林曉明，許琨琨，蔡振世，莊秋虹，莊慶彬

（泉州市食品藥品檢驗(yàn)所，福建泉州 362000）

以罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因等為主要成分[1]的罌粟殼中的多種生物堿可以讓食品增味提鮮，使顧客上癮，讓人嗜睡和性格改變，長期食用會(huì)引起精神失常，出現(xiàn)幻覺甚至慢性中毒[2-3]。盡管我國法律明令禁止在食品中添加罌粟殼，有關(guān)部門對(duì)在食品中添加罌粟殼的行為采取高壓打擊態(tài)勢，但某些不法商販，為了“回頭客”，利用罌粟殼的成癮特性，將其添加在羊肉湯、火鍋底料、麻辣燙等餐飲食品中，從而增加客流量，嚴(yán)重危害人們的身心健康[4-5]。

目前，在5 種生物堿的檢測中，相比以往固相萃取法、氯仿萃取法等前處理方法，QuEChERS 前處理方法更快速、便捷、有效，廣泛應(yīng)用于多數(shù)檢測領(lǐng)域，也用于罌粟殼中多種生物堿的檢驗(yàn)檢測[3,6-7]。筆者發(fā)現(xiàn)不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方式會(huì)直接影響最終的定量結(jié)果，基于此對(duì)基質(zhì)效應(yīng)和標(biāo)曲定量方式對(duì)5 種生物堿中的影響展開研究探討，同時(shí)建立一種高效QuEChERS-UPLC-MS/MS 方法，一次性同時(shí)檢測羊湯、火鍋湯和水煮魚湯等多種餐飲食品中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因5 種生物堿含量，以供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

GM200 高 速 磨 碎 機(jī)，Retsch；XSE205DU 電子天平，梅特勒托利多儀器有限公司；LPD2500 多管旋渦混合儀，萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司；LAB DANCER S25 漩渦混勻器，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；Tissuelyser-96LGM 多樣品組織研磨儀，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；3-15 離心機(jī)，曦瑪離心機(jī)（揚(yáng)州）有限公司；TurboVap LV 全自動(dòng)氮吹儀，Biotage；Triple Quad 5500 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，美國愛博才思公司。

1.2 材料與試劑

樣品：羊湯、火鍋湯、水煮魚湯，均在泉州市區(qū)各小吃店的餐飲食品隨機(jī)采購。

試劑：乙腈（默克，色譜純）；甲醇（默克，色譜純）；甲酸（ROE，色譜純）；乙酸銨（Fisher Chemical，色譜純）。鹽酸可待因（中檢院，批號(hào)：171203-201808，100 mg）；嗎啡（中檢院，批號(hào)：171201-201825，100 mg）；蒂巴因（中檢院，批號(hào)：171216-201805，50 mg）；那可?。ㄖ袡z院，批號(hào)：171224-201605，100 mg）；鹽酸罌粟堿（中檢院，批號(hào)：171214-201906，100 mg）；甲醇中可待因-D3 溶液（First Standard?，批號(hào)：S107027，100 μg·mL-1）； 甲 醇 中 嗎 啡-D3 溶 液（First Standard?，批號(hào)：S102043，100 μg·mL-1）。

材料：高效QuEChERS 樣品前處理試劑盒[青云化學(xué)科技有限公司，型號(hào)：CQ11-3（萃取管+鹽包+凈化管），批號(hào)：20230323-004]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜和質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH HILIC（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流 動(dòng) 相：A 相為含0.1%甲酸的10 mmol·L-1乙酸銨溶液，B 相為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫（見表1）。柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：2 μL。

表1 梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件。離子源：ES（I電噴霧離子源），正離子模式采集；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM；氣簾氣（CUR）：20 psi；離子化電壓（IS）：5 500 V（正離子模式）；溫度（TEM）：500 ℃；噴霧氣（GS1）：50 psi；輔助加熱氣（GS2）：50 psi；各化合物質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 5 種生物堿的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.2 對(duì)照品及樣品溶液的制備

（1）混合對(duì)照品溶液的制備。對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取嗎啡、鹽酸可待因（以下簡稱可待因）、蒂巴因、那可丁和鹽酸罌粟堿（以下簡稱罌粟堿）對(duì)照品適量，分別置于25 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成濃度均為100 μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

混合對(duì)照品溶液A：精密吸取嗎啡、可待因各1 000 μL 和那可丁、蒂巴因、罌粟堿各200 μL 于20 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混勻，得嗎啡、可待因濃度為5 μg·mL-1和那可丁、蒂巴因、罌粟堿濃度為1 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液A。

混合對(duì)照品溶液B：精密吸取100 μL 混合對(duì)照品溶液A于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混勻，得嗎啡、可待因濃度為50 ng·mL-1和那可丁、蒂巴因、罌粟堿濃度為10 ng·mL-1的混合對(duì)照品溶液B。

同位素內(nèi)標(biāo)混合對(duì)照品工作溶液（5 μg·mL-1）：精密吸取嗎啡-D3 和可待因-D3（對(duì)照品濃度均為100 μg·mL-1）各1 000 μL 置于20 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得嗎啡-D3 和可待因-D3 濃度均為5 μg·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)溶液，備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液制備：以乙腈為溶劑，精密吸取混合對(duì)照品溶液B 適量，逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度 為0.20 ng·mL-1、0.50 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、2.00 ng·mL-1、5.00 ng·mL-1的那可丁、蒂巴因、罌粟 堿 和 質(zhì) 量 濃 度 為1.00 ng·mL-1、2.50 ng·mL-1、5.00 ng·mL-1、10.00 ng·mL-1、25.00 ng·mL-1的嗎啡、可待因混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用。

（2）樣品溶液的制備。每種樣品平行稱取2 g（精確至0.01 g），分別置于50 mL CQ11-3 萃取管（內(nèi)含NaCl 500 mg）中，加入5 mL 水振搖混勻，再加入溶劑乙腈15 mL，渦旋振搖混勻1 min 左右，加入CQ11-3 鹽包（內(nèi)含MgSO45 g 和NaAc 2 g），劇烈振蕩1 min，用5 000 r·min-1離心機(jī)離心5 min，取上清液8 mL 至CQ11-3 凈化管（內(nèi)含PSA 300 mg、C18500 mg 和MgSO41 500 mg）中，渦旋混勻1 min 左右，再經(jīng)5 000 r·min-1離心機(jī)離心5 min，移取上清液適量經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜，按1.3.1 方法進(jìn)樣。

（3）溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制備。取5 支10 mL玻璃試管，均加入同位素內(nèi)標(biāo)混合對(duì)照品工作溶液（5 μg·mL-1）20 μL，再依次加入1 mL 相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，復(fù)溶混勻（見表3），過0.22 μm有機(jī)濾膜，按1.3.1 方法進(jìn)樣。

表3 溶劑/基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中各化合物濃度梯度

（4）基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備。稱取3 種空白基質(zhì)樣品各2 g（精確至0.01 g），每種平行6 份。同樣品溶液的制備方法進(jìn)行提取和凈化，得空白基質(zhì)溶液，合并于50 mL 塑料離心管，再分別精確移取1 mL 置于5 支10 mL 玻璃試管中，40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?，均加入同位素?nèi)標(biāo)混合對(duì)照品工作溶液（5 μg·mL-1）20 μL，再依次加入1 mL 相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，復(fù)溶混勻（見表3），過0.22 μm有機(jī)濾膜，按1.3.1 方法進(jìn)樣。

（5）加標(biāo)回收及精密度測試。稱取3 種空白基質(zhì)樣品各2 g（精確至0.01 g），每種平行6 份。設(shè)置一個(gè)濃度水平加標(biāo)回收，分別加入20 μL 混合對(duì)照品溶液A 和300 μL 同位素內(nèi)標(biāo)混合對(duì)照品工作溶液（5 μg·mL-1），同樣品溶液的制備方法進(jìn)行提取和凈化，按1.3.1 方法進(jìn)樣。

（6）檢出限、定量限的確定。利用空白基質(zhì)添加5 種生物堿目標(biāo)化合物，以3 倍信噪比對(duì)應(yīng)檢測濃度確定方法檢出限，以10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的檢測濃度確定方法定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍

本實(shí)驗(yàn)方法得出的各目標(biāo)化合物的線性范圍如表4 所示，其中罌粟堿、那可丁、蒂巴因線性濃度范圍為0.20 ～5.00 ng·mL-1，嗎啡、可待因的線性濃度范圍為1.00 ～25.00 ng·mL-1，相關(guān)系數(shù)均在0.998 以上，說明各目標(biāo)化合物的峰面積與進(jìn)樣濃度在線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。

表4 5 種生物堿的線性范圍定量分析

2.2 不同基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)分析

按公式（1）分析基質(zhì)效應(yīng)影響，結(jié)果如表5 所示。由表5 可知，用高效QuEChERS 方法處理空白基質(zhì)，5 種生物堿均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。其中，罌粟堿、那可丁、蒂巴因在外標(biāo)法定量分析中，3 種基質(zhì)中的|ME|≤0.22，基本呈現(xiàn)弱的基質(zhì)效應(yīng)；嗎啡、可待因在外標(biāo)定量和內(nèi)標(biāo)法定量中，3 種基質(zhì)中的|ME|均在0.2 ～0.5，呈現(xiàn)中等基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)標(biāo)法定量分析加大了這種效應(yīng)趨勢。

表5 5 種生物堿在3 種基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

式中：ME為基質(zhì)效應(yīng)；A為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；B為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。當(dāng)ME＞0，表明基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)；ME＜0，表明基質(zhì)效應(yīng)抑制；|ME|=0表示不存在基質(zhì)效應(yīng)；|ME|＜0.2 為弱基質(zhì)效應(yīng)；0.2 ≤|ME|≤0.5 為中等基質(zhì)效應(yīng)；|ME|＞0.5 為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[6]。

2.3 不同標(biāo)曲定量分析加標(biāo)回收率

從表6 可知，用溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法和基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量分析罌粟堿、那可丁、蒂巴因在羊湯、火鍋湯、水煮魚湯中的加標(biāo)回收率情況，回收率均能滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范，表明該高效QuEChERS前處理方法對(duì)罌粟堿、那可丁、蒂巴因3 種生物堿的提取效率較好。但可以發(fā)現(xiàn)基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量相較于溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法定量而言，回收率均有所上升，除了罌粟堿和那可丁在水煮魚湯基質(zhì)加標(biāo)中的上升幅度比較大，達(dá)到21%和27%，其余上升幅度均不超10%，影響相對(duì)有限。其中蒂巴因在火鍋湯基質(zhì)加標(biāo)中的上升幅度最低，僅有1%左右。這與2.2分析的基質(zhì)效應(yīng)抑制相對(duì)應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)越弱，兩種標(biāo)曲定量出來的回收率結(jié)果越接近，反之相差越大。由此可見，使用基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量罌粟堿、那可丁、蒂巴因相對(duì)準(zhǔn)確，但為了方便快捷，減少基質(zhì)空白前處理過程，參考實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范要求，由于罌粟堿、那可丁和蒂巴因基質(zhì)效應(yīng)偏弱，可以采取溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法定量分析。

表6 不同標(biāo)曲定量分析3 種基質(zhì)中5 種生物堿的加標(biāo)回收率、定量限、檢出限

用溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法和基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量分析嗎啡、可待因在羊湯、火鍋湯、水煮魚湯中的加標(biāo)回收率情況，基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量能讓回收率上升幅度在25%～55%，但回收率結(jié)果均不足50%，未能有效滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范?？梢?，即使嗎啡、可待因在3 種基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)影響較大，呈現(xiàn)中等基質(zhì)效應(yīng)，用基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量仍未能滿足要求。而用溶劑標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法定量分析，嗎啡的回收率在82%～85%，可待因的回收率在85%～87%，均能滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范。這與嗎啡、可待因在高效QuEChERS 前處理過程中損失有著密切聯(lián)系。據(jù)此，筆者提出該前處理方法是影響嗎啡、可待因提取效率的第一影響因素，而基質(zhì)效應(yīng)為次影響因素。為此，采取了用基質(zhì)標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法定量分析了加標(biāo)回收情況，結(jié)果是嗎啡回收率范圍在123%～149%，可待因的回收率范圍在140%～149%，這可能是嗎啡-D3、可待因-D3 內(nèi)標(biāo)物校正了QuEChERS 前處理過程中目標(biāo)化合物的損失（含基質(zhì)效應(yīng)影響的部分）和基質(zhì)標(biāo)曲校正了基質(zhì)效應(yīng)影響的雙重疊加的結(jié)果，偏離了實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范范圍。由此可以得出，QuEChERS 前處理方法是影響嗎啡、可待因提取效率的第一影響因素，基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量對(duì)其改善不足，用溶劑標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法定量分析較為可靠，也相對(duì)方便快捷。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證的結(jié)果分析

按2.3 分析，本文針對(duì)罌粟堿、那可丁和蒂巴因選取溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法定量分析，嗎啡、可待因選取溶劑標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法定量分析，確定該方法的方法學(xué)參數(shù)的可靠性。從表4 可知，罌粟堿、那可丁、蒂巴因線性濃度范圍為0.20 ～5.00 ng·mL-1，嗎啡、可待因的線性濃度范圍為1.00 ～25.00 ng·mL-1，相關(guān)系數(shù)均在0.998 以上。從表6 可知，5 種生物堿在3 種基質(zhì)中的定量限和檢出限均較低，在羊湯、火鍋湯、水煮魚湯中的定量限位于0.08 ～4.50 μg·kg-1，檢出限位于0.02 ～1.35 μg·kg-1。從表7 可知，5 種生物堿在羊湯、火鍋湯、水煮魚湯中加標(biāo)回收率在69%～88%，RSD 在0.2%～5.5%。由此可見，此方法具有較低的定量限、檢出限，在線性范圍內(nèi)各目標(biāo)化合物的相關(guān)性良好，同時(shí)具有較好準(zhǔn)確度和精密度。

表7 5 種生物堿準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

本文對(duì)比分析了5 種生物堿在羊湯、火鍋湯以及水煮魚湯基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)弱，同時(shí)用溶劑外標(biāo)法、基質(zhì)外標(biāo)法、溶劑內(nèi)標(biāo)法、基質(zhì)內(nèi)標(biāo)法4 種不同標(biāo)準(zhǔn)工作曲線定量分析加標(biāo)樣品，指出罌粟堿、那可丁和蒂巴因3 種生物堿在羊湯、火鍋湯以及水煮魚湯基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)抑制較弱，溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法和基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量結(jié)果均能滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范；而嗎啡和可待因2 種生物堿在羊湯、火鍋湯以及水煮魚湯基質(zhì)中受到的基質(zhì)效應(yīng)抑制為中等強(qiáng)度，考慮高效QuEChERS 前處理是影響嗎啡、可待因提取效率的第一影響因素，而基質(zhì)效應(yīng)為次影響因素，經(jīng)過對(duì)比分析只有溶劑標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法的定量結(jié)果能滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范。通過方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明，可以不考慮不同基質(zhì)對(duì)5 種生物堿的影響，采用溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法定量分析罌粟堿、那可丁、蒂巴因，采用溶劑標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法定量分析嗎啡、可待因，建立一種高效QuEChERS-UPLC-MS/MS 方法，一次性同時(shí)檢測羊湯、火鍋湯和水煮魚湯3 種餐飲食品中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因5 種生物堿的含量。該方法的靈敏度高，準(zhǔn)確度、重復(fù)性較好，操作簡便、快速，可為市場監(jiān)管相關(guān)餐飲食品中罌粟殼生物堿殘留量提供思路。