不同鹽度對醬油發(fā)酵中酵母自溶及醬油風味的影響

摘要：對酵母在醬油發(fā)酵過程中的自溶現(xiàn)象及對成品醬油風味的影響進行了研究，醬油理化指標均在正常范圍內。細胞數變化結果表明，20%鹽度發(fā)酵時，酵母生長速度最慢，死亡率最高，達到72.9%；而16%和12%鹽度發(fā)酵組死亡率分別為61.7%、52.8%。染色圖片表明，隨著發(fā)酵的進行，細胞結構均受到不同程度的破壞，呈現(xiàn)出明顯的藍色。風味分析實驗表明，20%鹽度發(fā)酵組細胞自溶加速，同時過度抑制酵母生長，不利于醬油風味的形成，12%鹽度發(fā)酵組酵母細胞數量最高，其酸類物質含量也明顯高于其他兩組，過多的酸類物質會使醬油產生不良氣味，影響醬油的感官品質。綜合實驗結果表明，16%鹽度發(fā)酵組有利于醬油的發(fā)酵以及醬油綜合風味的形成。

關鍵詞：醬油；魯氏接合酵母；自溶；風味

中圖分類號：TS264.21? ? ? 文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）07-0014-06

Abstract： The autolysis phenomenon of yeast in the fermentation process of soy sauce and its effect on the flavor of finished soy sauce product are studied. The physical and chemical indexes of soy sauce are all in the normal range. The results of cell number changes show that when fermenting at 20% salinity， the yeast growth speed is the slowest and the mortality rate is the highest， reaching 72.9%， while the mortality rates of the 16% and 12% salinity fermentation groups are 61.7% and 52.8% respectively. The staining images show that the cell structure is damaged to varying degrees as the fermentation goes on， showing a distinct blue color. The flavor analysis experiment shows that cell autolysis of 20% salinity fermentation group accelerates. At the same time， the growth of yeast is excessively inhibited， which is not conducive to the formation of soy sauce flavor. The 12% salinity fermentation group has the largest number of yeast cells， and its acids' content is also significantly higher than that of the other two groups. Excessive acids will make soy sauce have bad flavor and affect the sensory quality of soy sauce. The comprehensive experiment results show that the 16% salinity fermentation group is more conducive to the fermentation of soy sauce and the formation of comprehensive flavor of soy sauce.

Key words： soy sauce; Zygosaccharomyces rouxii; autolysis; flavor

醬油是起源于我國的一種調味品，主要以富含蛋白質和淀粉的大豆、小麥等為原料，經預處理、制曲、發(fā)酵、壓榨等工序生產出來的一種香氣獨特、滋味鮮美的調味品，并且由于營養(yǎng)豐富，對機體有一定的功效而逐漸被西方國家接受[1-2]。

酵母菌是應用最早的一類微生物，從醬醪中分離出的酵母菌有7個屬，32個種，其中球擬酵母、魯氏接合酵母等與醬油質量、風味的形成密切相關[3]。

自溶現(xiàn)象（autolysis）在1875年被Salkowski發(fā)現(xiàn)并命名，解釋為隨著細胞的死亡而發(fā)生的一種胞內大分子在多種水解酶的作用下分解為小分子物質的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象通常發(fā)生在穩(wěn)定期后期，是一種自發(fā)的、全局化、不可逆的細胞代謝反應[4-5]。而微生物的自溶現(xiàn)象受多種外界因素的影響，比如溫度、壓力、pH等控制不當都會提高酵母自溶的概率，氯化鈉含量也是影響酵母自溶的關鍵因素之一[6]。高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵工藝最突出的特點是食鹽添加量的增加，這或許會對酵母自溶產生一定影響[7]。目前對酵母自溶的研究多集中于啤酒如何減輕酵母自溶現(xiàn)象，保持良好的啤酒特性，而對醬油發(fā)酵中酵母是否發(fā)生自溶、自溶程度、發(fā)生原因以及對醬油品質的影響等研究較少。本研究主要圍繞著醬油發(fā)酵常用菌種魯氏接合酵母展開，分析其在醬油發(fā)酵過程中的自溶現(xiàn)象以及其對醬油風味的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

魯氏接合酵母：天津科技大學食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室菌種保藏中心存放。

1.2 實驗試劑及培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉、硼酸：天津津東天正精細化學試劑廠；鹽酸：天津市化學試劑一廠；氯化鈉、硫酸鉀：天津市風船化學試劑科技有限公司；硫酸銅：博歐特（天津）化工貿易有限公司。

1.3 主要儀器設備

無菌操作臺 江蘇蘇凈集團有限公司；立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；顯微鏡 日本SANYO公司；GC-MS（ISQ7000）氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 日本島津公司；酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；自動凱氏定氮儀 山東海能科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 總酸測定

根據GB 12456—2021規(guī)定的方法測定[8]。

1.4.2 氨基酸態(tài)氮測定

根據GB 5009.235—2016規(guī)定的方法測定[9]。

1.4.3 全氮測定

稱取0.2 g硫酸銅與3 g硫酸鉀至消化管內，并加入10 mL濃硫酸以及10 mL稀釋10倍后的樣品液，設置儀器溫度為200 ℃，保持40 min，再調節(jié)至300 ℃，保持30 min，最后調節(jié)至420 ℃，保持90 min，待反應體系冷卻至室溫后，使用自動凱氏定氮儀蒸餾5 min，用0.1 mol/L的鹽酸標準液進行滴定，顏色出現(xiàn)紫紅色為滴定終點，并記錄鹽酸消耗量，同時做空白對照。

1.4.4 還原糖測定

還原糖含量根據DNS法進行測定[10]。

1.4.5 醬汁中酵母細胞數的變化及生長狀態(tài)觀察

醬汁中酵母細胞數的變化采用血球計數板進行測定。在計數板中央滴1滴0.1%呂氏堿性美藍染色液，取稀釋至適當倍數的樣品稀釋液加入染色液中混勻，染色2～3 min，加蓋玻片，在顯微鏡下進行觀察，計數變藍的細胞。計數使用25×16型計數板，取左上、左下、右上、右下以及中間5個大格內的細胞。每個樣品重復計數3次，并計算死亡率。

25×16型血球計數板計算公式：

酵母菌細胞數（mL）=80小格內酵母菌總數80×400×10×1 000×稀釋倍數。

死亡率=死細胞總數總細胞數×100%。

1.4.6 醬醪中酵母菌落數的變化

根據GB 4789.15—2016進行測定[11]。高鹽稀態(tài)醬醪用無菌生理鹽水進行稀釋后，選取3個適宜稀釋度樣品懸液吸取100 μL涂布于YPD固體培養(yǎng)基，每個梯度進行3次重復實驗，30 ℃下培養(yǎng)3 d，根據國標要求進行計數。

1.4.7 醬油風味變化

醬油中風味物質的測定采用固相微萃取-氣質聯(lián)用的方法。

1.5 結果分析

利用SIMCA 14.1對數據進行分析；采用Origin軟件進行作圖分析。

2 結果與分析

不同鹽含量對醬油各項指標有重要影響，總酸、氨基酸態(tài)氮、全氮和還原糖是反映醬油品質的重要指標，與醬油發(fā)酵有著密切的聯(lián)系。為確保后續(xù)實驗在正常發(fā)酵條件下進行，首先對不同鹽含量發(fā)酵醬油的各項理化指標進行測定。

2.1 醬油總酸含量變化

總酸是醬油的重要理化指標，適量的總酸可以緩和因含鹽量過高而帶來的咸味，使滋味變得柔和，這些酸類物質與醬油中的酯類物質可進一步發(fā)生反應，豐富醬油的風味物質[12]。不同鹽含量發(fā)酵組醬油的總酸含量變化見圖1。

由圖1可知，3組樣品在發(fā)酵0～30 d內總酸含量呈快速上升狀態(tài)，之后上升緩慢，這是因為在發(fā)酵前期各類酶活力相對旺盛，原料中的大分子物質逐漸分解為小分子產物，酸類物質增多，一些耐鹽性產酸微生物的生長等都使得前期總酸含量增加；發(fā)酵結束時，3組總酸含量分別為2.00，1.86，1.81 g/dL。整個發(fā)酵期間，鹽含量越高的發(fā)酵組其總酸含量越低，即12%＞16%＞20%，這種現(xiàn)象可能是由于鹽含量的降低對一些產酸微生物的抑制作用減弱。

2.2 醬油氨基酸態(tài)氮含量變化

氨基酸態(tài)氮是以氨基酸形式存在的氮的總和，是醬油分級的重要標準之一。不同鹽含量發(fā)酵組醬油的氨基酸態(tài)氮含量變化見圖2。

由圖2可知，3組氨基酸態(tài)氮均隨發(fā)酵時間的延長而逐漸增加，各類酶活力旺盛，對原料分解迅速，導致前期增加較快，同時由于高濃度鹽水的加入，原料中被分解的可溶性氮和鹽水在滲透壓的作用下發(fā)生交換現(xiàn)象，也使其含量快速增加。發(fā)酵后期整個體系中的酶活力下降，各類微生物的代謝也消耗掉部分氨基酸態(tài)氮，最終使氨基酸態(tài)氮含量增加緩慢[13]。發(fā)酵結束時，3組醬油的氨基酸態(tài)氮含量分別為1.19，1.07，0.98 g/dL，均達到國標中對特級醬油的要求。在發(fā)酵期間，鹽濃度越高的組別其氨基酸態(tài)氮含量越低，這是因為鹽分降低后微生物含量更豐富，對酶活的抑制作用更低，導致氨基酸態(tài)氮含量更高。

2.3 醬油全氮含量變化

全氮是醬油中可溶性含氮化合物的總稱，既包括原料和菌體中蛋白質水解產生的游離氨基酸，也包括發(fā)酵過程中蛋白質過度分解產生的游離氨基酸、多肽氮、菌體自溶后釋放的核酸類水解物等，是衡量原料利用率和醬油優(yōu)劣的重要指標[14]。3組醬油全氮含量的變化見圖3。

由圖3可知，3組醬油全氮含量的變化均呈現(xiàn)在前30 d左右時增加較快隨后緩慢增加至穩(wěn)定狀態(tài)的趨勢，最終發(fā)酵結束時3組醬油全氮含量分別為1.70，1.67，1.59 g/dL，全氮含量均達到國標要求。

2.4 醬油還原糖含量變化

在發(fā)酵過程中，淀粉質原料在糖化酶、淀粉酶等的作用下被分解為還原糖，醬油的口感、風味、色澤等都與還原糖含量密切相關。不同鹽含量發(fā)酵組醬油的還原糖含量變化見圖4。

由圖4可知，3組醬油還原糖含量均呈現(xiàn)先快速上升后逐漸降低至穩(wěn)定波動的趨勢，在發(fā)酵第15天時，3組醬油還原糖含量均達到最大值，分別為4.20，4.39，4.64 g/dL。發(fā)酵初期，淀粉酶等活力旺盛，能快速將淀粉質原料水解成葡萄糖、麥芽糖等還原糖，因此前期還原糖含量快速升高，此時還原糖生成速度高于消耗速度。隨著發(fā)酵時間增加，酶活力下降，生成還原糖速度降低，并且酵母菌的加入消耗還原糖，形成醇類、酯類等風味物質，所以還原糖含量降低[15]。發(fā)酵后期，醬醪中pH下降，微生物活動受到抑制，導致還原糖含量趨勢逐漸變緩。

綜合以上理化指標，3組醬油發(fā)酵均為正常發(fā)酵，可繼續(xù)進行后續(xù)實驗。

2.5 醬汁中酵母細胞數變化

自溶程度目前并沒有較明確的判斷指標，國外研究者通過實驗指出可測定培養(yǎng)液中的腺苷酸激酶含量來判定酵母自溶，但此方法所用儀器較難獲得；ASBC報道，在酵母自溶過程中，游離脂肪酸辛酸和癸酸的含量與其自溶有關，但測定方法較復雜[16—17]。氯化鈉常作為一種經濟、安全的促溶劑應用于菌體自溶中，氯化鈉可以提高胞外滲透壓，導致細胞質壁分離，質壁分離達到一定程度會引起細胞降解、胞內物質外溢[18]。細胞數的變化可以反映出酵母自溶的程度，首先利用醬汁模擬發(fā)酵，通過美藍染色法區(qū)分活細胞與死細胞或者代謝作用微弱的衰老細胞，可初步判斷發(fā)酵中酵母的自溶程度。

由圖5可知，在發(fā)酵前期，3組細胞數均快速上升，后期緩慢下降，在發(fā)酵17 d左右時，3組酵母細胞數均達到最大值，分別為2.45×107、2.2×107、2.1×107? 個/mL。在發(fā)酵過程中，高鹽發(fā)酵組的酵母細胞數始終低于低鹽發(fā)酵組。由圖6可知，鹽度越高的發(fā)酵組其細胞死亡率也逐漸升高，20%鹽度發(fā)酵組細胞死亡率達到79.2%，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是細胞長期處于高鹽環(huán)境下，使得細胞內外的滲透壓發(fā)生變化，胞內水分流失，影響細胞的增殖，膜內外壓力的變化使細胞出現(xiàn)收縮或死亡，導致后期細胞數出現(xiàn)下降，活細胞減少[19]。這說明高濃度的氯化鈉可以加速細胞的衰老死亡，促使酵母細胞更快地出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

在顯微鏡下分別觀察了發(fā)酵前期和發(fā)酵后期酵母細胞的出芽現(xiàn)象（見圖7），a～c是發(fā)酵前期在顯微鏡下觀察到的酵母生長圖，視野中可以看到大量酵母細胞出芽旺盛，通過染色發(fā)現(xiàn)，只有個別酵母細胞被染為藍色，顯示了活細胞氧化還原性強的特征；d～f為發(fā)酵后期時顯微鏡觀察圖，視野內可觀察到的細胞數目明顯減少，大多細胞以單細胞形式存在，只有極少數存在出芽現(xiàn)象，染色后觀察到同一視野內的細胞多數被染為藍色，這與整體酵母細胞數的變化趨勢相對應，前期快速增加，后期緩慢下降，且細胞并不是全部死亡，仍有部分細胞處于出芽繁殖，說明自溶是一個長期的過程。

2.6 醬醪中酵母菌落數變化

醬汁模擬發(fā)酵并不能完全代表真實發(fā)酵體系中酵母自溶的程度，因此測定了醬醪發(fā)酵過程中酵母菌落數的變化情況，其數量變化見圖8。

酵母初始接入量為1×106CFU/g，酵母加入當天計為第0天，每隔15 d進行一次取樣。由圖8可知，在酵母加入初期，3組酵母菌落數量與加入第0天相比均增加，在加入第15天時，12%發(fā)酵組菌落數量達到最大值，為1.2×106 CFU/g，而此時16%與20%兩組其數量較第0天有所下降，這是因為高濃度氯化鈉對酵母細胞的抑制作用增強，細胞正常生長繁殖能力下降，導致生長能力滯后；而到第30天時，20%和16%兩組酵母菌落數量達到最大值，分別為1.02×106，1.1×106 CFU/g，說明此時酵母已經適應高鹽環(huán)境，能夠生長繁殖。30 d之后，3組菌落數均出現(xiàn)了不同程度的下降，到第90天時，20%發(fā)酵組已無菌落生長，16%和12%兩組仍有菌落生長，但與前期相比數量下降明顯，只有9×103，1.8×104 CFU/g；繼續(xù)監(jiān)測至第105天，3組均無菌落生長。這一現(xiàn)象表明酵母在整個發(fā)酵過程中可以進行較徹底的自溶，這一變化趨勢與上述醬汁模擬發(fā)酵中細胞數的變化趨勢相似，進一步證明了氯化鈉濃度對酵母自溶的影響。

2.7 酵母自溶對醬油風味的影響

自溶是一個緩慢且長期的過程，這一過程中會釋放自溶產物并對醬油風味產生影響，對成品醬油利用GC-MS進行風味物質檢測，結果見圖9。

由圖9可知，3組醬油樣品共檢測出155種香氣化合物成分，其中醇類物質27種，醛類物質20種，酚類物質5種，酮類物質21種，酯類物質34種，酸類物質10種，吡嗪類物質10種，呋喃類物質3種，烷烴類物質10種以及其他類化合物15種。其中20%發(fā)酵組中酯類物質最多，12%發(fā)酵組中酸類物質最多。

為區(qū)分不同發(fā)酵組中的差異風味代謝物，采用偏最小二乘回歸方程的方法（PLS-DA模型）對不同條件下的樣本進行分析。由圖10可知，不同樣本間得到了較好的分離，20%鹽濃度發(fā)酵組分布在第一象限，12%發(fā)酵組分布在第三象限，16%發(fā)酵組分布在第四象限。進一步采用VIP值篩選不同條件下的差異代謝物，進行200次假設驗證，選取VIP值大于1的物質，即為不同樣本間的差異代謝物，共篩選出24種差異代謝物，差異代謝物聚類分析見圖11。

差異代謝物中醇類物質有7種，包括苯乙醇、1-辛烯-3-醇、異戊醇、乙醇、2-甲基丁醇、（2S，3S）-（+）-2，3-丁二醇、反式-2-辛烯-1-醇，醇類物質是醬油的主要呈香物質，1-辛烯-3-醇帶有蘑菇香氣，使醬油鮮香醇厚，苯乙醇可賦予醬油蜂蜜的香氣，異戊醇具有麥芽香氣，能賦予醬油濃郁感[20]。由圖11可知，12%發(fā)酵組醇類物質含量最高，結合酵母細胞數和菌落數在發(fā)酵過程中的變化分析這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因是酵母在低濃度氯化鈉中抑制作用較小，細胞正常生長，其代謝產生的風味物質含量較高。20%和16%兩組醇類物質含量降低，一方面是由于高濃度氯化鈉的抑制作用使酵母細胞數量出現(xiàn)差異，另一方面是在氯化鈉作用下，醬醪中的酵母細胞被破壞，酵母自溶進程加快，風味物質在發(fā)酵過程中釋放，發(fā)酵結束時部分風味物質含量出現(xiàn)降低。

酸類物質包括醋酸、異戊酸、2-甲基丁酸，由圖11可知，酸類物質含量在12%發(fā)酵組中最高，其原因與氯化鈉對微生物的抑制作用減弱、微生物的產酸增加有關，同時也與理化指標中12%發(fā)酵組總酸含量最高相一致。異戊酸和2-甲基丁酸具有奶酪香，可以豐富醬油的香氣，但是過多的酸類物質則會使醬油產生不良風味。

醛類物質有6種，包括苯乙醛、苯甲醛、異戊醛、2-甲基丁醛、2，4-二甲基苯甲醛、反-2-辛烯醛；醛類物質在醬油中的含量一般較少，但微量的醛類對醬油的香氣成分有著一定的調和作用，這些物質可為醬油提供花香、杏仁香、咖啡可可香、蘋果香等氣味，都是醬油中的關鍵香氣化合物。

酯類物質有4種，分別是苯乙酸甲酯、乙酸乙酯、亞油酸甲酯、反式-13-十八烯酸甲酯。酯類物質具有香甜、濃郁柔和的味道，可以使關鍵香味更加醇厚，起到掩蓋不良風味、減淡咸味的作用，酯類物質除了酯化反應生成外，酵母的酯酶還可以將游離脂肪酸游離出來，進一步轉化為酯類物質[21]。其中乙酸乙酯、苯乙酸乙酯在12%發(fā)酵組中含量最高，導致酯類物質含量降低的原因可能是酯酶被降解以及前體物醇類被消耗。

呋喃酮類物質5-乙基-4-羥基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮可以為醬油提供焦糖香氣，緩和鹽味，有研究指出這類物質主要是由醬油釀造原料中的D-木酮糖-5-磷酸在酵母的作用下生成的[22]。

吡嗪類物質包括川芎嗪和2，3，5-三甲基吡嗪，酮類物質包括3-辛酮。

3 結論

本文以工業(yè)發(fā)酵用菌種魯氏接合酵母為研究對象，設置不同鹽度發(fā)酵組，考察氯化鈉濃度對酵母自溶的影響以及成品醬油風味的變化。醬汁中酵母細胞以及醬醪中菌落數的變化均說明高濃度的氯化鈉會抑制酵母細胞生長，加速酵母的死亡，促進酵母提前出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，無法充分參與醬醪成熟與風味物質的生成，同時因自溶提前使風味物質揮發(fā)；12%發(fā)酵組的抑制作用不明顯，微生物快速生長，風味分析發(fā)現(xiàn)酸類物質含量明顯高于其他兩組。綜合考慮認為，16%發(fā)酵組更有利于醬油發(fā)酵，一方面酵母在發(fā)酵中可以徹底完成自溶且自溶進程并不會提前，另一方面對產酸微生物等有較強的抑制作用，有利于促進醬油綜合風味的形成。該研究為評價醬油發(fā)酵過程中酵母自溶現(xiàn)象以及進一步提升醬油風味提供了一定依據。

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