櫻桃番茄美小紅雜交種子純度的InDel標(biāo)記鑒定

蘇曉梅 李靜 劉淑梅 呂宏君 王施慧 侯麗霞

摘 ? ?要：為準(zhǔn)確高效地鑒定番茄雜交種純度，以美小紅及其父母本為試驗(yàn)材料，從48對(duì)核心InDel標(biāo)記中挑選3對(duì)在雙親中具有明顯差異且條帶清晰的InDel標(biāo)記，對(duì)100個(gè)美小紅單株進(jìn)行純度檢測(cè)，并與田間調(diào)查結(jié)果相比較。結(jié)果表明，在3對(duì)分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果中，100個(gè)雜交種單株中有98個(gè)表現(xiàn)為父母本雙親互補(bǔ)的共顯性條帶，2個(gè)單株表現(xiàn)為母本類型的條帶，種子純度為98%，上述結(jié)果與大田鑒定結(jié)果高度一致。因此，利用該方法可準(zhǔn)確高效地檢測(cè)雜交種純度，節(jié)約檢測(cè)成本，縮短檢測(cè)時(shí)間。

關(guān)鍵詞：番茄；美小紅；雜交種；InDel標(biāo)記；純度鑒定

中圖分類號(hào)：S641.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2023）06-028-04

Identification of hybrid purity of new tomato variety Meixiaohong by using InDel markers

SU Xiaomei1， LI Jing1，2， LIU Shumei1， L? Hongjun1， WANG Shihui1， HOU Lixia1

（1. Shandong Province Key Laboratory for Biology of Greenhouse Vegetables/Shandong Branch of National Improvement Center for Vegetables/Institute of Vegetables， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， Shandong， China; 2. College of Horticulture， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

Abstract： In order to identify the purity of tomato hybrid seeds accurately and efficiently， Meixiaohong and their parental inbred lines were used to detect the primers polymorphism. From 48 pairs core InDel markers， 3 pairs with clear bands and significant difference in both parents were selected to identify the purity of 100 Meixiaohong individual plants， then compared with the result of field investigation. The identification results were completely consistent by 3 InDel markers. Of the 100 Meixiaohong individuals， 98 plants were amplified the codominant bands of parental inbred lines and 2 plants were amplified the same band as the female parent. Therefore， the seed purity of 'Meixiaohong' reached 98%， which were highly consistent with the result obtained in the field investigation. This method can be used to identify the hybrids purity accurately and quickly， which saves the cost and time greatly.

Key words： Tomato; Meixiaohong; Hybrid; InDel markers; Purity identification

番茄是世界上重要的蔬菜作物，每年全球總產(chǎn)量1.7億t，在蔬菜作物中產(chǎn)量位居首位[1]。番茄種子是全球銷售額最大的蔬菜作物種子，也是國際上競(jìng)爭最激烈的種子產(chǎn)業(yè)之一。我國是番茄生產(chǎn)大國，產(chǎn)量占全球的三分之一，也是世界上最大的番茄種子市場(chǎng)。目前，生產(chǎn)中的番茄品種大多數(shù)為雜交種，然而在其制種過程中，常會(huì)由于去雄不徹底、昆蟲傳粉以及機(jī)械混雜等使得雜交種子純度降低，從而影響番茄產(chǎn)量或品質(zhì)，對(duì)生產(chǎn)造成一定損失。雜交種純度作為衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，越來越受到種子生產(chǎn)單位和種植戶的重視。生產(chǎn)中為保證雜交種質(zhì)量，在種子銷售之前需要對(duì)其純度進(jìn)行鑒定，因此，建立一種高效、準(zhǔn)確的雜交種純度鑒定方法至關(guān)重要[2]。

傳統(tǒng)的雜交種純度鑒定以田間表型調(diào)查為主。這種方法工作量大、易受種植環(huán)境影響且鑒定周期較長，往往需要經(jīng)過一個(gè)完整的生長發(fā)育期，從而造成種子銷售滯后，甚至?xí)e(cuò)過銷售旺季。近年來，隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步，以DNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)迅猛發(fā)展，農(nóng)作物雜交種純度的室內(nèi)分子標(biāo)記鑒定技術(shù)得到快速發(fā)展。DNA分子標(biāo)記技術(shù)已成熟應(yīng)用于番茄[3]、辣椒[4]、茄子[5]、黃瓜[6]、西瓜[7]、甜瓜[8]、大白菜[9]、甘藍(lán)[10]和蘿卜[11]等多種蔬菜的雜交種純度鑒定。

美小紅是山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所番茄課題組選育的優(yōu)質(zhì)櫻桃番茄新品種。2022年完成非主要農(nóng)作物品種登記[GPD番茄（2022）370116]。該品種果實(shí)為亮紅色卵圓形，口感好，可溶性固形物含量（w）9.5%以上，綜合抗性強(qiáng)，適宜在黃淮海及長江以北等地區(qū)設(shè)施內(nèi)推廣應(yīng)用。筆者選用100株美小紅及其父母本作為試驗(yàn)材料，篩選出3對(duì)InDel多態(tài)性引物用于美小紅雜交種純度鑒定。結(jié)合田間性狀調(diào)查結(jié)果，明確美小紅的雜交種種子純度。同時(shí)，建立高效穩(wěn)定的番茄雜交種純度分子鑒定技術(shù)體系，為其他番茄品種純度的快速鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用材料為櫻桃番茄美小紅雜交種及其父母本。2022年2月在山東省濟(jì)南市歷城區(qū)唐王育苗基地育苗，其間正常管理。當(dāng)番茄幼苗生長發(fā)育至6葉1心時(shí)，移至日光溫室進(jìn)行定植。定植后對(duì)所有單株進(jìn)行編號(hào)掛牌，便于后續(xù)的分子標(biāo)記鑒定和田間表型調(diào)查。

1.2 番茄基因組DNA提取

采用快速法提取番茄基因組DNA。美小紅雜交種及其父母本定植后，隨機(jī)選取父母本各5株，取其幼嫩葉片，獲得父母本各自的混合樣品進(jìn)行DNA提取。對(duì)于雜交種單株，按照田間編號(hào)，取其幼嫩葉片進(jìn)行DNA提取。具體操作步驟如下：將樣品置于2 mL離心管中并加2粒鋯珠，加入500 μL提取液（稱取12.1 g Tris，28.1 g NaCl，18.6 g EDTA，加水溶解并定容至1 L），于自動(dòng)研磨儀上研磨2 min，然后12 000 r·min-1離心8 min，吸取400 μL上清液至1.5 mL離心管，加等體積異丙醇（或2倍體積冰乙醇）沉淀，-20 ℃放置30 min左右，離心5 min棄上清液，加入500 μL 75%乙醇清洗后倒掉乙醇，晾干后加100 μL ddH2O溶解。所有DNA模板于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 InDel標(biāo)記篩選

利用美小紅父母本DNA對(duì)48對(duì)InDel引物[12]進(jìn)行多態(tài)性篩選。PCR擴(kuò)增體系總體積為10 μL：DNA模板2 μL，2×Super Taq PCR Mix 5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.25 μL，ddH2O補(bǔ)充至10 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；16 ℃保存。PCR產(chǎn)物檢測(cè)：8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（180 V，2 h 30 min）分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染，觀察記錄擴(kuò)增結(jié)果。選擇父母本間擴(kuò)增條帶清晰、有差異且重復(fù)性好的引物，用于進(jìn)一步種子純度鑒定。

1.4 種子純度鑒定

以100個(gè)美小紅單株DNA和雙親DNA為模板，用篩選獲得的特異性InDel標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶，計(jì)算雜交種純度。雜交種純度/%=具有雙親互補(bǔ)條帶的樣本數(shù)/檢測(cè)的樣本數(shù)×100。

1.5 田間性狀調(diào)查鑒定

2022年3月底，將美小紅及其父母本在日光溫室定植。其中，美小紅種植100株，父母本各種12株，隨后進(jìn)行常規(guī)的田間管理，并在番茄生長發(fā)育不同時(shí)期進(jìn)行田間性狀調(diào)查。在果實(shí)成熟后，針對(duì)父母本和雜交種間的主要差異性狀，每隔7 d調(diào)查1次，共計(jì)調(diào)查3次，盡量避免環(huán)境因素和人為因素造成的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 美小紅純度鑒定的引物篩選

以美小紅父母本DNA為模板，對(duì)48對(duì)InDel引物進(jìn)行多態(tài)性篩選。結(jié)果顯示，48對(duì)引物中，25對(duì)引物在親本之間擴(kuò)增條帶不同，多態(tài)率為52.08%；21對(duì)引物在父母本之間擴(kuò)增出相同條帶，沒有多態(tài)性；還有2對(duì)引物未擴(kuò)增出明顯條帶。在25對(duì)多態(tài)性引物中，挑選不同染色體或相同染色體不同位置的在親本間具有明顯差異的3對(duì)標(biāo)記InDel-145（13）、InDel-242（25）和InDel-283（33），作為雜交種純度鑒定的引物（圖1，表1）。

2.2 美小紅種子純度的InDel標(biāo)記分析

利用上述篩選獲得的3對(duì)標(biāo)記InDel-145（13）、InDel-242（25）和InDel-283（33）對(duì)100個(gè)美小紅單株進(jìn)行分子標(biāo)記純度鑒定。如圖2所示，標(biāo)記InDel-145（圖2-a）、InDel-242（圖2-b）和InDel-283（圖2-c）鑒定結(jié)果一致，在100個(gè)F1雜交種單株中，田間單株編號(hào)43和56的2個(gè)樣本與母本（P1）帶型一樣，其余98個(gè)單株均為與父母本雙親互補(bǔ)的雜合帶型，表明該雜交種純度為98%。

2.3 田間農(nóng)藝性狀調(diào)查

在田間進(jìn)行農(nóng)藝性狀鑒定時(shí)，需要選擇在親本及雜交種中具有明顯差異的且不易受環(huán)境影響的性狀進(jìn)行區(qū)分鑒定。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于父本和美小紅雜交種，母本果實(shí)圓形，節(jié)間短，葉色深綠，葉裂深，此性狀可用于區(qū)分父母本和雜交種。調(diào)查上述100個(gè)美小紅單株發(fā)現(xiàn)98株農(nóng)藝性狀一致，果實(shí)表現(xiàn)為亮紅色卵圓形，而編號(hào)43和56的2個(gè)單株性狀與母本高度一致，果實(shí)為圓形。因此，田間調(diào)查顯示美小紅的種子純度為98%，該結(jié)果與3對(duì)InDel標(biāo)記鑒定結(jié)果吻合。

3 討論與結(jié)論

隨著我國番茄種子市場(chǎng)的規(guī)范化管理，番茄種子品質(zhì)也大幅提升。種子純度是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，種子純度鑒定是種子生產(chǎn)銷售工作中不可缺少的重要步驟。高效準(zhǔn)確的雜交種純度檢測(cè)方法對(duì)進(jìn)一步提高種子質(zhì)量具有重要意義。近年來，以DNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)迅速發(fā)展，為農(nóng)作物品種純度鑒定提供了新的技術(shù)手段。在DNA分子標(biāo)記技術(shù)中，InDel標(biāo)記由于其多態(tài)性高、變異穩(wěn)定且檢測(cè)容易等優(yōu)點(diǎn)，在種質(zhì)資源親緣關(guān)系鑒定及雜交種純度鑒定等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)[13-15]。筆者選用的48對(duì)InDel標(biāo)記均勻分布于番茄12條染色體上，被制定為番茄品種鑒定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，已應(yīng)用于番茄種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析及番茄品種真實(shí)性鑒定[16]。研究表明，使用2～4對(duì)多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行雜交種純度鑒定，可以避免因單引物選擇不當(dāng)或其他異源雜種造成的誤差，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性[4，17]。在本研究篩選的多態(tài)性引物中，雖然第28、29、30、31號(hào)引物均在親本間表現(xiàn)多態(tài)且條帶清晰穩(wěn)定，但由于它們均位于11號(hào)染色體上，且遺傳連鎖較為緊密，因此在本試驗(yàn)中并沒有選擇這些標(biāo)記進(jìn)行種子純度鑒定。而InDel-242（25）和InDel-283（33）標(biāo)記同樣位于11號(hào)染色體上，但其遺傳距離較遠(yuǎn)，可以避免由標(biāo)記連鎖而導(dǎo)致的鑒定結(jié)果相同，從而提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

利用InDel分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行番茄雜交種的純度鑒定，可以替代田間形態(tài)學(xué)性狀鑒定法，具有較高的可信度。選用多態(tài)性好且穩(wěn)定的核心標(biāo)記有利于提高篩選效率，降低成本。本研究結(jié)果顯示，48對(duì)標(biāo)記雙親間多態(tài)性可達(dá)到52.08%，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，有利于雜交種的純度鑒定。筆者選用InDel-145（13）、InDel-242（25）和InDel-283（33）標(biāo)記對(duì)100個(gè)美小紅單株進(jìn)行純度檢測(cè)，最終結(jié)果與田間形態(tài)鑒定結(jié)果一致。因此，這3對(duì)標(biāo)記適于櫻桃番茄美小紅雜交種純度鑒定，可為其雜交種生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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