食蟹猴紋狀體內(nèi)注射α-突觸核蛋白預(yù)制原纖維對嗅球病理改變的影響

丁雨瀟，粟璟曦，宋瓊，王麗惠，吳日寶，況昕宇，蘇迎，鄒春林，2△

帕金森病（Parkinson，PD）又名震顫性麻痹，是一種多發(fā)于老年人群的神經(jīng)退行性疾病，在65歲以上老年人群中患病率達2%～3%，受到人口老齡化及環(huán)境等因素影響，預(yù)計到2040年全球患病人數(shù)將達到1 420萬［1］。目前臨床上對于PD患者的診斷大多依賴于靜止性震顫、行動遲緩、肌強直等運動癥狀，但當患者被診斷為PD 時，黑質(zhì)致密部的多巴胺（Dopamine，DA）能神經(jīng)元約有一半已經(jīng)丟失。然而嗅覺功能障礙作為PD早期常見的非運動癥狀，通常先于運動癥狀數(shù)年發(fā)生，對于輔助PD患者盡早診斷具有重要意義［2］。α-突觸核蛋白（α-Synuclein，α-Syn）是一種神經(jīng)元特異性突觸前膜蛋白，也是PD特征性包涵體——Lewy 小體的重要成分。α-Syn 與PD發(fā)病過程密切相關(guān)［3］。為了研究病理性α-Syn的致病機制，研究人員在體外合成了與病理性α-Syn原纖維結(jié)構(gòu)高度相似的α-Syn 預(yù)制原纖維（α-Synuclein Preformed Fibrils，α-Syn PFF），并將其應(yīng)用于PD 細胞和動物模型的制作［4］。與傳統(tǒng)的神經(jīng)毒素誘導(dǎo)的PD 模型相比，α-Syn PFF 誘導(dǎo)的PD 模型可以更好地模擬PD 患者的病理特征，如在黑質(zhì)DA能神經(jīng)元內(nèi)可見病理性α-Syn 聚集和Lewy 小體樣包涵體的形成。但是目前關(guān)于α-Syn PFF 誘導(dǎo)的PD動物模型的研究常見于小鼠［5］，在非人靈長類動物上較少見，并且對模型動物腦組織病理改變的研究主要集中于黑質(zhì)和紋狀體等腦區(qū)［6］，對嗅球損傷的研究較少。本實驗于食蟹猴雙側(cè)紋狀體注射α-Syn PFF構(gòu)建模型，探討食蟹猴紋狀體內(nèi)注射α-Syn PFF對嗅球病理改變的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 5 只正常雌性食蟹猴（8～11 歲）購自廣西雄森靈長類實驗動物養(yǎng)殖開發(fā)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2016-0003，并飼養(yǎng)于廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司的非人靈長類實驗室，動物使用許可證號：SYXK（桂）2019-0002。該實驗室已通過國際實驗動物評估和認可管理委員會（AAALAC）認證，動物房飼養(yǎng)溫度保持23～27 ℃，光照黑暗各12 h 循環(huán)交替，純凈飲用水持續(xù)供應(yīng)，每日供給常規(guī)飼料和新鮮水果。所有涉及動物的實驗方案均得到了動物關(guān)懷與使用倫理委員會（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）的批準（倫理號：W00154）。

1.1.2 主要試劑及儀器 鼠源酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）單克隆抗體（MAB318）購自美國Millipore 公司；兔源磷酸化α-Syn（pS129）單克隆抗體（ab51253）、兔源雙皮質(zhì)素（Doublecortin，DCX）多克隆抗體（ab18723）購自英國Abcam公司；生物素化山羊抗兔二抗（BA-1000）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素工作液（SA-5004-1）、DAB 過氧化物酶底物試劑盒（含鎳，SK-4100）購自美國Vector公司；DAB 顯色試劑盒（ZLI-9018）、小鼠SPN 試劑盒（SPN-9002）、兔SPN 試劑盒（SPN-9001）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；尼氏染色液（C0117）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Leica冰凍切片機（LEICA CM1950）購自德國Leica公司。

1.2 模型建立 根據(jù)食蟹猴腦部磁共振影像，對3只食蟹猴施以腦立體定向注射手術(shù)，將300 μg α-Syn PFF（7 g/L）注射到雙側(cè)紋狀體的6個位點，即每側(cè)紋狀體殼核頭部注射60μg，體部注射60μg，尾部注射30μg。另2 只食蟹猴于相同部位給予同等劑量磷酸鹽緩沖液（PBS）作為對照組。觀察2年，于注射2年后，分別對5只食蟹猴靜脈注射過量的戊巴比妥鈉行安樂死，經(jīng)左心室以生理鹽水灌流沖洗血管，開顱取出嗅球，并經(jīng)4%多聚甲醛固定后，分別在10%、20%和30%蔗糖中梯度脫水，OCT包埋并切成14μm厚的冰凍切片。

1.3 免疫組織化學染色 冰凍切片經(jīng)烤片30 min，4%多聚甲醛固定30 min，0.01 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液微波修復(fù)抗原，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶30 min，0.3%Triton X-100 增加細胞通透性30 min，5%羊血清封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜，包括TH 抗體（1∶400）、DCX 抗體（1∶4 000）、pS129 抗體（1∶1 000），次日以0.1 mol/L 磷酸緩沖液（PB）沖洗3次，孵育生物素化山羊抗小鼠或抗兔二抗90 min，0.1 mol/L PB 沖洗3次，之后孵育HRP 標記鏈霉卵白素工作液或HRP 標記鏈霉親和素工作液（1∶250）反應(yīng)90 min，0.1 mol/L PB 沖洗3 次，DAB顯色或含鎳DAB底物液顯色，鏡下控制顯色時間，蒸餾水清洗2次，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。由于嗅球不同切面的切片細胞數(shù)量可能差異較大，為避免由于集中選取某一部分的切片導(dǎo)致細胞數(shù)的差異在對照組和實驗組每只食蟹猴嗅球切片中每間隔5 張?zhí)羧? 張，每只食蟹猴共選取5張切片，每張切片均勻地選擇5個20倍鏡下視野，利用Image J軟件計數(shù)DA和DCX陽性細胞數(shù)。

1.4 尼氏染色 切片浸入4%多聚甲醛固定20 min，蒸餾水洗滌2 min，重復(fù)1 次，之后在組織上滴加尼氏染液，放入37 ℃孵箱中染色10 min，取出后蒸餾水洗滌2 次，浸入95%乙醇分色約5 s，最后于95%乙醇中脫水2 min，重復(fù)1 次，二甲苯透明5 min，重復(fù)1次，中性樹膠封片。

1.5 統(tǒng)計學方法 用SPSS 23.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 嗅球組織病理改變 對照組整體著色較深，顆粒細胞層（granule cell layer，GCL）與僧帽細胞層（mitral cell layer，MCL）神經(jīng)元多且排列緊密，細胞輪廓清晰；實驗組整體著色較淡，GCL 與MCL 神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，MCL 排列松散，且細胞輪廓模糊，見圖1。

2.2 病理性α-Syn 可傳播至嗅球 對照組嗅球中無pS129陽性反應(yīng)，實驗組嗅球存在大量pS129陽性聚集體，見圖2。

Fig.2 Immunohistochemistry staining of pS129 in olfactory bulb圖2 免疫組織化學染色嗅球組織pS129表達

2.3 α-Syn PFF 誘導(dǎo)嗅球DA 能神經(jīng)元丟失 與對照組相比，實驗組嗅球DA 能神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。實驗組TH陽性神經(jīng)元數(shù)量為（27.00±11.22）個，對照組為（65.80±36.54）個，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.257，P＜0.01），見圖3。

Fig.3 The number of TH-positive neurons detected by immunohistochemistry staining in olfactory bulb圖3 免疫組織化學染色檢測嗅球TH陽性神經(jīng)元數(shù)量

2.4 α-Syn PFF抑制新生神經(jīng)元生成 與對照組嗅球DCX陽性神經(jīng)元數(shù)量［（88.30±19.89）個］比較，實驗組［（67.60±17.23）個］明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.678，P＜0.05），見圖4。

Fig.4 The number of DCX-positive new neurons detected by immunohistochemistry staining in olfactory bulb圖4 免疫組織化學染色檢測嗅球DCX陽性新生神經(jīng)元數(shù)量

3 討論

3.1 食蟹猴紋狀體注射α-Syn PFF 模型更具代表性 PD患病人數(shù)逐年上升，已經(jīng)造成嚴重的社會醫(yī)療負擔。目前雖然已經(jīng)開發(fā)了多種動物模型來研究該疾病，但每種模型都有一定的局限性［7］。以毒素為基礎(chǔ)的動物模型［8］主要針對PD的運動癥狀，極大地促進了其對癥治療的發(fā)展，這些模型的優(yōu)點是運動癥狀表型清晰，建模時間短，可以應(yīng)用于多種動物，但實驗過程中難以避免實驗者暴露，且對于腦內(nèi)病理改變的再現(xiàn)效果較差。α-突觸核蛋白基因（SNCA）是編碼α-Syn的基因，也是家族性帕金森病重要的致病基因，基于SNCA基因突變構(gòu)造了許多α-Syn轉(zhuǎn)基因動物模型，例如A53T、A30P，此類模型可復(fù)制類似于PD患者腦內(nèi)α-Syn異常聚集現(xiàn)象，并表現(xiàn)出漸進的病理變化，但通常需要較長時間，且有時難以獲得目的表征。近年來病理性a-Syn的播散在PD 的發(fā)病及進展研究中日漸受到關(guān)注。越來越多的證據(jù)表明，錯誤折疊的a-Syn 會在相互連接的中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域之間擴散，促進疾病的進展［9］。PD 患者接受胚胎中腦DA 能神經(jīng)元移植多年后，在移植神經(jīng)元中檢測到了病理性a-Syn，進一步證實了其傳播性［10］。α-Syn 是由140 個氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)，分布于突觸前神經(jīng)末梢，在PD 患者中常于Ser129 位點發(fā)生磷酸化，聚集成不溶性淀粉樣原纖維。為研究病理性α-Syn 的致病機制，研究人員在體外合成了與病理性α-Syn原纖維結(jié)構(gòu)高度相似的α-Syn PFF，并將其注射入野生型小鼠紋狀體，證實α-Syn PFF 可在整個腦區(qū)引起磷酸化α-Syn 病理改變［11］。這一模型對比轉(zhuǎn)基因模型建模時間較短，且PD 表型較全面，是研究PD 腦內(nèi)病理改變的理想模型。非人靈長類動物食蟹猴在組織結(jié)構(gòu)、免疫、生理和代謝等方面與人類高度近似，對食蟹猴進行研究獲得的結(jié)果能夠更好地轉(zhuǎn)化應(yīng)用［12］。本研究結(jié)果顯示，α-Syn PFF 造模的食蟹猴對比對照組嗅球中存在大量磷酸化α-Syn 沉積，證明病理性α-Syn 能夠從紋狀體傳播至嗅球，引起神經(jīng)元損傷。

3.2 α-Syn PFF誘導(dǎo)嗅球DA能神經(jīng)元丟失 PD最顯著的非運動癥狀是嗅覺功能障礙，在家族性和散發(fā)性PD中均有表現(xiàn)，患病率為50%～96%，并且可以在運動癥狀出現(xiàn)之前至少5 年出現(xiàn)［13］。Braak 假說也提出嗅球是最早受累的部位之一，在病程早期即可出現(xiàn)α-Syn病理沉積，因此可作為PD早期診斷的特征之一［14］。Huisman 等［15］發(fā)現(xiàn)在早期PD 患者嗅球中DA能神經(jīng)元數(shù)量顯著增加，而DA能神經(jīng)元數(shù)量的增加導(dǎo)致嗅覺信息傳遞的抑制，提示嗅覺減退可能與DA 能神經(jīng)元代償性增多有關(guān)。隨著病程發(fā)展，代償作用減弱，DA 能神經(jīng)元數(shù)量逐漸減少。本實驗中雙側(cè)紋狀體注射α-Syn PFF誘導(dǎo)的食蟹猴模型2年后檢測嗅球中DA能神經(jīng)元數(shù)量下降，證明病理性α-Syn可以從紋狀體注射位點傳播至嗅球并造成嗅球DA能神經(jīng)元丟失，這一病理改變是否會引起食蟹猴嗅覺障礙還需進一步研究。

3.3 α-Syn PFF抑制新生神經(jīng)元生成 神經(jīng)元數(shù)量減少通常是由于神經(jīng)元死亡增加以及新生神經(jīng)元生成減少所致。已有研究表明，在成年哺乳動物的大腦中DA 調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細胞的增殖，DA 能神經(jīng)元丟失后嗅球中新生神經(jīng)元減少［16］。對PD 患者的尸檢結(jié)果與實驗結(jié)果一致，患者側(cè)腦室下區(qū)、海馬齒狀回顆粒下區(qū)和嗅球神經(jīng)前體細胞的增生均減少，提示DA能神經(jīng)元丟失可能是PD患者大腦中新生神經(jīng)元生成減少的原因［17］。Winner等［18］在高表達α-Syn的轉(zhuǎn)基因小鼠海馬齒狀回中發(fā)現(xiàn)α-Syn異常聚積且新生神經(jīng)元生成減少，表明α-Syn 的過表達能夠影響新生神經(jīng)元的形成?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，本實驗探究了食蟹猴雙側(cè)紋狀體注射α-Syn PFF能否造成嗅球DA能神經(jīng)元的丟失，同時伴有新生神經(jīng)元生成減少。DCX 是一種微管相關(guān)蛋白,參與新生神經(jīng)元的遷移和分化，可用來標記未分化成熟的神經(jīng)細胞，DCX 數(shù)量的多少可以間接反映神經(jīng)元生成的能力。本實驗檢測到α-Syn PFF 造模的食蟹猴嗅球中TH免疫組化染色的DA能神經(jīng)元和DCX陽性細胞數(shù)均減少，說明α-Syn PFF可能通過引起DA能神經(jīng)元的丟失導(dǎo)致新生神經(jīng)元生成減少，進一步促進PD的病理進程，而其能否引起食蟹猴的側(cè)腦室下區(qū)等其他腦區(qū)出現(xiàn)相同的病理改變還需進一步研究。

綜上所述，本實驗利用食蟹猴雙側(cè)紋狀體注射α-Syn PFF建立模型，發(fā)現(xiàn)病理性α-Syn可傳播至嗅球引起神經(jīng)元損傷，使嗅球中DA 能神經(jīng)元大量丟失，并伴有新生神經(jīng)元生成減少，這些病理改變可能與PD 的嗅覺障礙有關(guān)，為今后更好地利用α-Syn PFF建立PD模型、研究其嗅覺障礙的發(fā)病機制提供了一定基礎(chǔ)。