王 靜,熊 燕,梁 祥,宋建宇

(云南省漁業(yè)科學(xué)研究院,昆明 650051)

【研究意義】雜交鱘生長速度快,適應(yīng)性廣,抗病能力強,經(jīng)濟價值高,適宜規(guī)?；B(yǎng)殖[1]。但近年來隨著鱘魚養(yǎng)殖規(guī)模及產(chǎn)量的不斷擴大提升,各種疾病的暴發(fā)也愈加頻繁,嚴(yán)重制約了中國鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。海豚鏈球菌病是雜交鱘養(yǎng)殖的主要疾病之一,發(fā)病率高,流行范圍廣且周期長,危害嚴(yán)重,感染發(fā)病死亡率高達50%以上,對雜交鱘養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟損失巨大[2-4]。目前用于防治雜交鱘海豚鏈球菌病的藥物主要是抗生素及消毒劑等化學(xué)藥物,但長期使用此類藥物會產(chǎn)生水體生態(tài)失衡、病原菌耐藥性和藥物殘留等一系列問題[4-6],因此開發(fā)新的療效好且無藥物殘留的防治方法來防控水產(chǎn)養(yǎng)殖中的雜交鱘海豚鏈球菌病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展,水產(chǎn)養(yǎng)殖病害問題日益嚴(yán)重,疾病暴發(fā)頻繁,抗生素及消毒劑等化學(xué)藥物的過量或不當(dāng)使用引起一系列生態(tài)環(huán)境問題,造成經(jīng)濟損失,不利于綠色健康高效養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[7-9]。中藥成本低、綠色環(huán)保,用其防治魚類疾病無藥物殘留且有利于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害群體防治[10],是無公害養(yǎng)殖的首選藥物,目前已有學(xué)者開展了中草藥制劑防治海豚鏈球菌病的研究[11]。三黃散主要成分為黃苓、黃柏、大黃、大青葉,均具有廣譜抗菌效果。百優(yōu)酸主要由精選的有機酸、植物提取物、獨特透化劑和緩釋載體組成。【本研究切入點】現(xiàn)有的雜交鱘海豚鏈球菌病的防治藥物主要是抗生素及消毒劑等化學(xué)藥物,中草藥防治藥物相對較少。已有報道三黃散與百優(yōu)酸在一些細菌性疾病的預(yù)防治療中起重要作用,但對于雜交鱘海豚鏈球菌病的防治作用鮮有研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究將海豚鏈球菌人工感染健康雜交鱘致使其發(fā)病,再用三黃散與百優(yōu)酸的不同組合對發(fā)病雜交鱘進行治療,最后對治療結(jié)果進行綜合分析,為中藥治療雜交鱘海豚鏈球菌病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用海豚鏈球菌取自于云南省漁業(yè)科學(xué)研究院實驗室分離鑒定并保存的海豚鏈球菌菌株。健康雜交鱘[西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)(♀)×施氏鱘(Acipenserschrenckii)(♂)]來自云南省會澤縣鱘魚養(yǎng)殖場,規(guī)格為25 ～ 30 cm,(60+2) g,暫養(yǎng)2周后用于試驗。

主要試劑:腦心浸出液培養(yǎng)基購于北京威泰科生物技術(shù)有限公司;三黃散購于廣東華源生物科技有限公司;百優(yōu)酸購于百奧明飼料添加劑(中國)有限公司;Biosharp 4%多聚甲醛組織固定液購于云南恩馳科技有限公司;MS-222購于江蘇漁醫(yī)生水產(chǎn)科技有限公司;堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)等檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌液制備 將菌株接種于腦心浸出液培養(yǎng)基,28 ℃震蕩培養(yǎng)過夜,用0.85%無菌生理鹽水將其制備成菌懸液,再用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整細菌濃度。

1.2.2 人工感染及防治試驗 根據(jù)預(yù)試驗,細菌攻毒試驗選取濃度為1.2×105cfu/mL的海豚鏈球菌液(預(yù)試驗攻毒感染發(fā)病率為50%左右),注射劑量為0.2 mL/尾。

將健康雜交鱘分為5組,空白對照組、陽性對照組、三黃散組、百優(yōu)酸組、三黃散+百優(yōu)酸組,每組100尾?？瞻讓φ战M經(jīng)胸鰭基部注射0.85%無菌生理鹽水,0.2 mL/尾。其余4組分別經(jīng)胸鰭基部注射濃度為1.2×105cfu/mL的海豚鏈球菌液,注射劑量為0.2 mL/尾。試驗期間各組水池中連續(xù)充氧,水溫(19±1)℃,空白對照組與陽性對照組飼喂正常飼料,三黃散組飼喂0.5%三黃散餌料,百優(yōu)酸組飼喂0.1%百優(yōu)酸餌料,三黃散+百優(yōu)酸組飼喂0.5%三黃散+0.1%百優(yōu)酸餌料。每天需觀察各組雜交鱘的發(fā)病死亡情況,根據(jù)各組雜交鱘的死亡情況判斷治療效果,采組織樣的雜交鱘不計入死亡總數(shù)。

1.2.3 采樣及處理 攻毒后于第7、14、21、28和35天每個試驗組分別隨機取3尾魚,空白對照組同步取樣。用100 mg/L MS-222快速麻醉后,進行尾靜脈采血,血樣于4 ℃冰箱中靜置2 h后于4 ℃下3500 r/min離心10 min制備血清,上清液于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。攻毒組于發(fā)病高峰期每組各隨機取3尾魚用于采集肝、腸組織,組織樣品保存于4%多聚甲醛中用作制備病理切片。

1.2.4 血液生化指標(biāo)測定 用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定雜交鱘血清堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)的活力。其中AKP采用酶標(biāo)法測定,其余指標(biāo)皆采用比色法測定。

1.2.5 組織形態(tài)學(xué)分析 人工感染后10～20 d為發(fā)病高峰期,于第14天采集各攻毒組雜交鱘的肝、腸組織,用4%多聚甲醛組織固定液固定,制做石蠟組織切片,HE常規(guī)染色,并用光學(xué)顯微鏡觀察、拍照保存。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)用軟件Excel 2016 初步處理,再用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件中單因素方差分析和 Duncan’s多重比較法對試驗結(jié)果的差異顯著性進行分析處理,P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 攻毒后各處理組雜交鱘死亡率

人工感染后的第3天各攻毒組雜交鱘均開始出現(xiàn)無方向性竄游或離群沿池邊游動,第5天雜交鱘開始出現(xiàn)死亡,第35天各攻毒組雜交鱘均出現(xiàn)不同程度的死亡情況,其中陽性對照組死亡數(shù)最多,死亡率為54.6%;三黃散+百優(yōu)酸組死亡數(shù)最少,死亡率為19.6%;三黃散組和百優(yōu)酸組的死亡數(shù)均少于陽性對照組,死亡率分別為35.1%和32.0%(表1)。

表1 農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化的參與主體及主要職能

表1 各處理組雜交鱘的死亡率

表2 農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化主體基本統(tǒng)計特征

2.2 血液生化指標(biāo)測定結(jié)果

2.2.1 酸性磷酸酶(ACP)活力 在整個試驗期,人工感染海豚鏈球菌后各攻毒組雜交鱘血清ACP活力均先升高后降低,且各攻毒組的ACP活力都始終顯著(P<0.05)高于空白對照組。ACP活力各攻毒組均于第21天達到峰值,且陽性對照組顯著高于其余處理組,三黃散組與百優(yōu)酸組差異不顯著,但二者均顯著高于三黃散+百優(yōu)酸組(圖1)。

圖1 農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化利益分配機制的影響因素評價指標(biāo)體系

不同小寫字母表示不同處理組在同一時間點差異顯著(P<0.05),下同。

2.2.2 堿性磷酸酶(AKP)活力 在整個試驗期,人工感染海豚鏈球菌后各攻毒組雜交鱘血清AKP活力均先升高后緩慢降低,各攻毒組的AKP活力都始終顯著高于空白對照組。AKP活力各攻毒組均于第14天達到峰值,且在整個試驗期,陽性對照組均顯著高于其他處理組,三黃散組和百優(yōu)酸組均顯著高于三黃散+百優(yōu)酸組;百優(yōu)酸組在第0～21天顯著高于三黃散組,試驗后期二者的AKP水平差異不顯著(圖2)。

圖2 不同處理組雜交鱘血清AKP活力變化

2.2.3 溶菌酶(LZM)活力 在整個試驗期,人工感染海豚鏈球菌后各處理組雜交鱘血清溶菌酶(LZM)活力變化趨勢與AKP相似,呈先升高再緩慢降低的變化趨勢,且各攻毒組的LZM活力都始終顯著高于空白對照組的。LZM活力各攻毒組均于第14天達到峰值,且在整個試驗期,陽性對照組都顯著高于其他處理組,三黃散組和百優(yōu)酸組均顯著高于三黃散+百優(yōu)酸組,三黃散組與百優(yōu)酸組差異不顯著(圖3)。

圖3 不同處理組雜交鱘血清LZM活力變化

2.2.4 過氧化物酶(POD)活力 在整個試驗期,人工感染海豚鏈球菌后各攻毒組雜交鱘血清過氧化物酶(POD)活力均先降低后升高再緩慢降低,且都顯著高于空白對照組,其中POD活力陽性對照組均顯著高于其他組處理,三黃散組顯著高于百優(yōu)酸組,百優(yōu)酸組顯著高于三黃散+百優(yōu)酸組(圖4)。在第7天時,空白對照組的POD活力顯著高于各攻毒組,陽性對照組的POD活力顯著低于其他處理組,三黃散組和百優(yōu)酸組的POD活力顯著低于三黃散+百優(yōu)酸組,三黃散組與百優(yōu)酸組的POD活力差異不顯著。

圖4 不同處理組雜交鱘血清POD活力變化

2.2.5 超氧化物歧化酶(SOD)活力 在整個試驗期,人工感染海豚鏈球菌后各攻毒組雜交鱘血清超氧化物歧化酶(SOD)活力均先升高再緩慢降低,且各攻毒組的SOD活力都始終顯著高于空白對照組。其中,各攻毒組的SOD活力均于第14天達到峰值,且SOD活力陽性對照組都顯著高于其他處理組,三黃散組和百優(yōu)酸組均顯著高于三黃散+百優(yōu)酸組(圖5)。

圖5 不同處理組雜交鱘血清SOD活力變化

1:陽性對照組肝臟(20×10);2:陽性對照組腸(20×10);3:三黃散組肝臟(20×10);4:三黃散組腸(20×10);5:百優(yōu)酸組肝臟(20×10);6:百優(yōu)酸組腸(20×10);7:三黃散+百優(yōu)酸組肝臟(20×10);8:三黃散+百優(yōu)酸組腸(20×10)。

2.3 組織病理切片結(jié)果

雜交鱘感染海豚鏈球菌發(fā)病后內(nèi)臟的病理變化主要表現(xiàn)為肝細胞嚴(yán)重變性壞死,崩解,伴有大量炎癥細胞浸潤(圖6-1);腸粘膜受損嚴(yán)重,腸絨毛壞死脫落嚴(yán)重,伴有炎癥細胞浸潤(圖6-2)。三黃散組肝細胞廣泛空泡變性,伴有炎癥細胞浸潤(圖6-3);腸粘膜受損較嚴(yán)重,腸絨毛有壞死脫落,伴有炎癥細胞浸潤(圖6-4)。百優(yōu)酸組肝細胞廣泛空泡變性,伴有炎癥細胞浸潤(圖6-5);腸粘膜受損較嚴(yán)重,腸絨毛有壞死脫落,伴有炎癥細胞浸潤(圖6-6)。三黃散+百優(yōu)酸組肝細胞空泡變性,呈蜂窩狀(圖6-7);腸粘膜輕微損傷,腸絨毛受損,部分柱狀細胞和杯狀細胞出現(xiàn)壞死脫落,伴有炎癥細胞浸潤(圖6-8)。三黃散和百優(yōu)酸都能明顯地減輕患病魚的內(nèi)臟損傷,且二者聯(lián)用效果更好。

3 討 論

3.1 三黃散與百優(yōu)酸對患海豚鏈球菌病雜交鱘的治療效果

近年來,海豚鏈球菌已發(fā)展成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的一大殺手,給中國紅擬石首魚(Sciaenopsocellatus)[12]、斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[13-14]、羅非魚(Oreochromisspp.)[15]和鱘魚(Sturgeon)[2-6]等水產(chǎn)動物的養(yǎng)殖帶來了嚴(yán)重的損失。本研究使用海豚鏈球菌人工感染雜交鱘魚,導(dǎo)致其出現(xiàn)嘴部、肛門周圍充血出血,解剖后發(fā)現(xiàn)肝有出血點、腸道充血等癥狀,甚至高死亡率,與國內(nèi)外報道的患海豚鏈球菌病雜交鱘的主要癥狀相吻合[2-6,16]。在用三黃散與百優(yōu)酸對患海豚鏈球菌病的雜交鱘進行治療后發(fā)現(xiàn),各治療組的死亡率明顯低于陽性對照組的54.6%,其中三黃散組死亡率35.1%,百優(yōu)酸組死亡率32%,三黃散+百優(yōu)酸組死亡率最低為19.6%,說明三黃散和百優(yōu)酸都對雜交鱘海豚鏈球菌病具有一定的治療效果,且二者呈協(xié)同作用,聯(lián)合使用能更好地治療雜交鱘海豚鏈球菌病,大幅度降低其死亡率。

3.2 三黃散與百優(yōu)酸對患海豚鏈球菌病的雜交鱘血液生化指標(biāo)的影響

3.2.1 海豚鏈球菌對雜交鱘血液生化指標(biāo)的影響 酸性磷酸酶(ACP)是溶酶體的標(biāo)志酶,其活力代表巨噬細胞吞噬消化能力的強弱[17]。堿性磷酸酶(AKP)是機體代謝的重要調(diào)控酶,能增強病體對病原體的識別及吞噬能力,有助于提高雜交鱘的抗病力[18]。本研究發(fā)現(xiàn),人工感染海豚鏈球菌后雜交鱘血清ACP和AKP活力均先升高再降低,且各攻毒組的酶活力都始終顯著高于空白對照組,這與柒壯林等[19]報道海豚鏈球菌感染羅非魚的結(jié)果一致。據(jù)此推斷,海豚鏈球菌感染入侵雜交鱘機體后,血清ACP與AKP活性增高以提高雜交鱘吞噬能力,促使小顆粒細胞解體,達到快速清除病源的效果,后期隨著病原體的減少與機體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié),ACP與AKP活性緩慢降低。

溶菌酶(LZM)是一種存在于血液和粘液中能水解致病菌的堿性酶,由巨噬細胞和嗜中性粒細胞產(chǎn)生并分泌,主要作用于革蘭氏陽性菌,能增強魚體的抗病能力[20]。機體溶菌酶活性的提高能加強其溶菌作用,提高機體免疫力[21]。本研究中人工感染海豚鏈球菌后雜交鱘血清LZM活力先升高再降低,且各攻毒組的酶活力均始終顯著高于空白對照組,有報道發(fā)現(xiàn),鯽感染嗜水氣單胞菌后血清LZM活力也先升高后下降[22]。據(jù)此推測,雜交鱘感染海豚鏈球菌后魚體產(chǎn)生了急性應(yīng)激反應(yīng),其通過增加溶菌酶水平來增強機體的免疫力[20],抵抗病原菌的侵襲,隨著病原體的減少,后期LZM活性緩慢降低。

機體抗氧化系統(tǒng)的重要成員超氧化物歧化酶(SOD)能抑制和清除超氧陰離子自由基,避免機體防御過氧化,保護機體免受氧化損傷[23]。SOD能通過增強巨噬細胞的吞噬活性提高機體的免疫機能和抗病能力[24-25]。本研究中雜交鱘感染海豚鏈球菌后血清SOD活力先升高再緩慢降低,這可能是海豚鏈球菌感染入侵雜交鱘機體后產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致體內(nèi)的活性氧積聚, 激活了該誘導(dǎo)酶活性,使得鱘魚血清SOD酶活性應(yīng)激性升高,協(xié)助體內(nèi)活性氧的清除, 從而避免病原菌入侵造成的機體損傷[24]。

過氧化物酶(POD)是廣泛存在于各種動物、植物和微生物體內(nèi)的一類氧化酶,與吞噬功能和免疫細胞功能相伴,能使毒性物質(zhì)失活,參與脂的合成、含氮物質(zhì)的代謝, 能調(diào)節(jié)氧含量,避免高濃度氧毒害細胞[26]。本研究發(fā)現(xiàn),感染海豚鏈球菌后雜交鱘血清POD活力先降低后升高再緩慢降低。在第7天時,空白對照組的POD活力顯著高于各攻毒組,在7～35 d各攻毒組POD活力都顯著高于空白對照組,且均先升高后降低?？赡苁囚~體內(nèi)活性氧濃度過高,鱘魚血清POD酶活性應(yīng)激性升高,對氧濃度進行調(diào)節(jié),使細胞免受高濃度氧的毒性作用。

3.2.2 三黃散與百優(yōu)酸對患海豚鏈球菌病的雜交鱘血清酶活的影響 三黃散主要成分為黃苓、黃柏、大黃、大青葉。黃芩主要成分是黃酮類化合物,其特點是能影響細菌體內(nèi)的代謝途徑,抗菌譜廣[27]。黃柏藥用成分是多種生物堿類物質(zhì),能廣譜抗菌[28]。大黃富含蒽醌類化合物,通過阻斷糖代謝中間產(chǎn)物的氧化及脫氫而抑制細菌蛋白質(zhì)和核酸合成,已有報道大黃能抑制嗜水氣單胞菌活性[29],也能抑制魚害粘球菌活性[27]。本研究中三黃散組雜交鱘血清的ACP、AKP、LZM、SOD和POD活力變化趨勢與陽性攻毒對照組一致,但變化幅度顯著低于陽性對照組,說明三黃散能有效減輕海豚鏈球菌對雜交鱘血液生化指標(biāo)的影響,對雜交鱘體內(nèi)的海豚鏈球菌具有抑制或殺滅的功效。此結(jié)果與張彬等[11]所報道的黃連、黃芩、大黃和黃柏4種中草藥煎液高度抑制海豚鏈球菌生長的結(jié)論一致。

百優(yōu)酸主要由精選的有機酸、植物提取物、獨特透化劑和緩釋載體組成,在抑制和殺滅胃腸道有害菌方面非常高效。已有報道百優(yōu)酸能提高對蝦的生長性能,增強其抗病抗應(yīng)激能力,抑制部分腸道有害微生物的生長[30]。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疾病臨床診療中心證實,百優(yōu)酸應(yīng)用于斷奶仔豬日糧中能明顯降低斷奶仔豬的腹瀉率和腹瀉程度,能抑制腸道有害菌的增殖,還能達到抗生素的效果,可作為理想的替代抗生素產(chǎn)品。本研究中百優(yōu)酸組雜交鱘血清的ACP、AKP、LZM、SOD和POD活力變化趨勢與陽性攻毒對照組一致,但變化幅度顯著低于陽性對照組,說明百優(yōu)酸能有效減輕海豚鏈球菌對雜交鱘血液生化指標(biāo)的影響,對魚體內(nèi)的海豚鏈球菌具有抑制或殺滅的效果,與之前的研究基本吻合。

本研究中三黃散+百優(yōu)酸組雜交鱘血清的ACP、AKP、LZM、SOD和POD活力變化趨勢與其他攻毒組一致,但變化幅度顯著低于三黃散組和百優(yōu)酸組,說明三黃散和百優(yōu)酸共同作用更能減輕海豚鏈球菌對雜交鱘血液生化指標(biāo)的影響,對病魚的治療效果更好。

3.3 三黃散與百優(yōu)酸對患海豚鏈球菌病的雜交鱘組織器官的影響

AKP活性與內(nèi)臟損傷關(guān)系密切,AKP活性增加會導(dǎo)致內(nèi)臟受損加重[30]。本研究中感染海豚鏈球菌的雜交鱘陽性對照組AKP 活性極顯著增加,三黃散組和百優(yōu)酸組AKP 活性增加量均低于陽性對照組,各攻毒組中三黃散+百優(yōu)酸組AKP活性增加量最小。陽性對照組病理學(xué)變化主要表現(xiàn)為肝細胞嚴(yán)重變性壞死,崩解,伴有大量炎癥細胞浸潤,腸粘膜受損嚴(yán)重,腸絨毛嚴(yán)重壞死脫落,伴有炎癥細胞浸潤。三黃散組和百優(yōu)酸組肝腸的病理癥狀較陽性對照組有所減輕,三黃散+百優(yōu)酸組肝腸病理癥狀最輕,與已報道的結(jié)果相吻合[31-32]。由組織病理結(jié)果可知,三黃散和百優(yōu)酸都能減輕患海豚鏈球菌病雜交鱘的內(nèi)臟損傷,且二者聯(lián)用效果更好。

4 結(jié) 論

三黃散和百優(yōu)酸對雜交鱘海豚鏈球菌病都有一定的治療效果,二者聯(lián)用具有協(xié)同作用,能更好地治療雜交鱘海豚鏈球菌病,大幅度降低其死亡率。