董 娜,王玉泉,陳向東,胡鐵柱,吳曉軍,張亞娟,茹振鋼

(河南科技學(xué)院小麥中心/河南省雜交小麥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南新鄉(xiāng)453003)

小麥葉銹病是由專性寄生真菌小麥葉銹病菌(Pucciniatriticina)引起的一種真菌性氣傳病害,在世界各小麥生產(chǎn)國(guó)均有發(fā)生,分布比條銹病、稈銹病更廣。在中國(guó),小麥葉銹病是影響小麥生產(chǎn)的重要病害之一,短期內(nèi)可造成大面積流行,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致小麥減產(chǎn)5%～15%,甚至絕收[1]。近年來(lái),由于氣候變暖、播種密度大等因素的影響,各麥區(qū)葉銹病有加重發(fā)生的趨勢(shì)。

發(fā)掘和利用抗病基因是控制小麥葉銹病最經(jīng)濟(jì)、有效且安全的方法。迄今為止,國(guó)際上已發(fā)現(xiàn)100多個(gè)小麥抗葉銹病基因[2-7],在除5A和6D以外的其他染色體上都有分布。由于小麥抗葉銹病基因小種?；詮?qiáng),抗病基因容易隨葉銹病菌毒力頻率的變化或新毒力小種的出現(xiàn)而喪失功能,目前Lr1、Lr3、Lr10、Lr11、Lr16、Lr26等基因單獨(dú)存在時(shí)已基本喪失抗性[8-10]。因此,廣泛開(kāi)展種質(zhì)資源抗性評(píng)價(jià)以及抗病基因鑒定,對(duì)小麥抗葉銹病育種具有重要意義[11]。

國(guó)外種質(zhì)資源的引進(jìn)和合理利用是豐富我國(guó)小麥品種抗病遺傳多樣性、促進(jìn)小麥生產(chǎn)發(fā)展的有效途徑之一[12]。近年來(lái),伍 玲等[13]利用分子標(biāo)記對(duì)CIMMYT 273個(gè)小麥品種的抗病基因Lr34/Yr18/Pm38進(jìn)行檢測(cè),篩選出含有該位點(diǎn)的材料43份,在不同地點(diǎn)對(duì)條銹病、葉銹病和白粉病具有不同程度的抗性;鄭慧敏等[14]通過(guò)對(duì)70份國(guó)外小麥品種(系)進(jìn)行苗期和成株期抗葉銹病鑒定,鑒定出15個(gè)抗葉銹病基因,篩選出慢銹性材料39份;焦 悅等[15]從50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)中檢測(cè)到7個(gè)抗葉銹病基因,篩選出慢銹性材料19份;王思曼等[16]在69份國(guó)外小麥品種(系)中檢測(cè)到6個(gè)抗葉銹病基因,篩選出慢銹性材料46份。這些研究表明,國(guó)外小麥品種中含有豐富的抗葉銹病基因,可作為我國(guó)小麥抗葉銹病育種的抗病資源加以利用。

本研究利用已開(kāi)發(fā)的與抗葉銹病基因(Lr1、Lr10、Lr20、Lr24、Lr26、Lr34、Lr37和Lr38)緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記,對(duì)本課題組保存的39份國(guó)外小麥種質(zhì)進(jìn)行抗葉銹病基因檢測(cè),篩選出葉銹病抗性表現(xiàn)突出的材料,以期為小麥抗病材料的合理利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試39份小麥種質(zhì)材料(表2)由河南科技學(xué)院小麥中心收集和保存,分別引自智利、墨西哥、澳大利亞、俄羅斯等10個(gè)國(guó)家。葉銹病菌為小麥生產(chǎn)上流行小種PHT和THT混合菌株,購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 田間接種及葉銹病抗性鑒定

供試小麥種質(zhì)材料秋播于河南科技學(xué)院百泉校區(qū)試驗(yàn)基地的種質(zhì)圃中,種質(zhì)圃行長(zhǎng)4 m,每份材料種植兩行,常規(guī)田間管理,于第二年春季小麥返青后取幼嫩葉片,用于基因組DNA提取。于拔節(jié)期采用注射法接種葉銹病菌孢子懸液,每行接種1個(gè)分蘗,于灌漿中期調(diào)查葉銹病病害等級(jí),調(diào)查兩次,間隔7 d,按0～4級(jí)法進(jìn)行病級(jí)劃分[17]。劃分標(biāo)準(zhǔn):0級(jí)(免疫型),葉上無(wú)可見(jiàn)癥狀;0;級(jí)(近免疫型),葉上產(chǎn)生小枯斑,無(wú)孢子堆;1級(jí)(高抗型),夏孢子堆小,周圍有枯斑;2級(jí)(中抗型),夏孢子堆小到中等,生在綠色組織上,周圍有枯斑;3級(jí)(中感型),夏孢子堆較大,周圍組織有褪綠現(xiàn)象;4級(jí)(高感型),夏孢子堆大,周圍不褪綠。葉銹病抗性鑒定于2018-2021連續(xù)三年進(jìn)行,取發(fā)病最重的等級(jí)作為最終抗性結(jié)果。

1.2.2 小麥抗葉銹病基因分子標(biāo)記檢測(cè)

小麥葉片用液氮研磨后,采用CTAB法提取基因組DNA,通過(guò)紫外分光光度計(jì)和0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè),DNA原液稀釋至50 ng·μL-1,備用。利用與抗葉銹病基因連鎖的分子標(biāo)記在S1000型梯度PCR儀(Bio-Rad,美國(guó))上進(jìn)行抗病基因分子檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為10 μL,包括模板DNA 50 ng,2×Taq Master Mix(康為世紀(jì),北京)5 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL,ddH2O補(bǔ)足至10 μL。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性50 s,45～65 ℃退火50 s,72 ℃延伸45 s至2 min(退火溫度和延伸時(shí)間參照文獻(xiàn)進(jìn)行),38個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min,4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠(含goldview),在110 V下電泳40 min,利用凝膠成像儀(Bio-Rad,美國(guó))進(jìn)行觀察并拍照保存。所用引物序列見(jiàn)表1,由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

表1 本研究所用的標(biāo)記引物

2 結(jié)果與分析

2.1 抗葉銹病基因的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

利用與小麥抗葉銹病基因Lr1共分離的STS標(biāo)記引物WR003F和WR003R對(duì)其進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè),發(fā)現(xiàn)含有該基因的材料能擴(kuò)增出753 bp的特異條帶(圖1)。在39份種質(zhì)材料中,KPL-1、OK.95571、野貓等12份材料能擴(kuò)增出該條帶,說(shuō)明這些材料攜帶Lr1,頻率為30.77%(表2)。

M1:DL2000 DNA marker;M2:100 bp DNA ladder;Lr26-1:利用標(biāo)記ω-secalinF和ω-secalinR的檢測(cè)結(jié)果; Lr26-2:利用標(biāo)記O11B5和O11B3的檢測(cè)結(jié)果;1:澳阿優(yōu)1號(hào); 2:KPL-1;3:KPL-3;4:阿大學(xué)AGT-②;5:鳥(niǎo)麥;6:攀道拉;7:智矮早;8:硬質(zhì)博萊特;9:CL0401;10:CL0407(早);11:CL0419;12:CL0438;13:CL0442;14:墨特大;15:MRYC;16:墨176;17:墨S139;18:CMT-3(T88);19:薩爾斯堡;20:意大利白麥;21:Ciava;22:法國(guó)材料;23:bermude;24:魯昂-10。箭頭所指為目標(biāo)條帶。

表2 外引小麥種質(zhì)攜帶的抗葉銹病基因及其抗病性

利用與小麥抗葉銹病基因Lr10共分離的STS標(biāo)記引物Fl.2245和Lr10-6/r2對(duì)其進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè),發(fā)現(xiàn)含有該基因的材料能擴(kuò)增出310 bp的特異條帶(圖1)。在39份種質(zhì)材料中,KPL-1、野貓、TAMOI等7份材料能擴(kuò)增出該條帶,說(shuō)明這些材料攜帶Lr10,頻率為17.95%(表2)。

利用與小麥抗葉銹病基因Lr20共分離的STS標(biāo)記引物STS638-L和STS638-R對(duì)其進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè),發(fā)現(xiàn)含有該基因的材料能擴(kuò)增出542 bp的特異條帶(圖1)。在39份種質(zhì)材料中,僅薩爾斯堡能擴(kuò)增出該條帶,說(shuō)明該材料攜帶Lr20,頻率為2.56%(表2)。

利用與小麥抗葉銹病基因Lr24共分離的SCAR標(biāo)記引物S1302-609F和S1302-609R對(duì)其進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè),發(fā)現(xiàn)含有該基因的材料能擴(kuò)增出607 bp的特異條帶(圖1)。在39份種質(zhì)材料中,KPL-3和OK.95571兩份材料能擴(kuò)增出該條帶,說(shuō)明這兩份材料攜帶Lr24,頻率為5.13%(表2)。

利用與小麥抗葉銹病基因Lr26共分離的STS標(biāo)記引物ω-secalinF和ω-secalinR以及O11B5和O11B3對(duì)其進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè),發(fā)現(xiàn)含有該基因的材料利用ω-secalinF和ω-secalinR能擴(kuò)增出1 067 bp的特異條帶,不含該基因的材料利用O11B5和O11B3能擴(kuò)增出636 bp的特異條帶(圖1)。在39份種質(zhì)材料中,HUAYUN、 智矮早、MRYC等5份材料能擴(kuò)增出1 067 bp的條帶,而不能擴(kuò)增出636 bp的條帶,說(shuō)明這5份材料攜帶Lr26,頻率為12.82%(表2)。

利用與小麥抗葉銹病基因Lr34緊密連鎖的STS標(biāo)記引物csLv34F和csLv34R(遺傳距離為0.4 cM)對(duì)其進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè),發(fā)現(xiàn)含有該基因的材料能擴(kuò)增出150 bp的特異條帶,不含該基因的材料能擴(kuò)增出229 bp的特異條帶(圖1)。在39份種質(zhì)材料中,澳阿優(yōu)1號(hào)、OK.95571、Jaggar-1等12份材料能擴(kuò)增出150 bp的條帶,說(shuō)明這12份材料攜帶Lr34,頻率為30.77%(表2)。

利用與小麥抗葉銹病基因Lr37共分離的STS標(biāo)記引物VENTRIUP和LN2對(duì)其進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè),發(fā)現(xiàn)含有該基因的材料能擴(kuò)增出259 bp的特異條帶(圖1)。在39份種質(zhì)材料中,澳阿優(yōu)1號(hào)、KPL-1、KPL-3等9份材料能擴(kuò)增出該條帶,說(shuō)明這9份材料攜帶Lr37,頻率為23.08%(表2)。

利用與小麥抗葉銹病基因Lr38共分離的SCAR標(biāo)記引物Y38SCAR982F和Y38SCAR982R對(duì)其進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè),發(fā)現(xiàn)含有該基因的材料能擴(kuò)增出982 bp的特異條帶(圖1)。在39份種質(zhì)材料中,KPL-3和OK.95571兩份材料能擴(kuò)增出該條帶,說(shuō)明這2份材料攜帶Lr38,頻率為5.13%(表2)。

2.2 抗葉銹病基因的分布及種質(zhì)抗性評(píng)價(jià)

從表2可知,29份材料至少攜帶1個(gè)所檢測(cè)的抗葉銹病基因。聚合兩個(gè)抗葉銹病基因的材料13份,其中攜帶Lr1+Lr10、Lr1+Lr26、Lr10+Lr37、Lr34+Lr37的材料各1份;攜帶Lr26+Lr34的材料2份;攜帶Lr1+Lr37的材料3份;攜帶Lr10+Lr34的材料4份。聚合3個(gè)抗葉銹病基因的材料2份,為KPL-1和KPL-3,分別攜帶Lr1+Lr10+Lr37和Lr24+Lr37+Lr38。OK.95571攜帶的抗葉銹病基因最多,有5個(gè),分別為L(zhǎng)r1、Lr24、Lr34、Lr37和Lr38。葉銹病抗性鑒定結(jié)果表明,39份種質(zhì)材料中,表現(xiàn)為近免疫和中抗的材料分別為4份和8份,頻率分別為10.26%和20.51%,其余27份材料均表現(xiàn)為中感或高感,頻率為69.23%。聚合兩個(gè)抗葉銹病基因的種質(zhì)材料中,攜帶Lr1+Lr10和Lr10+Lr37的材料對(duì)葉銹病表現(xiàn)為高感,攜帶Lr1+Lr26和Lr1+Lr37的材料表現(xiàn)為中感,攜帶Lr34+Lr37和Lr26+Lr34的材料表現(xiàn)為中抗,而攜帶Lr10+Lr34的材料抗性表現(xiàn)不一致,其中兩份表現(xiàn)為中抗,兩份表現(xiàn)為中感。聚合3個(gè)抗葉銹病基因的種質(zhì)材料中,攜帶Lr1+Lr10+Lr37的材料(KPL-1)對(duì)葉銹病表現(xiàn)為近免疫,攜帶Lr24+Lr37+Lr38的材料(KPL-3)表現(xiàn)為中抗。聚合5個(gè)抗葉銹病基因的材料(OK.95571)對(duì)葉銹病表現(xiàn)為近免疫。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),Lr1、Lr20、Lr37單獨(dú)存在時(shí),種質(zhì)材料基本喪失抗性,雖然攜帶Lr1的兩份材料(莫斯科39和非黑土地24)抗性很好,達(dá)到0;級(jí),但是從攜帶Lr1種質(zhì)材料的總體抗性來(lái)看,這兩份材料的葉銹病抗性應(yīng)該是由其他未檢測(cè)到的抗葉銹病基因引起。本研究未檢測(cè)到僅攜帶Lr10、Lr24或Lr38的材料,Lr24和Lr38與其他抗葉銹病基因聚合時(shí),種質(zhì)材料表現(xiàn)為中抗或近免疫;Lr10與Lr1或Lr37聚合時(shí),種質(zhì)材 料表現(xiàn)為高感,與Lr34聚合時(shí),種質(zhì)材 料表現(xiàn)為中感或中抗。另外,聚合3個(gè)及3個(gè)以上抗葉銹病基因的材料對(duì)葉銹病均表現(xiàn)為中抗或近免疫,說(shuō)明聚合多個(gè)抗葉銹病基因有利于提高小麥種質(zhì)材料的葉銹病抗性。

3 討論

基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)為種質(zhì)資源中抗病基因的準(zhǔn)確鑒定提供了有效工具,利用與抗病基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行分子檢測(cè),不受組織器官類型和生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的限制,操作簡(jiǎn)便快速,而且可有效鑒定種質(zhì)材料中抗病基因的組成。本研究所用的與抗葉銹病基因Lr1、Lr10、Lr20、Lr24、Lr26、Lr34、Lr37和Lr38緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記,在輔助抗病育種和種質(zhì)資源鑒定中已有廣泛應(yīng)用,具有良好的特異性和穩(wěn)定性[14-16],通過(guò)對(duì)39份外引小麥種質(zhì)進(jìn)行抗葉銹病基因檢測(cè)和田間接種鑒定,對(duì)種質(zhì)材料的葉銹病抗性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

Lr1、Lr10、Lr20、Lr24、Lr26和Lr38為全生育期抗葉銹病基因。Lr24和Lr38分別來(lái)源于小麥近緣物種長(zhǎng)穗偃麥草和中間偃麥草,對(duì)我國(guó)葉銹菌生理小種具有很強(qiáng)的抗性。陳萬(wàn)權(quán)等[9]研究表明,中國(guó)小麥葉銹菌群體對(duì)Lr24和Lr38的無(wú)毒基因頻率達(dá)100%。王 志等[27]對(duì)小麥抗葉銹病材料的Lr24、Lr38基因進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)和抗性鑒定,結(jié)果表明,單獨(dú)含Lr24或Lr38以及二者聚合的材料對(duì)葉銹病抗性均表現(xiàn)為免疫或近免疫。姚宏鵬等[28]對(duì)小麥抗葉銹病基因聚合材料的抗性鑒定也有類似的結(jié)果。本研究中含有Lr24和Lr38的兩份種質(zhì)分別表現(xiàn)中抗和近免疫,與前人結(jié)果基本一致。Lr26來(lái)源于小麥-黑麥1BL/1RS易位系,陳萬(wàn)權(quán)等[29]、袁軍海等[10]、鄭慧敏等[14]的研究結(jié)果均表明,Lr26單獨(dú)應(yīng)用時(shí),材料已喪失抗性。本研究中,MRYC、墨176只檢測(cè)到Lr26基因,對(duì)葉銹病分別表現(xiàn)為中感和中抗,推測(cè)墨176的抗性可能由其他未檢測(cè)的抗葉銹病基因引起。

來(lái)源于普通小麥的Lr34以及來(lái)源于偏凸山羊草的Lr37為成株期抗性基因。陳萬(wàn)權(quán)等[9]研究表明,Lr34成株期侵染型表現(xiàn)為中感,但終期病害比率小于10%,具有明顯的慢葉銹病特征;Lr37成株期侵染型表現(xiàn)為中感及以上水平,終期病害比率在65%以上。本研究發(fā)現(xiàn),Lr34和Lr37單獨(dú)存在時(shí),材料對(duì)葉銹病分別表現(xiàn)為中感和高感,但兩者聚合時(shí)表現(xiàn)為中抗,說(shuō)明Lr34和Lr37聚合時(shí)能提高載體種質(zhì)的抗性水平。這與Kloppers等[30]的研究結(jié)果一致。

本研究檢測(cè)到聚合3個(gè)及3個(gè)以上抗葉銹病基因的種質(zhì),即KPL-1(Lr1+Lr10+Lr37),KPL-3(Lr24+Lr37+Lr38)和OK.95571(Lr1+Lr24+Lr34+Lr37+Lr38),其對(duì)葉銹菌均表現(xiàn)為中抗或近免疫,說(shuō)明聚合較多的抗葉銹病基因有利于提高葉銹病抗性,抗病基因聚合是開(kāi)展小麥抗病育種的有效途徑,同時(shí)這些種質(zhì)也為抗葉銹病育種提供了重要抗源。另外,莫斯科39和非黑土地24兩份材料對(duì)葉銹病抗性均表現(xiàn)為0;級(jí),但分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果顯示,這兩份材料僅攜帶Lr1,說(shuō)明這兩份材料可能含有其他抗葉銹病基因,有待對(duì)其進(jìn)行深入分析。