童遠(yuǎn)武,董方,李艷莉,肖瑩

復(fù)發(fā)性阿弗他口腔潰瘍(recurrent aphthous ulcer,RAU)是與體液免疫有密切關(guān)系的口腔黏膜破損疾病,主要表現(xiàn)為口腔局部黏膜變紅、腫脹、發(fā)熱、疼痛,多可自愈,但反復(fù)出現(xiàn),影響患者進食、言語等[1-2]。各種因素(局部損傷、炎性反應(yīng)、營養(yǎng)不良、B族維生素缺乏等)導(dǎo)致的免疫功能損傷可引發(fā)該病,因此從免疫學(xué)角度分析RAU的相關(guān)致病因子有助于該疾病的預(yù)防與治療[3-7]。唾液腺外泌體是指存在于唾液中的直徑30～50 μm的細(xì)胞外囊泡,唾液外泌體可作為治療的藥物載體,唾液外泌體miRNA可作為潛在的口腔疾病標(biāo)志物[8-9]。已有研究證明[6],唾液外泌體miR-142-5p可介導(dǎo)獲得性中耳脂瘤的炎性免疫調(diào)節(jié)。叉頭轉(zhuǎn)錄蛋白O亞族3(FOXO3)在潰瘍性結(jié)腸炎中占據(jù)重要地位[5]?；趍iR-142-5p、FOXO3在免疫功能中發(fā)揮的不同作用,猜測二者可能在RAU患者中同樣發(fā)揮作用。因此,本研究通過檢測RAU唾液外泌體miR-142-5p、FOXO3表達水平,并分析其與患者免疫功能的關(guān)系,以期為RAU的預(yù)防和治療提供新的理論依據(jù),報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2019年12月—2021年12月三亞中心醫(yī)院/海南省第三人民醫(yī)院口腔科收治復(fù)發(fā)性阿弗他口腔潰瘍患者134例作為研究對象(觀察組), 其中男50例,女84例,年齡18～62(44.37± 5.27)歲。另選取同期健康志愿者134例作為健康對照組,男50例,女84例,年齡18～63(44.62±5.48)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(20191103),受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):符合復(fù)發(fā)性口腔潰瘍診斷標(biāo)準(zhǔn)[10];患者均配合取樣、治療、研究;患者6個月內(nèi)每2個月均復(fù)發(fā)超過1次,且患者就診時處于潰瘍期。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):存在顯著的心、肝、肺等器質(zhì)性改變;紅斑狼瘡等自身免疫性疾病,近1個月內(nèi)使用過免疫抑制劑;就診時潰瘍發(fā)作超過3 d;妊娠期、哺乳期女性。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 qPCR檢測miR-142-5p、FOXO3 mRNA水平:研究對象漱口后收集唾液標(biāo)本(舌頂上顎,唾液流入收集盒),唾液離心去除細(xì)胞等雜質(zhì),通過唾液外泌體試劑盒提取唾液外泌體(Norgen Biotek),低溫保存。提取唾液外泌體總RNA(TRIzol試劑),將適量RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA[miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司],使用miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]配置qPCR反應(yīng)體系,使用羅氏LightCycler480 Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR系統(tǒng)(Roche,型號:LightCycler480 Ⅱ)進行qPCR反應(yīng),反應(yīng)條件:95℃預(yù)處理2 min、95℃ 10 s、55℃ 15 s、72℃ 10 s,共40次循環(huán)。引物序列見表1。采用2-△△CT法定量miR-142-5p、FOXO3 mRNA水平,U6、GAPDH分別作為內(nèi)參。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2 Western-blot檢測唾液外泌體中FOXO3蛋白表達水平:提取唾液外泌體樣本中總蛋白,BCA試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度,行SDS凝膠電泳(LabYeah電泳儀,上海百賽生物公司),轉(zhuǎn)膜后封閉。添加一抗[FOXO3(abcam公司)1∶1 000、GAPDH(內(nèi)參),1∶5 000]孵育過夜清洗后加入山羊抗兔二抗(1∶5 000)。清洗3次后,使用Axygen凝膠成像系統(tǒng)(廣州科適特科學(xué)儀器公司)測定蛋白條帶灰度值,Image J分析蛋白質(zhì)灰度值。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞比例:晨起收集受試者空腹肘靜脈血10 ml于抗凝離心管中,離心后棄上清,-80℃保存待測。取上述抗凝血100 μl,加入相應(yīng)CD3-CY5、CD4-FITC、CD8-PE熒光標(biāo)記抗體各20 μl,避光孵育30 min,加入溶血素,混勻后離心,清洗2次后棄上清,PBS懸浮細(xì)胞,流式細(xì)胞儀(美國艾森公司,型號:NOVOCYTE3130)檢測CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞比例,并計算CD4+/CD8+比值。

1.3.4 疼痛評分、潰瘍面積評定:采用視覺模擬量表(VAS)[10]評定疼痛指數(shù),總分10分,評分越高,疼痛越重。鏡下用標(biāo)尺測量患者潰瘍最大直徑和垂直直徑(與最大直徑垂直),計算潰瘍面積(mm2)=最大直徑×垂直直徑。

2 結(jié) 果

2.1 2組miR-142-5p、FOXO3 mRNA水平比較 與健康對照組比較,觀察組患者唾液外泌體miR-142-5p水平升高(P<0.01),FOXO3 mRNA、蛋白水平降低(P<0.01),見表2、圖1。

圖1 健康對照組與觀察組唾液外泌體FOXO3蛋白水平比較

表2 健康對照組與觀察組唾液外泌體miR-142-5p、FOXO3 mRNA水平比較

2.2 2組免疫指標(biāo)比較 與健康對照組比較,觀察組患者外周血CD3+CD4+、CD4+/CD8+細(xì)胞比值下降(P<0.01),外周血CD3+CD8+細(xì)胞比例升高(P<0.01),見表3。

表3 健康對照組與觀察組外周血免疫指標(biāo)水平比較

2.3 觀察組患者不同亞組間疼痛指數(shù)、潰瘍面積比較 將觀察組患者唾液外泌體miR-142-5p、FOXO3 mRNA分別按照均數(shù)2.35、0.35分組,miR-142-5p≥2.35為高表達亞組82例,<2.35為低表達亞組52例;FOXO3≥0.35為高表達亞組55例,<0.35為低表達亞組79例。與miR-142-5p低表達亞組比較,miR-142-5p高表達亞組患者疼痛指數(shù)升高、潰瘍面積增大(P<0.01)。與FOXO3高表達亞組比較,FOXO3低表達亞組患者疼痛指數(shù)、潰瘍面積升高(P<0.01),見表4。

表4 不同 miR-142-5p、FOXO3 mRNA水平患者疼痛指數(shù)、潰瘍面積比較

2.4 唾液外泌體miR-142-5p、FOXO3 mRNA與免疫指標(biāo)相關(guān)性分析 觀察組患者唾液外泌體miR-142-5p與CD3+CD4+、CD4+/CD8+細(xì)胞比值均呈負(fù)相關(guān)(P均<0.01),FOXO3 mRNA與CD3+CD4+、CD4+/CD8+細(xì)胞比值均呈正相關(guān)(P均<0.01),患者miR-142-5p、FOXO3與CD3+CD8+細(xì)胞比例均無相關(guān)性(P>0.05),而miR-142-5p與FOXO3呈負(fù)相關(guān)(r=-0.368,P<0.001),見表5。

表5 復(fù)發(fā)性阿弗他口腔潰瘍患者唾液外泌體miR-142-5p、FOXO3 mRNA與CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+的相關(guān)性

2.5 miR-142-5p、FOXO3 mRNA表達水平預(yù)測RAU復(fù)發(fā)的價值 繪制ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示,miR-142-5p、FOXO3 mRNA及二者聯(lián)合預(yù)測RAU復(fù)發(fā)的AUC分別為 0.810、0.809、0.947,二者聯(lián)合檢測優(yōu)于各自單獨預(yù)測效能(Z=6.528、8.573,P均<0.001),見表6、圖2。

圖2 miR-142-5p、FOXO3 mRNA表達水平預(yù)測RAU復(fù)發(fā)的ROC曲線

表6 miR-142-5p、FOXO3 mRNA表達水平預(yù)測RAU復(fù)發(fā)的價值比較

3 討 論

RAU主要是以口腔黏膜反復(fù)破損為表現(xiàn)的深層次潰瘍,臨床上分為輕型潰瘍、腺周口創(chuàng)和皰疹樣潰瘍[1]。根據(jù)最新統(tǒng)計資料顯示,全球有25%的人曾經(jīng)發(fā)生過口腔潰瘍[2]。RAU的誘發(fā)因素具有復(fù)雜性和多樣性特點,其中研究發(fā)現(xiàn)機體免疫反應(yīng)在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)病機制中占據(jù)重要地位[3]。研究表明[3-4],在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍病理組織中,促炎性細(xì)胞因子IL-2、IL-12、TNF-α和IFN-γ處于高表達,同時炎性因子抑制劑TGF-β和IL-10低表達,說明炎性因子的分泌失衡是造成此疾病的誘發(fā)因素之一;研究顯示,CD4+細(xì)胞與復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)病具有密切相關(guān)性[4];另有研究提示,潰瘍前期、潰瘍發(fā)作期與間歇期T淋巴細(xì)胞亞群均有顯著變化,介導(dǎo)患者的免疫應(yīng)答,最終導(dǎo)致口腔黏膜的持續(xù)炎性反應(yīng)[6];在人體遇刺激引發(fā)免疫損傷時,機體內(nèi)CD4+細(xì)胞比例下降,而CD8+占比升高,CD4+/CD8+比值降低,兩者的比值可顯示患者免疫力損傷嚴(yán)重程度[3]。因此,早期發(fā)現(xiàn)患者體液中異常的免疫反應(yīng),成為及時干預(yù)和早期治療RAU的關(guān)鍵。

目前,針對口腔類疾病診斷的方法越來越多,如液基細(xì)胞學(xué)檢測、組織病理學(xué)檢測等,但是上述診斷方式的有創(chuàng)性,常會引起患者和家屬的排斥。唾液是口腔疾病輔助性診斷體液,留取樣本方便,唾液的蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)研究提高了口腔疾病的診斷水平,因此通過無創(chuàng)或微創(chuàng)采集患者唾液標(biāo)本進行相關(guān)檢測和診斷,成為目前臨床診療中最常用的方式。唾液中的外泌體不僅可以作為治療的藥物載體,同時唾液外泌體miRNA可作為潛在的口腔疾病標(biāo)志物[8-9],通過檢測唾液外泌體的差異性尋找疾病發(fā)生、發(fā)展的內(nèi)在機制已成為學(xué)術(shù)界新的熱點?；谝陨嫌^點,本研究以唾液外泌體標(biāo)本中差異性表達的miRNAs為切入點,聚焦外泌體miR-142-5p和FOXO3的表達與RAU患者體液免疫之間的相關(guān)性。既往類似研究發(fā)現(xiàn),在癌癥、免疫相關(guān)疾病患者的活檢組織中miR-142-5p呈過度表達[11-13]。Han等[14]研究顯示,miR-142-5p在排斥反應(yīng)免疫應(yīng)答中上調(diào)。李媛等[8]研究顯示,miR-142-5p可在體外直接影響CD4+T細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞發(fā)育,促進IL-17的產(chǎn)生,大鼠組織炎性因子水平升高,促進自身免疫性葡萄膜炎進展。本研究結(jié)果顯示,RAU患者中唾液外泌體miR-142-5p水平顯著高于健康對照組人群,這與以上研究結(jié)果一致,因此從側(cè)面證實了miR-142-5p正向參與患者細(xì)胞免疫的調(diào)控。

FOXO3屬于FOXO家族,同樣在機體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,在FOXO3缺乏的T細(xì)胞中,Th17細(xì)胞比例明顯上調(diào)[15]。閔敏[16]研究顯示,FOXO3在潰瘍性結(jié)腸炎中可被miR-155下調(diào),調(diào)節(jié)IL-8參與潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜炎性反應(yīng)的發(fā)展。而潰瘍性結(jié)腸炎屬于非特異性炎性疾病,易反復(fù)發(fā)作,可能與免疫功能失常有關(guān),這與復(fù)發(fā)性口腔潰瘍有部分病因、發(fā)病機制重合,且復(fù)發(fā)性口腔潰瘍發(fā)生幾率高于潰瘍性結(jié)腸炎。本試驗研究結(jié)果顯示,RAU唾液外泌體中FOXO3 mRNA與蛋白表達水平顯著低于健康對照組,與CD3+CD4+、CD4+/CD8+細(xì)胞比值呈正相關(guān),說明FOXO3負(fù)向參與RAU中機體的免疫反應(yīng),筆者查閱以往的生物信息學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)[8,17-20],FOXO3是miR-142-5p的靶基因,兩者存在結(jié)合位點,miR-142-5p可調(diào)控FOXO3參與自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)展。本試驗結(jié)果提示,RAU患者免疫調(diào)節(jié)中miR-142-5p過表達,但FOXO3表達顯著降低,因此提示在RAU患者中miR-142-5p過表達可達抑制FOXO3的表達,唾液外泌體miR-142-5p和FOXO3存在負(fù)相關(guān)調(diào)控,兩者共同參與RAU免疫失常,但其具體調(diào)控機制仍需進一步試驗得出相關(guān)數(shù)據(jù)。

本試驗還研究了miR-142-5p、FOXO3 mRNA表達水平與患者疼痛指數(shù)、潰瘍面積的影響,結(jié)果顯示,當(dāng)miR-142-5p表達高于平均值時,患者的疼痛加劇,且潰瘍的面積明顯增大;當(dāng)FOXO3處于低表達時,會出現(xiàn)相同的表現(xiàn),這從側(cè)面表明miR-142-5p與FOXO3共同參與了RAU的免疫失常,并與其表達量成一定的關(guān)系,本試驗并未進行相關(guān)深入研究,未來會進行相關(guān)性定量分析。

綜上所述,復(fù)發(fā)性阿弗他口腔潰瘍患者唾液外泌體miR-142-5p/FOXO3分子作用靶點共同參與對RAU的免疫調(diào)控,其中miR-142-5p為正向調(diào)控,FOXO3為負(fù)向調(diào)控,同時關(guān)于兩者的表達定量對RAU患者的影響需要進一步深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

童遠(yuǎn)武:設(shè)計研究方案,實施研究過程,論文撰寫,論文審核;董芳、李艷莉:分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;肖瑩:資料搜集整理,分析試驗數(shù)據(jù),論文修改