林潔 黃云美 王娟 黃炳臣 朱曉瑩

【摘要】 目的 探討成纖維細(xì)胞生長因子受體4（FGFR4）和白細(xì)胞表面蛋白CD44在乳腺癌四種分子分型中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法 收集120例僅經(jīng)手術(shù)切除的乳腺癌病例標(biāo)本制成的組織蠟塊，四種分子分型各30例；用免疫組化染色法（SP法）檢測上述標(biāo)本中FGFR4和CD44的表達(dá)情況，探討兩者在乳腺癌不同分子分型中的表達(dá)差異。結(jié)果 乳腺癌分子分型與腫瘤大小、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；不同分子分型患者年齡分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。FGFR4在Luminal A型、Luminal B型、Her-2過表達(dá)型及基底細(xì)胞型乳腺癌中的陽性率分別為 53.3%（16/30）、50.0%（15/30）、83.3%（25/30）及83.3%（25/30），CD44的陽性表達(dá)率分別為43.3%（13/30）、40.0%（12/30）、73.3%（22/30）及80.0%（24/30）。FGFR4和CD44在乳腺癌四種分子分型的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；其中FGFR4在Her-2過表達(dá)型乳腺癌和基底細(xì)胞型乳腺癌的表達(dá)高于Luminal B型乳腺癌（P＜0.008），CD44在基底細(xì)胞型乳腺癌的表達(dá)高于Luminal A型、Luminal B型（P＜0.008）。結(jié)論 FGFR4和CD44在Her-2過表達(dá)型和基底細(xì)胞型乳腺癌中的表達(dá)較高，提示它們可能影響乳腺癌的分子表型。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌；成纖維細(xì)胞生長因子受體4；CD44；免疫組化；分子分型

中圖分類號：R737.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.06.008

Expression and clinical significance of FGFR4 and CD44 protein in different molecular subtypes of breast carcinoma

LIN Jie^{1， 2}， HUANG Yunmei^{1， 2}， WANG Juan^{1， 2}， HUANG Bingchen^{1， 2}， ZHU Xiaoying^{1， 2}

（1. Clinical Pathological Diagnosis and Research Center， Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China; 2. Department of Pathology， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To investigate the expression of fibroblast growth factor receptor 4 （FGFR4） and leukocyte surface protein CD44 in different molecular subtypes of breast carcinoma and its clinical significance. Methods Tissue wax blocks made from 120 cases of breast carcinoma who only underwent surgical resection were collected， with 30 cases in each of the four molecular types. Immunohistochemical staining （SP method） was used to detect the expression of FGFR4 and CD44 in the above-mentioned samples， and difference of their expressions in different molecular subtypes of breast carcinoma was explored. Results There was no statistically significant difference between molecular typing of breast carcinoma and tumor size， histological grade， lymph node metastasis and TNM stage （P>0.05）. There was statistically significant difference in age distribution among patients with different molecular subtypes （P<0.05）. The positive rates of FGFR4 in Luminal A， Luminal B， Her-2 overexpression type and basal-like breast carcinoma were 53.3% （16/30）， 50.0% （15/30）， 83.3% （25/30） and 83.3% （25/30）， respectively， and the positive rates of CD44 in them were 43.3% （13/30）， 40.0% （12/30）， 73.3% （22/30） and 80.0% （24/30）， respectively. The difference of the expressions of FGFR4 and CD44 in the four molecular subtypes was statistically significant （P<0.01）. Among them， the expression of FGFR4 in Her-2 overexpression type breast carcinoma and basal-like breast carcinoma was higher than that in Luminal B breast carcinoma （P<0.008）， and the expression of CD44 in basal-like breast carcinoma was higher than that in Luminal A and Luminal B （P<0.008）.

Conclusion The higher expressions of FGFR4 and CD44 in Her-2 overexpression type and basal-like breast carcinomas suggest that they may influence the molecular phenotype of breast carcinoma.

【Key words】 breast carcinoma; fibroblast growth factor receptor 4 （FGFR4）; CD44; immunohistochemistry; molecular subtypes

乳腺癌是全球女性發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是一個多基因、多種因素相互作用的復(fù)雜過程^［1］。目前，乳腺癌在病理診斷及臨床治療方面取得了很大的進(jìn)步，其中在診斷方面：乳腺浸潤性癌根據(jù)免疫組化指標(biāo)雌性激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長因子受體（Her-2）、細(xì)胞增殖指數(shù)（Ki67）及各種細(xì)胞角蛋白的陽性表達(dá)結(jié)果分為不同的四種分子亞型^［2］，即Luminal A型（雌、孕激素受體陽性）、Luminal B型（雌、孕激素受體及Her-2均陽性）、Her-2過表達(dá)型（雌、孕激素陰性）及基底細(xì)胞型（雌、孕激素及Her-2均陰性）。根據(jù)此種分型可以進(jìn)行個體化的綜合指導(dǎo)治療，讓乳腺癌患者受益頗多，但乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機制尚未完全明確，乳腺癌患者的總生存率仍不高，而HARRELL等^［3］的一項研究發(fā)現(xiàn)同一分子亞型的乳腺癌存在異質(zhì)性，因此研究乳腺癌的異質(zhì)性，更有利于實施精準(zhǔn)的治療，延長患者的生命。成纖維細(xì)胞生長因子受體4（fibroblast growth factor receptor 4，F(xiàn)GFR4）參與組織的損傷并修復(fù)、新生血管的生成、組織的增殖等多方面的生理過程^［4］。乳腺腫瘤的異質(zhì)性在于腫瘤的細(xì)胞群中留存有腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CScs），其具有介導(dǎo)腫瘤的產(chǎn)生、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的功能；而白細(xì)胞表面蛋白CD44是腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物，是最早被判定出來的乳腺癌干細(xì)胞。FGFR4和CD44兩者在不同分子分型的乳腺癌中的表達(dá)有沒有差異，兩者之間是不是存在協(xié)同關(guān)系，目前尚未有報道。本研究結(jié)合臨床資料，采用免疫組化法檢測不同分子分型的乳腺癌間的FGFR4和CD44的表達(dá)情況及與臨床病理參數(shù)、預(yù)后的相關(guān)性，以便更好地提示乳腺癌的腫瘤異質(zhì)性，為患者提供更為精準(zhǔn)的治療方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的腺體外科2019年1月至2021年1月經(jīng)手術(shù)切除的乳腺癌石蠟標(biāo)本，以免疫組化標(biāo)記物：ER、PR、Her-2、Ki67的陽性表達(dá)情況把乳腺癌分為四個亞型即Luminal A型（ER、PR均陽性，Her-2陰性，Ki67＜14%）、Luminal B型（ER陽性，PR低表達(dá)，Her-2陽性或陰性，Ki67≥14%）、Her-2過表達(dá)型（ER、PR均陰性，Her-2陽性）及基底細(xì)胞型（ER、PR、Her-2均陰性）。收集各亞型乳腺癌患者各30例，共120例。均為女性患者，年齡26～77歲，中位年齡44歲。腫瘤直徑1.1～7.3 cm?；颊呤中g(shù)前均沒有進(jìn)行其他方面的抗腫瘤治療，大病理均診斷為浸潤性癌，非特殊型。其中淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移癌的有17例，淋巴結(jié)沒有出現(xiàn)轉(zhuǎn)移癌的13例。

1.2 方法

組織標(biāo)本使用10%的中性甲醛經(jīng)過常規(guī)的固定、包埋、切片及HE染色（圖1-A、圖1-B）進(jìn)行診斷后，使用免疫組織化學(xué)技術(shù)二步法進(jìn)行染色。所用試劑：一抗為兔抗人FGFR4多克隆抗體（濃縮液），CD44即用型抗體，所用到的二步法免疫組化的檢測試劑盒及DAB試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，按照試劑使用說明進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判讀

免疫組化結(jié)果的判讀，由兩名資歷較高的病理診斷醫(yī)師，利用雙盲方法進(jìn)行判讀。按腫瘤細(xì)胞上色的深淺、陽性細(xì)胞數(shù)目來計算給分。FGFR4陽性為棕色細(xì)胞質(zhì)染色（圖1-C），CD44陽性為棕色細(xì)胞膜染色（圖1-D）。染色強度：陰性為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞數(shù)：＜1%為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。將兩者相加得到總積分，0分記為（-），1～3分記為（+），4～5分記為（2+），6～7分記為（3+），總積分＞3分記為陽性，≤3分記為陰性，以隨機方式取5個不同的高倍鏡視野求其平均積分。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

運用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料采用χ²檢驗，檢驗水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗，組間比較采用 bonferroni 校正的檢驗水準(zhǔn)α=0.05/6=0.008，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各亞型的乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性

不同分子分型的乳腺癌患者在腫瘤直徑、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 不同分子分型組間的年齡分布情況

各亞型的乳腺癌患者，在年齡方面比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中基底細(xì)胞型>50歲占比的例數(shù)高于Luminal A型（P<0.008）。見表2。

2.3 FGFR4和CD44在各亞型的乳腺癌組織和分子分型中的表達(dá)

FGFR4在Luminal A型、Luminal B型、Her-2過表達(dá)型及ER/PR/Her-2基底細(xì)胞型乳腺癌中的陽性率分別為 53.3%（16/30）、50.0%（15/30）、83.3%（25/30）及83.3%（25/30），CD44的陽性表達(dá)率分別為43.3%（13/30）、40.0%（12/30）、73.3%（22/30）及80.0%（24/30）。FGFR4和CD44在Luminal A型、Luminal B型、Her-2過表達(dá)型和基底細(xì)胞型乳腺癌間的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中FGFR4在Her-2過表達(dá)型乳腺癌和基底細(xì)胞型乳腺癌間的表達(dá)相對高于Luminal B型乳腺癌（P＜0.008），CD44在基底細(xì)胞型乳腺癌的表達(dá)相對高于Luminal A型、Luminal B型乳腺癌（P＜0.008）。見表3、表4、表5。

3 討論

現(xiàn)在對于乳腺癌的確診及治療方案日趨成熟，這得益于以ER、PR、Her-2和Ki67作為基礎(chǔ)的乳腺癌的分子分型并對各亞型的乳腺癌患者的個體化治療提供了精準(zhǔn)的指導(dǎo)，患者的預(yù)后得到了明顯的改善。然而治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移依舊是導(dǎo)致乳腺癌患者最終死亡的首要原因，且在臨床治療中發(fā)現(xiàn)具有不同分子分型的乳腺癌患者，在使用同一治療方案后，出現(xiàn)了截然不同的治療效果，這有可能是因為乳腺癌的高度異質(zhì)性所引起的。要實現(xiàn)對乳腺癌患者的精準(zhǔn)醫(yī)療，除了以ER、PR、Her-2和Ki67作為分子分型外，還需要更多的基因和蛋白表達(dá)譜，來尋找新的治療靶點。

FGFR4是分布在多種細(xì)胞上的具有穿膜功能的酪氨酸激酶受體，在胚胎和組織修復(fù)時嚴(yán)格表達(dá)，出生后表達(dá)量明顯下降，且主要分布于腎上腺和肺組織^［5］。在病理狀態(tài)下FGFR4與其配體FGFR19結(jié)合可進(jìn)行二聚化和自磷酸化，通過激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）以及糖原合成酶激酶-3/β-鏈蛋白（GSK3β/β-catenin）等信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。因此FGFR4與其配體結(jié)合后調(diào)控的血管新生、細(xì)胞增殖等相關(guān)的信號通路軸是潛在的治療靶點^［6］。ZHAO等^［7］的研究發(fā)現(xiàn)FGFR19與其受體FGFR4結(jié)合后可促進(jìn)乳腺癌的增殖、侵襲能力，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移。謝靜靜等^［8］的研究發(fā)現(xiàn)FGFR4基因的多態(tài)性與Luminal 型乳腺癌的臨床病理特征無明顯相關(guān)性，但FGFR4中的某些基因型與Her-2過表達(dá)的情況較一致。盡管FGFR4基因的多態(tài)性并沒有增加乳腺癌的環(huán)保風(fēng)險，但會增加乳腺癌的惡性程度，促進(jìn)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移等，且FGFR4基因的突變會降低患者對化療的敏感性，出現(xiàn)極差的預(yù)后^［9］。有研究發(fā)現(xiàn)FGFR4與其配體結(jié)合后可激活細(xì)胞的自分泌信號并介導(dǎo)基底細(xì)胞樣乳腺癌細(xì)胞的增殖分化^［10］。由此抑制此信號通路可明顯降低乳腺癌細(xì)胞的增殖分化，降低其侵襲性。在本研究中，F(xiàn)GFR4在Her-2過表達(dá)型及基底細(xì)胞型乳腺癌中均呈高表達(dá)，且在這兩種類型中的表達(dá)率都高于Luminal A型和Luminal B型乳腺癌。FGFR4在基底細(xì)胞型組與HER2過表達(dá)組中是高表達(dá)的，提示FGFR4與預(yù)后差的分子表型呈正相關(guān) 。乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高的根本原因在于乳腺癌干細(xì)胞的存在^［11］，常規(guī)的抗腫瘤治療只對處于增殖活躍的腫瘤干細(xì)胞有效，但對處于相對靜止?fàn)顟B(tài)的腫瘤干細(xì)胞是無效的。若不能完全清除腫瘤干細(xì)胞，就會為復(fù)發(fā)埋下隱患。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤出現(xiàn)侵襲轉(zhuǎn)移的前提，當(dāng)特殊的干細(xì)胞特性標(biāo)記物如CD44高表達(dá)作用下可加速乳腺癌的轉(zhuǎn)移。CD44表達(dá)于細(xì)胞表面，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，CD44與其配體結(jié)合后可引起構(gòu)象的改變，導(dǎo)致與細(xì)胞增殖和遷移的相關(guān)信號通路的激活。本研究中CD44在基底細(xì)胞型乳腺癌中的表達(dá)水平顯著增高（80.0%），在Her-2過表達(dá)型的乳腺癌中的表達(dá)率為（73.3%）。ZOU等^［12］的研究表明，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的基底細(xì)胞型乳腺癌患者CD44的陽性率比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者要高。90%以上的原發(fā)性乳腺癌在轉(zhuǎn)移過程中都要經(jīng)過細(xì)胞的重編程，包括上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)化（EMT）。羅明華等^［13］采用PT-PCR法研究發(fā)現(xiàn)CD44mRNA分子在基底細(xì)胞型乳腺癌中的表達(dá)水平高于激素受體陰性組織。這與基底細(xì)胞型乳腺癌的腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT相關(guān)聯(lián)。在某些特定的微環(huán)境中可發(fā)生EMT，因為CD44能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞黏附到內(nèi)皮屏障，并促進(jìn)組織內(nèi)的局部侵襲、定植。YANG 等^［14］的研究也證實了在腫瘤微環(huán)境中，某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)化和出現(xiàn)侵襲轉(zhuǎn)移的主要誘因。總之，CD44在增強上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和乳腺癌形成中的作用與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化獲得促進(jìn)干細(xì)胞特性是一致的。本研究中CD44在基底細(xì)胞型乳腺癌患者中的表達(dá)比非基底細(xì)胞型乳腺癌患者的要高，得到的提示是：CD44的表達(dá)有可能在基底細(xì)胞型乳腺癌的發(fā)病機制中發(fā)揮著一定的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)CD44在各亞型中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在Her-2過表達(dá)型和基底細(xì)胞型乳腺癌中的表達(dá)相對要高些。這與李玉冰等^［15］的研究相一致。但有研究卻發(fā)現(xiàn)CD44的表達(dá)在Luminal A型乳腺癌中相對更高，而另外的研究者卻提出CD44在基底細(xì)胞型乳腺癌中的表達(dá)比其他亞型明顯增高^［16］。造成這些表達(dá)結(jié)果的差異性，可能是與免疫組織化學(xué)染色方法和判讀標(biāo)準(zhǔn)的不同相關(guān)。本研究結(jié)果提示CD44與乳腺癌出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性。此外，還發(fā)現(xiàn)了FGFR4和CD44兩者均在基底細(xì)胞型乳腺癌中有更高的表達(dá)，這也進(jìn)一步提示其與預(yù)后差的分子表型呈正相關(guān) ，但并未發(fā)現(xiàn)二者之間存在協(xié)同作用，可能需要加大樣本量，并建立更加精確和細(xì)化的分子分型，才能為乳腺癌患者的精準(zhǔn)醫(yī)治指明新的方向。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2022-06-07 修回日期：2022-08-25）

（編輯：梁明佩）