父母均無癥狀。家系成員臨床特征見表1。

表1 家系成員臨床特征

?面部:眼裂窄,眼距正常,半圓柱形鼻,鼻翼發(fā)育不良；?雙手及雙腳:雙側(cè)拇指及小指短小,雙拇趾寬且短,第1、2腳趾間隙過深,扁平足；?聽力:雙耳傳導(dǎo)性聾,氣骨導(dǎo)差平均50 dB；?雙手X線正位片:雙側(cè)拇指遠(yuǎn)節(jié)短小,雙側(cè)小指中節(jié)指骨短小畸形,中節(jié)與近節(jié)指關(guān)節(jié)融合,雙側(cè)第5掌骨短小。雙足X線正位片:雙側(cè)第1跖骨短小,右側(cè)較明顯,扁平足

?家系圖；?二代測序結(jié)果:先證者(Ⅱ:1)檢出NOG基因的一個雜合突變c.679G>T,其父母(Ⅰ:1,Ⅰ:2)該位點(diǎn)均為野生型；?NOG基因的保守性分析顯示,該突變位點(diǎn)在多物種之間是高度保守的

2.2NOG基因突變分析結(jié)果 二代測序結(jié)果顯示,先證者(Ⅱ:1)檢測出NOG基因的一個雜合突變NM_005450.4:c.679G>T(p.Glu227Ter)。在其他無疾病表型成員中,未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變(見圖2?)。對NOG基因編碼的Noggin蛋白進(jìn)行保守性分析,發(fā)現(xiàn)其在多物種之間是高度保守的(見圖2?)。多種統(tǒng)計方法預(yù)測突變會對基因或基因產(chǎn)物造成有害影響(SIFT,Mutation Taster,Condel,PhyloP Vertebrates,PhyloP Placetal Mammals,GERP++)。

3 討論

3.1本研究報道了一個以雙耳傳導(dǎo)性聾為首診癥狀的家系,先證者臨床表現(xiàn)雙側(cè)傳導(dǎo)性聾并伴特征性面容、拇指(趾)發(fā)育異常、弱視及遠(yuǎn)視,無眩暈等前庭功能障礙,無耳毒性藥物及環(huán)境噪聲接觸史,否認(rèn)外傷史。通過臨床資料分析符合診斷SABTT。

3.2對家系先證者進(jìn)行高通量測序,并根據(jù)《ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南》進(jìn)行致病性分析,檢測出NOG基因外顯子第679位堿基由鳥嘌呤(G)突變?yōu)樾叵汆奏?T),導(dǎo)致其編碼的第227位的谷氨酸(Glu)突變?yōu)榻K止密碼子(Ter),出現(xiàn)截短突變(PVS1)。該突變是新發(fā)現(xiàn)的突變,在gnomAD數(shù)據(jù)庫中未見報道(PM2)。對NOG基因編碼的Noggin蛋白進(jìn)行保守性分析,發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)在多物種之間高度保守。攜帶該突變的先證者表型高度符合SABTT的診斷(PP4)。家系驗(yàn)證患者父母沒有檢測出該突變提示為新生突變(PS2),突變位點(diǎn)是“致病的”。

3.3NOG基因編碼Noggin蛋白,是BMP信號傳遞的關(guān)鍵調(diào)控因子,在人體發(fā)育特別是軟骨和骨骼的發(fā)育過程中起重要作用[10-11]。NOG突變根據(jù)不同的臨床表現(xiàn)診斷為不同的綜合征,如SABTT、近端指(趾)關(guān)節(jié)融合癥(proximal symphalangism,SYM1)、多發(fā)性骨性連接綜合征1型(multiple synostoses syndrome type 1,SYNS1)。幾種不同綜合征有部分的重疊特征,最常見的包括骨骼和關(guān)節(jié)形成異常,傳導(dǎo)性聽力損失,還可能導(dǎo)致半圓柱形鼻等特征性容貌。但SABTT與SYM1和SYNS1的不同之處在于大部分患者都有遠(yuǎn)視及弱視,但缺乏近端指(趾)關(guān)節(jié)融合、腕骨和跗骨的融合[12-15]。因此,Potti等[16]提出了一個新的術(shù)語:NOG相關(guān)系譜障礙(NOG-related-symphalangism spectrum disorder,NOG-SSD),以幫助臨床識別和評估所有具有這些表型的患者。這些NOG基因突變可在數(shù)據(jù)庫中獲得(https://NOG.lovd.nl)。

3.4目前,文獻(xiàn)報道了9個NOG基因突變導(dǎo)致SABTT的家系。Hilhorst-Hofstee[12]及Weekamp[17]分別報道了2個錯義突變,即c.103C>T(p.Pro35Ser)和c.608T>C(p.Leu203Pro);Weekamp[17]、Brown[14]和Thomeer[18]分別報道了4個移碼突變,即c.129_130dup(p.Val44Glyfs*19)、c.561del(p.Glu188Argfs*76)、c.252dup(p.Glu85Argfs*97)和c.304del(p.Ala102Argfs*22);Brown[14]、Thomeer[18]和Nakashima[19]分別報道了3個無義突變,即c.328C>T(p.Gln110Ter)、c.391C>T(p.Gln131Ter)和c.645C>A(p.C215Ter)。值得注意的是,既往研究報道的與SYM1、SYNS1相關(guān)的NOG突變通常是錯義突變,而目前已知與SABTT相關(guān)的NOG基因的9個突變中,有7個是失活突變,表明NOG基因單倍體表達(dá)不足可能特異性地導(dǎo)致SABTT表型出現(xiàn)。Noggin蛋白的C端區(qū)域有6個保守半胱氨酸,通過3個二硫鍵形成環(huán)狀胱氨酸結(jié)構(gòu)(CCKⅠ-Ⅵ),包括Ⅰ(p.Cys155)-Ⅳ(p.Cys192)、Ⅱ(p.Cys178)-Ⅴ(p.Cys228)和Ⅲ(p.Cys184)-Ⅵ(p.Cys230),形成同源二聚體[20]。本研究中新發(fā)現(xiàn)的NOG基因突變,也是一個無義突變,但因靠近編碼區(qū)末端,可能不會引起無義突變介導(dǎo)的mRNA降解。該突變可能導(dǎo)致Noggin蛋白末端提前5個氨基酸殘基發(fā)生終止,Noggin蛋白末端區(qū)域是高度保守非重復(fù)序列,且p.Cys228和p.Cys178可以形成二硫鍵。推測p.Glu227Ter突變阻止了二硫鍵的形成,導(dǎo)致功能缺陷。

綜上所述,本研究收集到一個診斷為SABTT的家系并明確了家系的致病基因,即NOG基因,鑒定NOG基因一個新的突變位點(diǎn)c.679G>T(p.Glu227Ter)。Nakashima等[19]從病理研究中證實(shí),SABTT患者出生后鐙骨融合會逐漸惡化,導(dǎo)致傳導(dǎo)性聽力損失進(jìn)行性加重。SABTT患者主要的訴求是改善聽力,通常到耳鼻喉科首診,臨床醫(yī)師需要與耳硬化癥等其他傳導(dǎo)性聾疾病鑒別[21]。本研究通過臨床診斷和分子診斷相結(jié)合的方法提高了對此罕見病的認(rèn)識,為此病的鑒別診斷和家系的遺傳咨詢提供了依據(jù)。