三七根際耐皂苷木霉菌的分離鑒定及其拮抗促生活性評價

李 玥 羅麗芬 王烜東 李夢琪 朱書生 楊 敏

(云南農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院/農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室/ 云南生物資源保護與利用國家重點實驗室,昆明 650201)

三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. Chen]為五加科人參屬多年生草本植物,常以根莖入藥,性溫,具有補血益氣和消腫止痛等功效,是我國特有的傳統(tǒng)名貴中藥材[1]。因其具有特殊功效,自古以來備受青睞,迄今已有400余年的馴化栽培歷史,云南省文山州和廣西壯族自治區(qū)靖西市為其歷史上的道地產(chǎn)區(qū)[2]。目前,云南為三七的主產(chǎn)區(qū),種植面積和產(chǎn)量均占全國的98%以上[3]。然而,三七連作障礙問題日益突出,根腐病發(fā)病率大幅度增加,嚴重影響三七的產(chǎn)量和品質(zhì),導致道地產(chǎn)區(qū)無地可種,三七種植逐漸向非道地產(chǎn)區(qū)轉(zhuǎn)移,連作障礙已經(jīng)成為三七產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要限制因素[4-5]。大部分種植戶為提高三七產(chǎn)量,在栽培過程中主要通過大量施用化學農(nóng)藥控制病害,導致三七農(nóng)藥殘留超標,嚴重影響藥材品質(zhì)[6]。因此如何解決或緩解連作障礙成為三七種植中亟待解決的難題。

三七連作障礙是多種因素共同作用的結(jié)果,包括土壤理化性質(zhì)的惡化、養(yǎng)分失衡、土傳病害、自毒作用和菌群失衡等[7]。前期研究發(fā)現(xiàn),三七生長過程中通過根系分泌或殘體降解釋放到根際土壤中的皂苷類等物質(zhì)一方面會對三七根系產(chǎn)生自毒作用,導致植株生長受阻[8];另一方面低濃度的皂苷可促進三七根腐病病原菌如惡疫霉菌(Trichodermaviride)、茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)及毀滅柱孢菌(Cylindrocarpondestructans)等的生長,使其能夠在根際大量擴繁和定殖[9-10]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)三七在生長過程中,通過根系分泌或殘體降解釋放到根際土壤中的代謝物驅(qū)動根際微生物結(jié)構(gòu)和功能失衡[11],導致病原菌增加而有益菌降低,使三七發(fā)生嚴重的根腐病和連作障礙。

木霉菌(Trichodermaspp.)是一種廣泛存在于土壤和植物根部等環(huán)境中的真菌,對多種植物具有良好的促生活性,能夠誘導植株抵抗環(huán)境中的生物和非生物脅迫,還能拮抗病原菌達到防治植物病害的效果[12-13]。自Weindling[14]發(fā)現(xiàn)木霉菌具有拮抗病原微生物的功能以來,諸多研究者對木霉菌的功能及生防機制開展了廣泛的研究,研究結(jié)果表明木霉菌可以通過競爭生態(tài)位點、重寄生、產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)和誘導寄主植物產(chǎn)生抗性等多種機制發(fā)揮生防功能[15]。近年來,木霉菌作為一種重要的生防制劑已經(jīng)成為化學農(nóng)藥替代化和減量化的主要產(chǎn)品,也是公認的最有前途的生防因子之一[16]。廣泛用于植物病害防治的木霉菌主要有哈茨木霉(T.harzianum)、綠色木霉(T.viride)和康寧木霉(T.koningii),主要應(yīng)用于辣椒、番茄和黃瓜等作物上[17],對三七等連作障礙嚴重的研究較少。課題組前期通過對種植前后的三七根際微生物高通量測序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),三七種植后根際木霉菌的相對豐度明顯降低,且三七根系分泌的特有物質(zhì)皂苷對木霉菌菌絲生長具有明顯的抑制活性[18]。這可能會極大影響木霉菌在三七根際的定殖效果,導致已有的具有優(yōu)良促生拮抗活性的木霉菌株在三七根腐病防治中的應(yīng)用受到限制。但是,目前還未見兼具耐皂苷和拮抗三七根腐菌的木霉菌的相關(guān)研究。因此,本研究從植物-根際微生物互作的角度出發(fā),分離篩選出耐皂苷且具有拮抗活性的木霉菌株,并通過盆栽試驗明確其促生效果及其對根腐病的防治效果,以期為通過調(diào)節(jié)木霉菌豐度緩解三七連作障礙提供理論支撐,同時也為三七根腐病的綠色防治提供生防資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土樣:供試三七土樣均采自云南省昆明市尋甸縣。取一年生健康三七植株,抖落根圍土壤,用無菌毛刷輕刷三七根系收集土壤,獲得三七根際土壤用于后續(xù)試驗。采集種植過五年三七的連作土壤充分混勻后裝于花盆中待用。

供試植株:將三年生三七種子播種于裝有滅菌土的花盆中,每盆播種10粒種子,出苗后保持正常的水肥管理,待其生長6個月后用于木霉菌促生防病效果評價。

供試菌株:惡疫霉菌D-1(P.cactorumD-1)、尖孢鐮刀菌Z4(F.oxysporumZ4)、茄腐鐮刀菌F3(F.solaniF3)、雪腐鐮刀菌M(MonographellacucumerinaM)和毀滅柱孢菌RS6(C.destructansRS6)均由云南農(nóng)業(yè)大學生物多樣性與病害控制實驗室從三七根腐病病株中分離獲得,并經(jīng)過形態(tài)和致病性鑒定。

供試培養(yǎng)基:孟加拉紅瓊脂(Rose bengal agar,RBA)培養(yǎng)基成分:葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂20 g、孟加拉紅0.033 g、氯霉素0.1 g,蒸餾水1 L,pH 7.0～7.2;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基成分:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g,蒸餾水1 L,pH 6.5～7.0;水瓊脂(Water aga,WA)培養(yǎng)基成分:瓊脂18 g,蒸餾水1 L,pH 6.8～7.2。

1.2 供試試劑及儀器

真菌基因組DNA快速抽提試劑盒和DNA Marker購自生工生物工程(上海)有限公司,2×TaqPCR Master Mix購自北京擎科生物科技有限公司,其余試劑均為國產(chǎn)分析純。供試儀器:BX43F光學顯微鏡(Olympus公司,日本),ZHWY-111B搖床(智誠分析儀器制造有限公司,上海),2720 Thermal cycler PCR儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司,上海),5804R 低溫高速離心機(Eppendorf公司,德國),JY300C電泳儀、JYDF電泳槽和JY04S-3C凝膠成像儀(君意東方電泳設(shè)備有限公司,北京),DFD-700水浴鍋(中興偉業(yè)儀器有限公司,北京),Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥儀(Christ公司,德國),DF-20磨粉機(林大機械有限公司,浙江),SY3100DH超聲波清洗機(聲源超聲波儀器有限責任公司,上海),Rotavapor R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi公司,瑞士),SLI-700恒溫培養(yǎng)箱(愛朗儀器有限公司,上海)。

1.3 方法

1.3.1木霉菌的分離及純化

稱取5 g一年生健康三七根際土,加入盛有45 mL滅菌水的200 mL錐形瓶中,置于搖床上(180 r/min)振蕩30 min,靜置10 min后得到的上清液即為稀釋度為10-1g/mL的土壤懸浮液。用移液槍吸取1 mL土壤懸浮液至裝有9 mL無菌水的試管中,使其充分混勻后再按梯度稀釋到10-3和10-4g/mL;分別吸取各梯度的稀釋液100 μL均勻涂布于RBA平板上,于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,挑取平板上菌落邊緣的少量菌絲至PDA平板上純化培養(yǎng)3次,對純化培養(yǎng)得到的菌株進行編號。挑取形態(tài)不同疑似木霉菌的菌株進行培養(yǎng),待長出菌落后,挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)移至另一平板的中央進行反復(fù)純化培養(yǎng)。

1.3.2木霉菌孢子對三七根系分泌物敏感性測定

將分離到的木霉菌株接種于PDA平板上25 ℃黑暗條件下培養(yǎng),培養(yǎng)10 d后產(chǎn)孢。將一定量的無菌水加入到長滿產(chǎn)孢菌絲的培養(yǎng)皿中,用滅菌的涂布器輕輕將孢子和菌絲刮下,用滅菌紗布過濾后再使用500目細胞篩過濾得到木霉菌孢子懸浮液。使用血球計數(shù)板在光學顯微鏡下將孢子懸浮液濃度調(diào)整為1.0×106CFU/mL。

將一年生三七植株從土壤中取出,在不傷及根系的前提下,用清水清洗去除根系上附著的土壤顆粒;用滅菌水沖洗3遍,將植株根系放入盛有100 mL無菌水的滅菌組培瓶中,每瓶裝入8株三七苗,并使蒸餾水的體積剛好能浸沒根系,使用封口膜將瓶口封好。將裝有三七苗的組培瓶置于搖床上,培養(yǎng)24 h后取出根系,將收集到的根系分泌物用0.22 μm的有機相濾膜過濾后,于冷凍干燥儀中進行冷凍干燥,得到粉末狀根系分泌物固體[19-20]。

將三七根系分泌物粉末溶于無菌水后得到三七根系分泌物,按V(三七根系分泌物)∶V(木霉菌孢子懸浮液)=1∶1比例進行混合,得到終濃度為含0.5和2.5 mg/mL三七根系分泌物的孢子懸浮液;以加入等量無菌水與木霉菌孢子液混合為對照,充分混勻后吸取100 μL均勻涂布于WA平板上。每組處理設(shè)置3個重復(fù),將其置于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)18 h后,置于光學顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況。隨機選取4個視野進行觀察,對視野中的木霉菌孢子總數(shù)及萌發(fā)孢子數(shù)進行計數(shù)。孢子萌發(fā)率=萌發(fā)孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100%。

1.3.3木霉菌對三七皂苷的敏感性測定

參照Yang等[8]方法提取三七粗皂苷。取一年生的三七根部200 g,在40 ℃下烘干36 h,使用打粉機將烘干的三七根研磨至粉狀,用800 mL 80%的甲醇提取液超聲提取40 min后,進行離心。收集上清液,進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。所得到的濃縮液冷凍干燥成粉末狀固體,并置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

參照Zhou等[21]方法將三七粗皂苷樣品利用甲醇溶解后添加到已滅菌且冷卻至55 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中,制成終濃度為1、10、100和1 000 μg/mL的含粗皂苷的PDA平板,以含1%甲醇的PDA平板為對照。挑取木霉菌菌餅(直徑4 mm)分別接種于含不同濃度梯度粗皂苷的PDA平板上進行培養(yǎng)。每個處理設(shè)置5個重復(fù),置于25 ℃下黑暗培養(yǎng)48 h后采用“十字交叉法”測量木霉菌菌落直徑。

菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑- 處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

1.3.4耐皂苷木霉菌的鑒定

將純化后的耐皂苷木霉菌株25 ℃黑暗培養(yǎng)3和7 d后參考Gams等[22]方法對菌落形態(tài)觀察記錄,并在光學顯微鏡下觀察分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)特征,初步確定菌株的分類地位。

采用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取木霉菌基因組DNA。使用真菌通用引物ITS1和ITS4進行菌株rDNA-ITS區(qū)的PCR擴增,引物由生工生物工程(上海)公司合成。擴增體系:2×TaqPCR MasterMix10 μL,ITS1引物(10 pmol/μL) 1 μL,ITS 4引物(10 pmol/μL) 1 μL,DNA模板3 μL,ddH2O 10 μL;擴增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至昆明擎科生物科技有限公司進行測序。測序結(jié)果上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST序列比對和同源性分析,其他參考序列從GenBank(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)下載;并用MEGA 11軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,設(shè)置1 000次Bootstraps檢驗,進行菌株分子生物學鑒定。

1.3.5耐皂苷木霉菌對三七主要根腐病病原菌拮抗活性測定

挑選2株對三七根系分泌物和粗皂苷均不敏感的木霉菌株作為耐皂苷菌株進行活化,并對三七主要根腐病病原菌惡疫霉菌D-1、毀滅柱孢菌RS6、茄腐鐮刀菌F3、尖孢鐮刀菌Z4和雪腐鐮刀菌M分別進行活化;待生長5 d后,用5 mm滅菌打孔器分別在木霉菌株與根腐病病原菌的菌落邊緣打取菌餅;將兩者同時接種在同一PDA平板上,2個菌餅之間的距離約為5.5 cm。在一側(cè)接種病原菌,另一側(cè)接種空白PDA菌餅為對照。每個處理設(shè)置6個重復(fù),于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3 d后測量根腐病病原菌的菌落半徑,并計算木霉菌株對病原菌的抑制率。

抑制率=(對照菌落半徑-處理菌落半徑)/ 對照菌落半徑×100%

1.3.6耐皂苷木霉菌對三七生長的影響效果測定

選取植株長勢均一的三七盆栽,使用等量的水充分澆透后放置一晚,次日灌根。將2株耐皂苷木霉菌株大量擴繁產(chǎn)孢后,參照1.3.2中制備孢子懸浮液的方法,制成濃度為5.0×106CFU/mL的木霉菌液進行灌根,每盆灌菌液50 mL,以灌等量無菌水為對照。每個處理設(shè)置6個重復(fù),每隔7 d灌1次,共灌4次。將植物置于用聚乙烯網(wǎng)遮蔭的大棚中,允許10%～30%的光透射,以模擬三七自然生長條件。最后一次灌菌處理后30 d采集三七植株樣品,將三七整株洗凈后稱量植株地上部和地下部的鮮重,40 ℃烘干至恒重后稱量其干重。

1.3.7耐皂苷木霉菌株在根際土中的定殖效果測定

參照趙微等[23]方法將2株耐皂苷木霉菌株分別接種于含10 μg/mL利福平的PDA培養(yǎng)基中25 ℃暗培養(yǎng)2 d。挑取菌落形態(tài)與初始菌株相似的單菌落,依次接種于含50、80、100和200 μg/mL利福平的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng),直至篩選出能在含200 μg/mL利福平的PDA平板上穩(wěn)定生長的木霉菌株作為標記菌株。

將標記菌株在含200 μg/mL利福平的PDA平板上培養(yǎng)14 d進行產(chǎn)孢,并參照1.3.2中制備孢子懸浮液的方法制成濃度為5.0×106CFU/mL的木霉菌孢子懸浮液,并灌50 mL至連作土中,以灌等量無菌水為對照;放置3 d后移栽三七苗,每盆移栽8株,每一處理設(shè)置12個重復(fù)。將其置于用聚乙烯網(wǎng)遮蔭的大棚中,允許10%～30%的光透射,移栽成活后每隔10 d統(tǒng)計一次存苗率,30 d后統(tǒng)計連作土中三七的根腐發(fā)病率,以評價2株耐皂苷菌株對三七連作障礙的緩解效果;同時采集三七根際土對標記的木霉菌株進行定殖檢測,根際土中木霉菌的分離方法同1.3.1,得到10-1和10-2g/mL土壤懸浮液后涂布于含200 μg/mL利福平的PDA平板上,25 ℃黑暗培養(yǎng)2 d后進行木霉菌落計數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2019進行數(shù)據(jù)處理及圖表制作,采用SPSS 26.0軟件中Duncan氏新復(fù)極差法和獨立樣本t檢驗對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐三七根系分泌物的木霉菌篩選

經(jīng)分離純化從一年生健康三七根際土壤中共獲得6株木霉菌株,分別命名為T3、T4、T5、T19-1、T20和T25。6株木霉菌株對三七根系分泌物具有不同程度的敏感性(表1),供試濃度的根系分泌物對T3和T20菌株的孢子萌發(fā)無顯著抑制活性;其余4株木霉菌的孢子萌發(fā)均受到高濃度(2.5 mg/mL)根系分泌物的顯著抑制。

表1 三七根系分泌物對木霉菌孢子萌發(fā)率的影響

2.2 耐三七皂苷的木霉菌篩選

所分離到的6株木霉菌株對三七粗皂苷表現(xiàn)出不同程度的敏感性,抑制率均隨培養(yǎng)基中皂苷濃度的增加而升高(表2)。其中菌株T5雖在皂苷濃度為1和10 μg/mL時能顯著促進菌絲的生長,但當皂苷濃度為100和1 000 μg/mL時,則顯著抑制了菌絲生長,表現(xiàn)出較強的敏感性。濃度為1 000 μg/mL皂苷對菌株T4和T25抑制率分別為14.63%和13.86%;對高濃度皂苷敏感性較弱的為T3和T20菌株,濃度為100 μg/mL皂苷對其抑制率分別為1.63%和1.24%,濃度為1 000 μg/mL皂苷對其抑制率分別為4.56%和7.59%。因此,結(jié)合木霉菌對三七根系分泌物及三七皂苷的敏感性結(jié)果,選擇T3和T20菌株作為耐皂苷木霉菌株進行后續(xù)試驗。

表2 三七皂苷對木霉菌的抑制率

2.3 耐皂苷木霉菌的鑒定

2.3.1形態(tài)學鑒定

T3菌株和T20菌株2株耐皂苷木霉菌在PDA培養(yǎng)基上均生長迅速,3 d便可長滿整個培養(yǎng)皿。T3菌株菌落正面呈羊毛氈狀,初期為白色,后為綠色,背面后期逐漸由白色變?yōu)闇\綠色;分生孢子梗細長彎曲,安瓿瓶狀,次級分枝對生,可產(chǎn)生大量分生孢子;分生孢子綠色,橢圓形或卵圓形,簇生于小梗頂端(圖1(a)～(d))。T20菌株菌絲為絨毛狀,菌落形態(tài)呈現(xiàn)放射狀向四周生長,有規(guī)則狀輪紋,初為白色,后為淡黃色,且菌餅中央伴有菌絲消退現(xiàn)象;分生孢子梗透明呈瓶梗狀多為對稱生長,分生孢子淺綠色,橢圓形或卵圓形(圖1(e)～(h))。

(a)～(b)PDA培養(yǎng)基上T3菌株菌落的正面和背面形態(tài);(c)～(d)T3菌株的分生孢子梗和分生孢子;(e)～(f)PDA培養(yǎng)基上T20菌株菌落的正面和背面形態(tài);(g)～(h)T20菌株的分生孢子梗和分生孢子。 (a)-(b) Frontal and reverse colony morphologies of T3 strain on PDA medium; (c)-(d) Conidiophores and conidia of T3 strain; (e)-(f) Frontal and reverse colony morphologies of T20 strain on PDA medium; (g)-(h) Conidiophores and conidia of T20 strain.

2.3.2分子生物學鑒定

將T3和T20菌株測序結(jié)果輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析,并通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中已登錄菌株的ITS序列進行聚類分析發(fā)現(xiàn):T3菌株與T.viride(KC403962.1)位于同一進化分支,T20菌株與T.viridescens(KU896372.1)位于同一進化分支,相似性為100%(圖2)。結(jié)合形態(tài)學特征將T3菌株鑒定為綠色木霉(T.viride),T20菌株鑒定為漸綠木霉(T.viridescens)。

圖2 基于ITS序列以鄰接法構(gòu)建三七根際耐皂苷木霉菌及相關(guān)近緣種的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 耐皂苷木霉菌對三七主要根腐病病原菌的拮抗活性

平板對峙試驗結(jié)果顯示(表3),木霉T3和T20菌株對5種供試三七主要根腐病病原菌均有較好的抑制活性,其中對惡疫霉菌D-1的抑制效果最好,抑制率分別達到61.76%和70.59%。T3菌株對雪腐鐮刀菌M的抑制活性最低,抑制率為45.83%,對其余病原菌的抑制率為45.98%～51.29%;T20菌株對尖孢鐮刀菌Z4的抑制活性最低,抑制率為36.78%,對其余病原菌的抑制率為45.83%～46.99%。

表3 綠色木霉T3菌株和漸綠木霉T20菌株對三七主要根腐病病原菌的抑制率

2.5 耐皂苷木霉菌對三七的促生效果

使用綠色木霉T3菌液灌根4次后,植株地上部和地下部的單株生物量與澆灌無菌水相比均有所增加,地下部鮮重單株平均增加0.103 g。使用漸綠木霉T20菌液灌根4次后,植株地上部和地下部的生物量也都有所增加,但顯著不差異。表明耐皂苷T3和T20菌株對三七植株尤其是地下部分具有一定的促生效果(表4)。

表4 綠色木霉T3菌株和漸綠木霉T20菌株對三七植株生物量的影響

2.6 耐皂苷木霉菌在根際土中的定殖能力及其對三七連作障礙的緩解效果

2.6.1木霉菌在連作土中的三七根際定殖效果

耐皂苷木霉菌T3和T20菌株能在三七根際定殖,但定殖數(shù)量隨著時間增長表現(xiàn)為降低的趨勢(圖3)。與培養(yǎng)10 d相比,培養(yǎng)20 d后菌株的定殖量變化不大,但培養(yǎng)到30 d時隨著三七的大量死亡以及根腐病的大量發(fā)生,根際耐皂苷木霉T3和T20菌株的定殖量也大幅降低,但在根際土中仍有一定的定殖量,且T20菌株降幅比T3菌株小。

圖3 三七連作土中耐皂苷木霉T3和T20菌株的定殖量

2.6.2木霉菌對三七連作障礙的緩解效果

由表5可以看出,隨三七在連作土中生長時間的延長,存苗率逐漸降低,加入耐皂苷木霉菌后可以明顯降低根腐病發(fā)生,減輕連作障礙。其中T3菌株在灌根10和30 d后的存苗率均高于對照,存苗率分別為92.21%和28.10%;根腐病發(fā)病率顯著降低,為35.12%。T20菌株在灌根10和30 d后存苗率均顯著高于對照,存苗率分別為97.73%和33.93%,根腐病發(fā)病率也明顯降低。

表5 T3和T20菌株對連作土中三七存苗率和發(fā)病率的影響

3 討 論

從土壤中分離篩選抑菌微生物作為作物病害生態(tài)防控的生防資源是近年來的研究熱點,也是今后綠色植保的重要發(fā)展方向之一。本研究發(fā)現(xiàn),從三七根際分離獲得的耐皂苷木霉菌株不僅能促進一年生三七的生長,還能明顯拮抗主要根腐病病原菌菌絲生長,對緩解三七連作障礙具有較好的應(yīng)用前景。

木霉菌是一種應(yīng)用廣泛的植物生防促生真菌,能夠通過與植物形成共生體、分泌多種酶類和代謝產(chǎn)物提高植物對生物和非生物脅迫的抗性[24]。蔣妮等[25]發(fā)現(xiàn)棘孢木霉(T.asperellum)菌株F2采用灌根與葉面噴施相結(jié)合的方法能夠較好預(yù)防三七灰霉病的發(fā)生;Chen等[26]發(fā)現(xiàn)蓋姆斯木霉(T.gamsii)對三七根腐病具有一定的防治效果。上述已報道的2株木霉菌株雖對部分三七病原菌具有較好的拮抗活性,但未對其能否促進植株生長進行測定。Li等[27]研究結(jié)果表明木霉菌株能夠顯著促進三年生三七植株地下部的生長,降低根腐病發(fā)病率,但未對其能否緩解連作障礙及其在根際的定殖效果進行評價。本研究篩選獲得的2株木霉菌綠色木霉T3和漸綠木霉T20不僅對引起三七根腐病的主要病原菌具有較強的拮抗活性,還能降低連作土中三七根腐病發(fā)病率,促進三七植株的生長,具有較好的應(yīng)用潛力。后續(xù)試驗亟需對綠色木霉T3和漸綠木霉T20的代謝產(chǎn)物抑菌活性等方面開展深入研究,明確其生防機制,為菌株的進一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。此外,Li等[28]研究發(fā)現(xiàn)接種哈茨木霉顯著降低了白菜根腫病菌(Plasmodiaphorabrassicae)和致病性鏈格孢菌(Alternaria)的豐度,同時顯著增加了土壤中芽胞桿菌的數(shù)量。因此后續(xù)研究還需對外源接種木霉菌對三七根際微生物群落的調(diào)控作用進行深入研究,以解析木霉菌緩解三七連作障礙的微生態(tài)機制。

植物根系分泌物為根際微生物提供所需能源的同時,還直接影響著根際微生物的數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)[29]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),三七根系分泌物能夠促進根腐病病原菌在根際增殖,而抑制木霉菌和芽孢桿菌等有益菌的生長[18]。本研究發(fā)現(xiàn),三七根際分離到的6株木霉菌株中,僅有2株的孢子萌發(fā)未受到三七根系分泌物的顯著抑制,表明大部分三七根際木霉菌對三七根系分泌物較敏感。皂苷是三七根系分泌物中的特有成分,且能通過殘體降解的方式以較高的濃度存在于三七根際土壤中[8]。本研究進一步測定了供試6株木霉菌株對皂苷的耐受性,結(jié)果顯示,不同木霉菌株對三七皂苷表現(xiàn)出的敏感性有所差異,部分菌株在低濃度皂苷下可利用其生長,但隨著皂苷濃度的升高,抑制效果逐漸增強,其中綠色木霉T3菌株和漸綠木霉T20菌株在較高的皂苷濃度下生長幾乎不受影響,表明三七根際存在少數(shù)耐皂苷的木霉菌株。已有研究也顯示,根系分泌的人參皂苷在低濃度下(0.2～20.0 mg/L)下能抑制哈茨木霉菌的菌絲生長[30-31],但也存在部分具有皂苷耐受性的木霉菌株。李翟等[32]從人參根際土中分離到1株可對20 mg/L的人參總皂苷溶液表現(xiàn)出顯著正趨化作用的綠色木霉菌株,這一結(jié)果與本研究結(jié)果一致。但是,本研究結(jié)果也表明,在連作土中接種木霉菌30 d后,隨著三七植株的大量死亡,木霉菌在三七根際的定殖量也大幅下降,與前期研究發(fā)現(xiàn)相較于未感病的三七根際土,發(fā)生根腐病的三七根際土中木霉菌的相對豐度顯著降低的結(jié)果一致[33-34],因此,需要及時外源添加木霉菌以達到持續(xù)有效緩解三七連作障礙的效果。同時,后續(xù)研究還需對篩選獲得的耐皂苷菌株對皂苷的耐受機制開展研究,以深入解析耐皂苷木霉菌株在三七根際的定殖機制,從而更好地發(fā)揮木霉菌在三七病害生態(tài)防控中的作用。

4 結(jié) 論

本研究從健康三七根際土壤中分離獲得2株耐皂苷木霉菌綠色木霉T3和漸綠木霉T20,其不僅對三七具有較好的促生效果,還能明顯抑制三七主要根腐病病原菌生長,對三七連作障礙具有一定的緩解效果,具有良好的生防潛力。