劉德浩 陳智濤 舒夏竺 周小峰 黃競中 廖文莉

摘要： ?以馬來沉香半木質(zhì)化莖段為外植體開展組織培養(yǎng)的研究結(jié)果表明，馬來沉香適宜的初代培養(yǎng)基為1/2MS+6- ? BA0.7 mg/L+NAA0.1 mg/L，繼代培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.1 mg/L+NAA0.1mg/L，生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.3 mg/L+NAA ? 2.0 mg/L培養(yǎng)3天后移入1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。增值系數(shù)為2.5倍，生根率為77.19%。

關(guān)鍵詞： ?馬來沉香； ?組織培養(yǎng)； ?快繁

中圖分類號： ? S 722. 3 ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： ? A ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：１００1 － 9499（２０23）02 － 0014 － 03

Study on the Rapid Propagation Technology of Aquilaria malaccensis

LIU Dehao CHEN Zhitao SHU Xiazhu ZHOU Xiaofeng HUANG Jingzhong LIAO Wenli

（Huizhou Institute of Forestry， ?Guangdong Huizhou 516001）

Abstract The semi-lignified stem segments of Aquilaria malaccensis were used as explants for tissue culture. The explants of stem segments displayed the optimum initial growth on the primary media 1/2MS+6-BA0.7 mg/L+NAA0.1 mg/L， the highest proliferation rate of 2.5 times on subculture 1/2MS+6-BA ?0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L， and 77.19% rooting rate on medium1/2MS+IBA0.3 mg/L+NAA2.0 mg/L for 3 days and then transferred to 1/2 MS medium to continue the culture.

Key words Aquilaria malaccensis; tissue culture; rapid propagation

馬來沉香（Aquilaria malaccensis）屬于瑞香科（Thymelaeaaceae）沉香屬（Aquilaria），喬木或小喬木，主要分布于緬甸、泰國、越南、老撾、柬埔寨、馬來半島、蘇門答臘等熱帶、亞熱帶海拔1 000 m以下的雨林和荒山中[ 1 ， 2 ]，能夠適應(yīng)沙地、石灰質(zhì)、水分缺乏的坡地及沼澤地[ 3 ， 4 ]。馬來沉香全株可入藥，且結(jié)香率高，沉香香味濃郁，質(zhì)優(yōu)價(jià)高，經(jīng)濟(jì)效益顯著[ 5 ， 6 ]。本試驗(yàn)以馬來沉香莖段為材料，利用組織培養(yǎng)手段建立植株再生體系，旨在為后期馬來沉香的應(yīng)用、推廣提供一定的理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來自馬來沉香幼苗，幼苗放入蔭棚內(nèi)栽培60天，根部澆水，試驗(yàn)選用當(dāng)年生半木質(zhì)化的嫩枝作為外植體。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 外植體滅菌

連續(xù)晴天3天以上，選取生長健壯、無病蟲害的馬來沉香當(dāng)年生嫩枝帶回實(shí)驗(yàn)室預(yù)處理。嫩枝去除葉片，流水下沖洗2 h后放入超聲波清洗機(jī)中，用0.2%滅菌凈清洗30 min，無菌水清洗5次備用。

以1%NaCLO和0.1%HgCl2為消毒劑，在不同時(shí)間梯度下（3、5、7、9 min）完成滅菌操作。將不同滅菌處理下的馬來沉香嫩枝剪成1～2 cm的帶芽莖段，接種至MS培養(yǎng)基中，每瓶1個(gè)外植體，30次重復(fù)[ 7 ]。接種后20天觀察污染情況，記錄污染數(shù)量和啟動數(shù)量，選出最佳滅菌方式。

1. 2. 2 初代培養(yǎng)

在獲得最佳滅菌方法后，以1/2MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過添加不同濃度的6-BA、NAA配制初代培養(yǎng)基。采用雙因素四水平正交設(shè)計(jì)，6-BA分別設(shè)定0.1、0.3、0.5、0.7 mg/L共4個(gè)濃度梯度，NAA分別設(shè)定0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L共4個(gè)濃度梯度，將預(yù)處理的馬來沉香帶芽莖段接種至培養(yǎng)基中，每瓶1個(gè)外植體，30次重復(fù)。接種后30天觀察記錄芽的萌動狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)啟動率[ 8 ， 9 ]，篩選最佳啟動配方。

1. 2. 3 繼代培養(yǎng)

將初代培養(yǎng)基培養(yǎng)后長出的新芽切下轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中，以1/2MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。采用雙因素四水平正交設(shè)計(jì)，6-BA分別設(shè)定0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L共4個(gè)濃度梯度，NAA分別設(shè)定0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L共4個(gè)濃度梯度。每個(gè)處理10次重復(fù)，每瓶接3個(gè)單芽。接種30天后觀察芽的生長狀況，健康芽的生長標(biāo)準(zhǔn)為粗細(xì)適中、無愈傷組織、無芽頂尖壞死、無葉片卷曲、無黃葉[ 10 ]，統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)。

1. 2. 4 生根培養(yǎng)

切取生長健壯、高度約2 cm的芽苗接種至生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)采用單次、二次2種生根培養(yǎng)方法，以MS、1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，單次生根培養(yǎng)的激素濃度分別為NAA（0、1.0、2.0、3.0 mg/L）、IBA（0、0.1、0.3、0.5 mg/L）；二次生根培養(yǎng)首先是將芽苗接入激素濃度分別為NAA（0、1.0、2.0、3.0 mg/L）、IBA（0、0.1、0.3、0.5 mg/L）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，再接入不添加任何外源激素的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個(gè)處理10次重復(fù)，每瓶接3個(gè)芽苗，接種30天天后統(tǒng)計(jì)生根情況。

1. 2. 5 培養(yǎng)條件

初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基均附加蔗糖30 g/L，瓊脂粉6 g/L，調(diào)節(jié)pH值至5.8。培養(yǎng)溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

1. 2. 6 煉苗與移栽

在完成生根培養(yǎng)后，待幼苗根長達(dá)到2 cm以上，將生根瓶苗轉(zhuǎn)移至遮陰70%的大棚內(nèi)進(jìn)行煉苗，煉苗步驟為：擰松瓶蓋（2 d）、瓶蓋擰開少許（3 d）、瓶蓋完全打開（5 d）。煉苗10天后將生根苗移栽至裝有珍珠巖：泥炭土（1∶1）混合基質(zhì)的21目穴盤中。基質(zhì)在使用前先用0.1%的高錳酸鉀溶液消毒，移栽過程中洗凈培養(yǎng)基，避免根部損傷，移栽后立即澆透水。移栽后每隔10天用1 000倍多菌靈溶液噴灑1次，持續(xù)3次。

1. 2. 7 統(tǒng)計(jì)分析

觀測參數(shù)計(jì)算方法如下：

（1）污染率=（污染外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%

（2）啟動率=（未污染且成活的外植體/接種外植體總數(shù)）×100%

（3）增殖倍數(shù)=（統(tǒng)計(jì)的芽體總數(shù)/接種芽體總數(shù)）

（4）生根率=（生根的苗數(shù)/接種的苗總數(shù)）×100%

（5）成活率=（成活苗數(shù)/移栽苗總數(shù)）×100%

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)前處理，然后使用SAS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 消毒方式與消毒時(shí)間選擇

由于汞離子能夠使蛋白質(zhì)變性進(jìn)而殺死外植體表面的微生物，所以總體來看HgCl2處理下的外植體污染率顯著低于NaCLO，不同消毒方式及消毒時(shí)間存在顯著差異（表1）。1/2MS培養(yǎng)基的外植體啟動率大于MS培養(yǎng)基外植體啟動率。1/2MS做為基本培養(yǎng)基時(shí)，在相同HgCl2濃度不同時(shí)間處理下的外植體污染率最低的是9 min處理，啟動率最高的是5 min處理，隨著處理時(shí)間的增加，馬來沉香的啟動率逐漸降低。因此馬來沉香莖段外植體適宜消毒方式為0.1% HgCl2浸泡5 min，外植體啟動適宜培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基。

2. 2 初代培養(yǎng)

馬來沉香莖段外植體滅菌后接種至初代培養(yǎng)基上5～10天腋芽開始萌動，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)后逐步長出新芽。馬來沉香莖段外植體在不同濃度6-BA、NAA處理下的差異顯著，啟動率為26.27%～84.40%，由表2可知，啟動率最高的是14號處理，達(dá)84.40%。因此，在本次試驗(yàn)中馬來沉香莖段的最佳初代培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.7 mg/L+NAA0.1 mg/L。

2. 3 繼代培養(yǎng)

馬來沉香莖芽苗在不同濃度6-BA、NAA處理下的差異顯著，增殖系數(shù)為1.36～2.50，增殖系數(shù)最高的是2號處理，即6-BA0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L組合，其芽的增殖系數(shù)為2.50。因此，馬來沉香最佳增殖培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L。

2. 4 生根培養(yǎng)

由表4可知，馬來沉香的生根率偏低，且不同處理間差異顯著，單次培養(yǎng)法的生根率為10.32%～ ? 60.13%，且單次培養(yǎng)生根法的生根率普遍低于二次培養(yǎng)生根法，這與土沉香的組培生根情況相似。馬來沉香生根率最高的是11號處理，達(dá)到77.19%； ? 其次是12號處理，達(dá)到63.34%。因此，在本次試驗(yàn)中馬來沉香適宜采用二次培養(yǎng)生根法進(jìn)行生根培養(yǎng)，其最佳生根培養(yǎng)基為在1/2MS+IBA0.3 mg/L+ ?NAA2.0 mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，之后轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，生根率達(dá)到77.19%。

2. 5 煉苗與移栽

馬來沉香幼苗經(jīng)過馴化后移栽至珍珠巖：泥炭土（1∶1）的混合基質(zhì)中，在蔭棚內(nèi)進(jìn)行水肥管理。共移栽173株，成活127株，成活率73.41%。

3 結(jié)論與討論

3. 1 試驗(yàn)結(jié)果表明，1/2MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，馬來沉香在0.1% HgCl2處理下5 min能夠有效滅菌，啟動率達(dá)到70.49%，污染率降低至17.09%。最優(yōu)初代培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.7 mg/L+NAA0.1 mg/L；最優(yōu)繼代培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L，增殖系數(shù)達(dá)到2.5倍；最優(yōu)生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA

0.3 mg/L+NAA2.0 mg/L培養(yǎng)3天，轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，生根率達(dá)到77.19%。

3. 2 馬來沉香生根數(shù)量與根系質(zhì)量是其幼苗移栽成活率的決定性因素之一，生根培養(yǎng)時(shí)間短會導(dǎo)致根系數(shù)量少、質(zhì)量差，隨著生根培養(yǎng)時(shí)間的增長，馬來沉香頂端葉片及頂芽容易產(chǎn)生枯黃現(xiàn)象，生根培養(yǎng)基與培養(yǎng)時(shí)間的篩選仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3. 3 馬來沉香作為重要的藥用植物，沉香結(jié)香能力是重要的經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。有性繁殖難以保證其親本的遺傳特性，通過組織培養(yǎng)手段能夠有效降低子代的遺傳變異，為獲得優(yōu)良子代提供一種可行的技術(shù)手段。通過組織培養(yǎng)技術(shù)手段一方面能夠最大限度的保留其親本遺傳特性，另一方面又能為開發(fā)、利用提供充足的種質(zhì)資源。

參考文獻(xiàn)

［1］ Hasnida H N， Aziah M Y， Salbiah M， et al. Multiplication of ? shoots from in vitro germinated seedlings of Eurycoma longifolia and Aquilaria malaccensis.[C]// Tropical Forestry Research in the New Millennium： Meeting Demands & Challenges International Conference on Forestry & Forest Products Research Held in Kuala Lumpar. 2001.

［2］ Enghai L， Yahya A Z. The growth performance of plantation grown Aquilaria malaccensis in Peninsular Malaysia［J］. Journal of Tropical Forest Science， 1996， 12（8）： 34 - 39.

［3］ Lok E H， Zuhaidi Y A. Silviculture and management of Karas ?（Aquilaria Malaccensis） as plantation species［J］. Tapping the Wealth from Karas Tree，2013.

［4］ 黃瑋婷， ?孔凡芹， ?王海燕， ?等. ?沉香屬植物繁殖研究進(jìn)展［J］.世界林業(yè)研究， ?2017， 30（1）： 44 - 48.

［5］ 李浚明. ?植物組織培養(yǎng)教程［M］. ?北京： ?北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社， ?2002.

［6］ 黃瑋婷， ?孔凡芹， ?王海燕， ?等. ?沉香屬植物繁殖研究進(jìn)展［J］.世界林業(yè)研究， ?2017， 30（1）： 44 - 48.

［7］ 汪騰越， ?周再知， ?裘珍飛， ?等. ?土沉香組織培養(yǎng)外植體消毒方法的研究［J］. ?中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)， ?2012， 32（3）： 44 - 48.

［8］ 廖建良， ?謝曉萍， ?曾令達(dá)， ?等. ?土沉香育苗技術(shù)研究［J］. ?江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， ?2013， 41（9）： 219 - 220.

［9］ 汪騰越. ?土沉香組織培養(yǎng)再生體系的研究［D］. ?北京： ?中國林業(yè)科學(xué)研究院， ?2012.

［10］ 蘭芹英， ?方春妍， ?何惠英， ?等. ?土沉香成熟胚的組織培養(yǎng)及植株再生［J］. ?基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， ?2001， 20（3）： 231 - 232.