趙會納　雷波　程立銳　余婧　蔣彩虹　劉旦　楊愛國　王兵　余世洲

摘要：為研究煙草葉寬性狀調(diào)控的遺傳規(guī)律，定位其主效 QTL 位點(diǎn)，利用煙草 SNP 芯片對構(gòu)建的重組自交系（Recombinant Inbred Lines， RILs ）群體（小黃金1025×Beinhart1000-1）進(jìn)行基因分型，并使用 IciMapping 4.2軟件的 ICIM-ADD 方法在全基因組范圍內(nèi)定位到6個與葉寬性狀相關(guān)的 QTL ，分別位于2、4、9、13、17和20號連鎖群上，可以解釋2.9%～36.8%的表型遺傳變異；其中 qMLW20-1可解釋36.8%的表型變異，為主效基因。以 K326為輪回親本、Samsun 為主效基因 qMLW20-1供體親本構(gòu)建染色體片段代換系評估煙草葉寬主效 QTL 的遺傳效應(yīng)，結(jié)果表明，導(dǎo)入 qMLW20-1主效基因能顯著提高煙葉葉寬，其中 G3材料顯著提高了煙葉鉀含量，感官質(zhì)量等其他重要性狀與對照無顯著性差異，未攜帶不良性狀基因，具有較好的育種利用價值。研究結(jié)果為克隆葉寬性狀主效基因和進(jìn)行分子改良奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：葉寬；重組自交系；染色體片段代換系； QTL；育種評價

中圖分類號： S572.03?????????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A?????????? 文章編號：1007-5119（2023）01-0001-07

Identification of Major-effect QTLs Associated with Leaf Width of Tobacco and Breeding Evaluation

ZHAO Huina1， LEI Bo1， CHENG Lirui2， YU Jing1， JIANG Caihong2， LIU Dan1，YANG Aiguo2， WANG Bing1， YU Shizhou1*

（1. Guizhou Academy of Tobacco Science， Molecular Genetics Key Laboratory of China Tobacco， Guiyang 550081， China;

2. Tobacco Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Key Laboratory of Tobacco Gene Resources， Qingdao266101， China）

Abstract： In order to study the genetic regulation of leaf width traits in tobacco， to locate the dominant QTL loci and promote the breeding of tobacco varieties， the recombinant inbred lines （RILs） population （Xiaohuangjin 1025×Beinhart1000-1） was genotyped using a tobacco SNP chip. The ICIM-ADD method of IciMapping 4.2 software was used to identify six QTLs related to leaf width traits in the whole genome， which were located in groups 2， 4， 9， 13， 17 and 20， respectively and could explain 2.9% to 36.8% of the phenotypic? genetic? variation. qMLW20-1 accounted? for 36.8% of the? phenotypic? variation? and? was? the? major-effect? QTL. A chromosome fragment substitution line which using K326 as the transmutation parent and Samsun as the dominant gene qMLW20-1 donor parent was constructed to evaluate the genetic effect of the dominant gene QTL for leaf width in tobacco. The results showed that the introduction of qMLW20-1 as the dominant gene could significantly increase leaf width， and G3 significantly increased the potassium content in tobacco leaves. The sensory quality and other important characters had no significant difference? from the control， and no bad character genes were carried. The line has good breeding utilization value. The results laid a foundation for cloning and molecular improvement of the major gene of leaf width trait.

Keywords： leaf width; recombinant inbred lines; chromosome segment substitution lines; QTL; breeding evaluation

煙草是以收獲葉片為目的的經(jīng)濟(jì)作物，在國民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的新品種是現(xiàn)代育種的重要目標(biāo)[1-3]。煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)與株高、葉片數(shù)、葉形、葉長和葉寬等諸多農(nóng)藝性狀相關(guān)，受多基因控制及環(huán)境的影響，遺傳機(jī)制較為復(fù)雜[4-5]，其中葉寬是重要農(nóng)藝性狀之一，直接影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[6]。

遺傳分析表明，煙草葉寬受2～3個主效基因+多基因控制[4]，主效基因遺傳率約為60.61%～90.17%[5]，且各基因間主要以加性效應(yīng)為主。童治軍等[7]利用 QTL 定位的方法在207個株系組成的烤煙 DH 群體中定位到了12個與葉寬相關(guān)的 QTL，分別分布在第4、5、7、14、17、22、24號連鎖群，同時在262個 F6株系的重組自交系群體（RILs）中定位到了4個與葉寬相關(guān)的 QTL，分布在第4、17、22、24號連鎖群[8]。李茜[9]用紅花大金元和 SWU109構(gòu)建了 F2群體，定位獲得4個與葉寬相關(guān)的 QTL，分布在第1、17、23號連鎖群。這些研究為解決當(dāng)前煙葉開片不充分問題，提供了分子輔助選擇標(biāo)記，確定了主效基因所在區(qū)間范圍，但存在獲得的主效基因區(qū)間范圍較大（>3.5 cM ），遺傳率相對較低（<20.30%）等問題，限制了葉寬性狀相關(guān)基因的挖掘及在育種中的進(jìn)一步利用。

相比 F2、BC 群體等雙親遺傳群體，重組自交系（Recombinant Inbred Lines， RILs）和染色體片段代換系（Chromosome Segment Substitution Lines ， CSSLs）因其群體基因型純合，是進(jìn)行基因定位的理想群體材料。特別是 CSSLs 群體，因僅將受體親本染色體的部分片段替換成為供體親本的染色體片段，遺傳背景明確，QTL 定位、遺傳效應(yīng)分析和功能基因定位結(jié)果相對準(zhǔn)確，已在水稻、玉米、小麥等作物重要性狀基因定位研究上廣泛應(yīng)用[10-13]。

本研究以小黃金1025為母本（窄葉材料）， Beinhar1000-1為父本（寬葉材料），構(gòu)建了基于雙親雜交的重組自交系（F10），對煙草葉寬性狀進(jìn)行全基因組 QTL 定位，發(fā)掘控制煙草葉寬的主效位點(diǎn)。同時選擇普通煙草栽培品種 K326為輪回親本，香料煙 Samsun 為供體親本，構(gòu)建染色體片段代換系（BC4F3），評價主效 QTL 的遺傳效應(yīng)和育種價值，為進(jìn)一步定位和克隆相關(guān)基因，開展煙草重要農(nóng)藝性狀分子改良提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

以窄葉煙草品種小黃金1025為母本（P1），寬葉煙草品種 Beinhar1000-1為父本（P2），雜交獲得 F1，進(jìn)而利用單粒傳法繁育9代，獲得重組自交系群體（F10代）209份，用于 QTL 定位分析試驗(yàn)。以普通煙草栽培品種 K326（G1，窄葉親本）為輪回親本，以香料煙 Samsun（寬葉親本）為供體親本，配置雜交組合，進(jìn)而連續(xù)回交和自交，獲得 BC4F3群體。在 QTL 定位分析試驗(yàn)結(jié)果上，篩選攜帶和不攜帶葉寬主效位點(diǎn) QTL 的染色體片段代換系材料11份（G2～G12），用于遺傳效應(yīng)評價試驗(yàn)，其中 G3、G6、G7、G8和 G11為攜帶葉寬主效位點(diǎn) QTL 的導(dǎo)入系材料， G2、G4、G5、G9、G10和 G12為不攜帶主效位點(diǎn) QTL 的導(dǎo)入系材料，上述材料及對應(yīng)的基因分型數(shù)據(jù)均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計 QTL 定位分析試驗(yàn)：2020年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所諸城試驗(yàn)基地種植209份重組自交系及親本材料進(jìn)行葉寬表型分析和 QTL 定位分析，每個材料設(shè)2個重復(fù)，每個重復(fù)種植10株，株距50 cm ，行距120 cm ，中心花開放50%打頂，留葉19片，于成熟期測量第10葉位葉寬，其他栽培管理按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)措施進(jìn)行。

遺傳效應(yīng)評價試驗(yàn)：2021年在貴州省煙草科學(xué)研究院平壩基地開展葉寬主效位點(diǎn) qMLW20-1的遺傳效應(yīng)評價試驗(yàn)，參試材料為染色體片段代換系材料11份（G2～G12）及 K326（G1，對照），試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，每個材料種植4行，每行20株，3次重復(fù)，50%中心花開放打頂，留葉19片，測量各葉位葉寬，調(diào)查自然條件下花葉病毒病、白粉病、氣候性斑點(diǎn)病發(fā)病率。正常成熟采收和烘烤，取各材料中部（C3F）和上部（B2F）煙葉進(jìn)行主要化學(xué)成分和物理特性測定及感官質(zhì)量評價。其他栽培管理按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)措施進(jìn)行。

1.2.2項(xiàng)目調(diào)查與測定（1）葉寬測定。各材料每重復(fù)選擇生長相對一致的5株煙株，于各葉位煙葉成熟期，測量葉寬數(shù)據(jù)，取所測株煙平均值，測量方法參照 YC/T 142—2010進(jìn)行。

（2）病害調(diào)查。在大田自然發(fā)病情況下，調(diào)查遺傳效應(yīng)評價試驗(yàn)各材料花葉病毒病、白粉病、氣候性斑點(diǎn)病發(fā)病率，發(fā)病率（%）=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%，取3個重復(fù)平均值，調(diào)查方法參照 GB/T 23222—2008進(jìn)行。

（3）主要化學(xué)成分及物理特性測定。煙堿、糖、總氮、鉀、氯含量分別依據(jù) YC/T 160—2002、YC/T 159—2019、YC/T 161—2002、YC/T 217—2007和 YC/T 162—2011測定。單葉質(zhì)量、含梗率、葉面密度依據(jù) YC/T 142—2010測定。

（4）感官質(zhì)量評價。感官質(zhì)量評價以 YC/T 138—1998為基礎(chǔ)進(jìn)行評價。評價指標(biāo)包括香氣質(zhì)（10分）、香氣量（10分）、吃味（12分）、雜氣（10分）、刺激性（10分）。

1.2.3 QTL 定位以小黃金1025、Beinhart1000-1及209個重組自交系群體為材料，利用430 K SNP 芯片鑒定基因型，進(jìn)而構(gòu)建的煙草高密度單核苷酸多態(tài)性（SNP）遺傳圖譜[14]，利用 QTL IciMapping4.2軟件的 ICIM-ADD 作圖方法對煙草葉寬性狀進(jìn)行 QTL 定位和遺傳分析[15]，利用費(fèi)希爾精確檢驗(yàn)（Fishers exact test）方法和生物信息學(xué)分析方法對定位獲得的主效基因進(jìn)行染色體片段代換系遺傳效應(yīng)分析和育種價值評價。

1.2.4 目標(biāo)位點(diǎn)導(dǎo)入情況鑒定根據(jù)初定位結(jié)果，確定與主效 QTL 緊密連鎖的 SNP 標(biāo)記，通過 Blastn 軟件將 SNP 分子標(biāo)記比對至紅花大金元參考基因組序列（煙草行業(yè)內(nèi)網(wǎng) IP ：http：//10.6.0.76），獲得 SNP 上下游300 bp 左右序列，進(jìn)而利用PCR 在不同雙親（K326和 Samsun）及不同 BC4F3導(dǎo)入系中擴(kuò)增目標(biāo)片段，利用一代 sanger 測序方法鑒定不同材料的基因型，確定目標(biāo) QTL 的導(dǎo)入情況。

1.2.5遺傳效應(yīng)分析利用 SPSS 16.0軟件對病害發(fā)病率進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，其中多重比較采用Duncan 法，并采用 SPSS 16.0軟件對主要化學(xué)成分、物理性狀和感官質(zhì)量得分進(jìn)行獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)。采用Excel 進(jìn)行重組自交系及雙親葉寬分布柱形圖及各葉位葉寬折線圖繪制；采用 GraphPad Prism 7.00軟件進(jìn)行控制葉寬主效位點(diǎn)所在染色體位置的 LOD 圖繪制。

2結(jié)果

2.1重組自交系群體及雙親葉寬性狀分析

各重組自交系和親本葉寬范圍及對應(yīng)的材料數(shù)量如圖1所示，親本Beinhart1000-1的葉寬為30.0～32.0 cm，小黃金1025為22.0～24.0 cm，兩者在葉寬性狀上存在明顯差異。同時重組自交系不同株系材料葉寬變幅為20.4～40.0 cm，平均為29.0 cm，呈現(xiàn)出連續(xù)性變異，部分自交系材料表現(xiàn)出超親優(yōu)勢，且有近50份超出寬葉親本 Beinhart1000-1，表明煙草葉寬性狀雖為典型數(shù)量性狀，但通過遺傳改良具有提高的潛力。

2.2葉寬性狀 QTL定位

如表1和圖2所示，對葉寬性狀進(jìn)行全基因組 QTL 定位，共檢測到6個 QTL，分別位于2、4、9、13、17和20號連鎖群上，命名為 qMLW2-1、 qMLW4-1、qMLW9-1、qMLW13-1、qMLW17-1和 qMLW20-1。位于20號連鎖群上的 qMLW20-1，處于標(biāo)記 bin20～186和 bin20～187之間，可解釋總表型變異的36.8%，為主效 QTL ，來源于親本 Beinhart1000-1；17號連鎖群上的 qMLW17-1，處于標(biāo)記 bin17～53和 bin17～54之間，可解釋總表型變異的13.6%，同樣來源于親本 Beinhart1000-1。此外，在2、4、9和13號連鎖群上還定位到4個微效QTL ，可解釋總表型變異的2.9%～4.5%，除 qMLW13-1外，其他3個微效 QTL 都來自于親本 Beinhart1000-1。篩選攜帶和不攜帶葉寬主效位點(diǎn) qMLW20-1的11份染色體片段代換系材料（G2～G12）進(jìn)行后續(xù)遺傳效應(yīng)評價試驗(yàn)。

2.3葉寬主效位點(diǎn) qMLW20-1遺傳效應(yīng)分析

2.3.1 葉寬主效位點(diǎn) qMLW20-1對葉寬性狀的影響染色體片段代換系各葉位葉寬如圖3所示，攜帶主效位點(diǎn) qMLW20-1的 G3、G6、G7、G8和 G11等5份材料各葉位葉寬均明顯大于對照 G1，而未攜帶主效位點(diǎn) qMLW20-1的 G2、G4、G5、G9、G10和 G12等6份材料的葉寬較 G1窄或相當(dāng)。表明導(dǎo)入葉寬主效基因 qMLW20-1顯著提高了煙葉葉寬。

2.3.2葉寬主效位點(diǎn) qMLW20-1對主要病害的影響各染色體片段代換系田間自然發(fā)病率見表3，攜帶葉寬主效位點(diǎn) qMLW20-1的5份材料中的 G3和 G8花葉病、白粉病和氣候斑發(fā)病率與對照 G1（K326）差異不顯著，但 G6、G7和 G11的白粉病發(fā)病率顯著的高于 G1；未攜帶葉寬主效位點(diǎn) qMLW20-1的6份材料中 G4、G5和 G12白粉病發(fā)病較輕，發(fā)病率顯著低于 G1，G10氣候斑點(diǎn)病發(fā)病率顯著高于 G1。

2.3.3葉寬主效位點(diǎn) qMLW20-1對煙葉主要化學(xué)成分的影響由于大部分染色體片段代換系材料烤后煙葉質(zhì)量較差，綜合葉寬性狀、田間自然發(fā)病率， G3表現(xiàn)相對最好，本研究僅對 G3的品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行了分析。G3主要化學(xué)成分見表4，攜帶葉寬主效位點(diǎn) qMLW20-1的染色體片段代換系材料 G3的中部葉糖含量顯著低于對照 G1（K326），鉀含量顯著高于 G1，煙堿和總氮含量與 G1無顯著差異。G3的上部葉煙堿含量顯著低于 G1，其余指標(biāo)與 G1差異均不顯著。

2.3.4葉寬主效位點(diǎn) qMLW20-1對煙葉主要物理特性的影響從表5可以看出， G3中部葉和上部葉的單葉質(zhì)量、含梗率、葉面密度與對照 G1（K326）均無顯著差異。

2.3.5葉寬主效位點(diǎn) qMLW20-1對煙葉感官質(zhì)量的影響 G3株系感官質(zhì)量評價結(jié)果見表6，G3中部葉香氣量和刺激性略好于 G1，吃味稍低于 G1，其余指標(biāo)與 G1相當(dāng)，但均無顯著性差異；上部葉的吃味、雜氣和總分略低于 G1，但無顯著性差異。導(dǎo)入了葉寬主效等位基因 qMLW20-1的染色體片段代換材料 G3，與對照 K326相比，顯著提高了煙葉葉寬和中部葉的鉀含量，顯著降低了中部葉糖含量和上部葉煙堿含量，對田間自然發(fā)病率、主要物理性狀和感官質(zhì)量無顯著影響。說明葉寬主效等位基因 qMLW20-1除提高煙葉葉寬性狀外，未攜帶不良性狀基因，對育種上改善葉寬性狀具有一定價值。

3討論

葉寬性狀作為復(fù)雜數(shù)量性狀，目前已篩選獲得了相關(guān)分子標(biāo)記和 QTL[7-9]，但定位精度不高且缺乏田間驗(yàn)證和評價。本研究利用群體基因型純合的染色體片段代換系材料，對定位到的主效 QTL 進(jìn)行了遺傳效應(yīng)分析和育種價值評價。本研究定位到的葉寬 QTL 位點(diǎn) qMLW17-1位置與童治軍等[7-8]報道中位于17號的 QTL 相近，可能為相同的 QTL 。另外，本研究定位到的葉寬相關(guān) QTL 位點(diǎn) qMLW20-1，來源于親本Beinhart1000-1，可解釋36.8%的表型遺傳變異，為新發(fā)現(xiàn)的控制葉寬的主效 QTL。這表明隨著群體材料遺傳背景的改變，控制葉寬的非等位主效位點(diǎn)可能也存在差異。因此針對葉寬等復(fù)雜數(shù)量性狀，可以利用不同遺傳材料，發(fā)掘盡可能多的非等位主效位點(diǎn)，開發(fā)相應(yīng)緊密連鎖的分子標(biāo)記，開展分子標(biāo)記輔助聚合改良。

本研究中，攜帶 qMLW20-1葉寬基因染色體片段代換系材料的平均葉寬較對照 K326顯著增加，推測該主效 QTL 在葉寬性狀中起到重要作用，田間種植的片段代換系材料的葉寬表型也證實(shí)了這一點(diǎn)。研究還比較了一個導(dǎo)入 qMLW20-1位點(diǎn)的代換系材料對其他重要性狀的影響，發(fā)現(xiàn)除顯著增加葉寬性狀外，其他性狀如抗性、物理性狀、感官質(zhì)量等與對照 K326差異不顯著，推測 qMLW20-1位點(diǎn)未攜帶其他重要不良性狀，對煙草葉寬性狀遺傳改良起重要作用，具有較大的育種利用價值。

目前改良煙草葉寬性狀的主要手段依舊依靠常規(guī)育種方法，但存在兩個突出問題[16]：一是傳統(tǒng)育種方法主要基于表型進(jìn)行選擇，易受環(huán)境影響，尤其是對于復(fù)雜的數(shù)量性狀選擇準(zhǔn)確度差；二是傳統(tǒng)育種方法具有很大的盲目性和不可預(yù)測性，最終的育種效率不到百萬分之一，選擇效率不高。本研究在 K326的遺傳背景下，定位到 qMLW20-1位點(diǎn)可以解釋36.8%的表型遺傳變異，為利用分子標(biāo)記輔助改良 K326品種提供了一種有效策略。今后，在此定位基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)掘該主效 QTL 的相關(guān)的候選基因，明確其遺傳分子機(jī)制，對植物葉片發(fā)育的分子機(jī)制解析及葉寬性狀改良具有重要意義。

4結(jié)論

結(jié)果表明，基于重組自交系群體定位到6個與煙草葉寬相關(guān)的 QTL，其中包括兩個主效位點(diǎn)；利用染色體片段代換系材料對煙草葉寬主效位點(diǎn) qMLW20-1進(jìn)行了遺傳效應(yīng)和育種價值評價，表明該位點(diǎn)在煙草葉寬性狀定向改良育種中有較大利用價值。

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