谷仙，趙艷云，張建云，王乾，鄭玉光，房慧勇

(1. 河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北石家莊 050200；2. 河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心，河北石家莊 050200；3. 河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北石家莊 050026)

中藥蒼術(shù)為多年生菊科植物茅蒼術(shù)[Atractylodes lancea(Thunb.) DC. ] 或北蒼術(shù)[Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.]的干燥根莖，味辛、苦，性溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目等藥效《中華人民共和國藥典(2020版)》。 受新型冠狀病毒疫情(COVID－19)等影響，近年來蒼術(shù)的市場需求不斷擴(kuò)大，主流品種以北蒼術(shù)為主，但質(zhì)量參差不齊。 自然界中蒼術(shù)為多年生藥用植物，主要分布于河北、內(nèi)蒙古等地區(qū)，繁殖能力弱和無節(jié)制采挖等因素導(dǎo)致該植物野生資源日益枯竭。 為保護(hù)北蒼術(shù)自然種群，減少環(huán)境破壞，如何通過人工栽培技術(shù)保證北蒼術(shù)質(zhì)量成為科研人員亟待解決的核心問題[1]。

肥料組成及用量直接決定蒼術(shù)外部形態(tài)特征和次生代謝產(chǎn)物的差異。 有研究表明，低或高濃度氮素均會加速北蒼術(shù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷，加重連作障礙的發(fā)生，次生代謝產(chǎn)物甚至低于野生蒼術(shù)[2－4]。 但也有研究發(fā)現(xiàn)低pH 值提高了蒼術(shù)根中β－桉葉醇含量[5]。 大田試驗發(fā)現(xiàn)北蒼術(shù)在施用氮肥(N)180 kg/hm2、磷肥(P2O5)225 kg/hm2、鉀肥(K2O)105 kg/hm2情況下藥用成分含量最高[6]。 增施鉀肥可以提高藥用植物干物質(zhì)生產(chǎn)能力和根系產(chǎn)量[7]。 噴施鋅肥有助于提高關(guān)蒼術(shù)白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和蒼術(shù)素含量，硼肥能顯著提高關(guān)蒼術(shù)花粉活力、花粉數(shù)量、結(jié)實率及百粒重等[8]。目前，多數(shù)研究停留在施肥對蒼術(shù)生長的短期影響，不同生長年限的北蒼術(shù)次生代謝產(chǎn)物積累對土壤礦質(zhì)元素的響應(yīng)尚不明確。 為此，本試驗以一年生、三年生和七年生北蒼術(shù)為研究對象，分析其主要藥用成分的差異，通過比較土壤中礦質(zhì)元素和北蒼術(shù)次生代謝產(chǎn)物積累的特征，明確土壤礦質(zhì)元素對北蒼術(shù)藥用成分影響的關(guān)鍵因子，以期為我國優(yōu)質(zhì)北蒼術(shù)生產(chǎn)提供理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 種植地概況及試驗管理

種植基地位于河北省承德市隆化縣白虎溝村(117.078072°E，40.150558°N)。 該地區(qū)屬于溫帶大陸性季風(fēng)氣候，四季分明、雨熱同季，光照充足，多年平均日照時數(shù)2 665.7 h，年均氣溫7.5℃，無霜期約153 d，年均降水量505.2 mm，屬于北蒼術(shù)主要道地產(chǎn)區(qū)之一。 該基地種植一年生、三年生和七年生蒼術(shù)，肥料、灌溉和除草等統(tǒng)一管理。 蒼術(shù)生長季施用氮肥(N)220 kg/hm2、磷肥(P2O5)190 kg/hm2、鉀肥(K2O)105 kg/hm2。

1.2 樣品采集

于2020 年10 月中旬北蒼術(shù)收獲期，按照五點取樣法采集土壤樣品，每處理重復(fù)3 次。 用土鉆鉆取0～20 cm 土樣，充分混合后采用四分法取舍。 將土樣充分混勻后，剔除其中石塊和動植物殘體等雜質(zhì)，帶回實驗室。 土樣平鋪于陰涼處自然風(fēng)干，研磨，過0.15 mm 孔徑篩，留存待測。

在對應(yīng)土壤樣點處采集不同生長年限的北蒼術(shù)，選取長勢基本一致、無病蟲害的健壯植株，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院鄭玉光教授鑒定為北蒼術(shù)Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.。 將北蒼術(shù)根莖帶回實驗室除去泥沙，自然陰干，撞掉須根，粉碎，過三號篩，用于各指標(biāo)測定。

1.3 測定項目及方法

土壤pH 測定用電位法(土水比1 ∶2.5)，即準(zhǔn)確稱取10.0 g 過篩鮮土放入燒杯中，加入25 mL經(jīng)過煮沸后靜置至常溫的去離子水，充分振蕩1 min，靜置30 min 后使用pH 計測定。 參照魯如坤[9]的方法測定土壤養(yǎng)分含量。 土壤有機(jī)碳采用重鉻酸鉀氧化－外加熱法測定，用FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定剩余的重鉻酸鉀，并計算出有機(jī)碳含量。土壤全氮采用凱氏定氮法，借助FOSS KJELTEC 8200 測定，全磷、全鉀和鋅、氯、銅等元素采用電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP－MS)法測定。

供試儀器及標(biāo)準(zhǔn)品:LC－20AD 高效液相色譜儀(日本島津公司)，KQ－300VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，BSA224S－CW 電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。 蒼術(shù)素(批號:MUST－19051602，純度≥99.89%)，β－桉葉醇(批號:MUST-1911262，純度≥99%)， 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ(批號: MUST －19101112，純度≥99.75%)，以上對照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司。 乙腈為色譜純(Fisher Scientific Co. Ltd.)，水為Milli－Q 自制水，其他試劑均為分析純。

采用高效液相色譜法測定北蒼術(shù)樣品中β－桉葉醇、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)素三種有效成分含量。色譜柱:Inertsil ODS－3 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相:乙腈(B) －0.1% 甲酸水溶液(A)；梯度洗脫(0 ～30 min，50%B；30 ～35 min，52%B；35～45 min，55%B；45～48 min，58%B；48 ～58 min，60%B；58 ～70 min，80%B；70 ～75 min，82%B)；流速:1.0 mL/min；檢測波長:220 nm(白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，45 ～55 min)，203 nm(β－桉葉醇，55 ～60 min)，340 nm (蒼術(shù)素，60 ～70 min)；柱溫:25℃；進(jìn)樣量:10 μL。 方法學(xué)考察結(jié)果顯示蒼術(shù)素精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性RSD 分別為1.28%、0.85%、1.51%；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性RSD 分別為1.34%、0.98%、1.72%；β－桉葉醇精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性RSD 分別為1.47%、1.43%、1.87%； 加樣回收率分別為99. 98%、99.86%、100.08%，RSD 分別為1.95%、0.98%、1.29%；線性關(guān)系:Y蒼術(shù)素＝1×108X＋621976，R2＝0.9998；Y白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ＝4×107X＋189482，R2＝0.9997；Yβ－桉葉醇＝2×107X＋283364，R2＝0.9997。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019 整理，SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析(P＜0.05)，OriginPro 2019 軟件繪圖。 采用Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析， Canoco 5.0 軟件進(jìn)行冗余分析(Redundancy analysis，RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長年限北蒼術(shù)土壤pH 值及礦質(zhì)元素含量

由表1 看出，隨著生長年限的延長，北蒼術(shù)土壤pH 值呈顯著下降趨勢，七年生北蒼術(shù)土壤pH 值較一年生低3.23%。 七年生和三年生北蒼術(shù)土壤有機(jī)碳含量顯著低于一年生，其中七年生土壤有機(jī)碳含量下降6.81%。 土壤全氮和全磷含量與土壤有機(jī)碳相反，均呈增加趨勢。 土壤全氮含量從1.06 g/kg 增加到1.24 g/kg，但是不同生長年限土壤全氮含量差異均不顯著；土壤全磷含量存在顯著差異，其中七年生土壤全磷含量較一年生高17.39%。三年生土壤全鉀含量顯著高于一年生和七年生，一年生雖然低于七年生，但二者差異不顯著。

表1 不同生長年限北蒼術(shù)土壤理化性狀 (g/kg)

由表2 可以看出，一年生北蒼術(shù)土壤中氯含量最高，但與三年生和七年生差異不顯著。 一年生和三年生北蒼術(shù)土壤中鈉含量均顯著高于七年生，分別為1.27 mg/kg 和1.25 mg/kg。 對微量元素而言，不同生長年限北蒼術(shù)土壤中含量有差異。其中七年生北蒼術(shù)土壤中鋅含量最高，達(dá)到66.74 mg/kg，比一年生顯著高5.79%。 七年生土壤中銅含量比一年生高7.41%；鉛含量為一年生最高，其次是七年生，三年生最低，為27.33 mg/kg，但兩種元素不同生長年限間差異均不顯著；土壤中鉻含量表現(xiàn)為三年生最低，七年生最高，達(dá)到62.53 mg/kg，顯著高于一年生和三年生北蒼術(shù)土壤中鉻含量。

表2 不同生長年限北蒼術(shù)土壤礦質(zhì)元素含量 (mg/kg)

2.2 不同生長年限北蒼術(shù)次生代謝產(chǎn)物的差異分析

比較不同生長年限下北蒼術(shù)干燥根莖的次生代謝產(chǎn)物含量發(fā)現(xiàn)，三年生北蒼術(shù)的蒼術(shù)素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和β－桉葉醇含量均最高(圖1)。 三年生北蒼術(shù)的蒼術(shù)素含量達(dá)到0.69%，顯著高于一年生和七年生，七年生蒼術(shù)素含量最低，為0.24%。一年生和七年生白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含量接近，差異不顯著，分別比三年生顯著低47.20%和49.50%。 就β－桉葉醇而言，盡管三年生北蒼術(shù)中含量最高(0.78%)，但是與一年生差異不顯著，僅比一年生高1.8%；七年生北蒼術(shù)β－桉葉醇含量均顯著低于一年生和七年生，為0.52%。

圖1 不同生長年限北蒼術(shù)次生代謝產(chǎn)物差異比較

2.3 北蒼術(shù)次生代謝產(chǎn)物對土壤礦質(zhì)元素的響應(yīng)

土壤礦質(zhì)元素與北蒼術(shù)次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)性分析結(jié)果(圖2)顯示，土壤有機(jī)碳含量顯著影響北蒼術(shù)中β－桉葉醇含量，土壤全磷含量則與β－桉葉醇含量呈顯著負(fù)相關(guān)，土壤全鉀含量與蒼術(shù)素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ呈顯著正相關(guān)。

圖2 土壤礦質(zhì)元素與北蒼術(shù)次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)性分析

冗余分析發(fā)現(xiàn)，前兩軸共解釋變量的94.8%，其中，第一軸解釋變量的86.2%，第二軸解釋變量的8.6%(圖3)。 對北蒼術(shù)次生代謝成分而言，重金屬鉻與北蒼術(shù)藥用成分含量呈顯著負(fù)相關(guān)，其次是鋅。 土壤全鉀含量對北蒼術(shù)根莖藥用成分含量影響最大，但未達(dá)顯著水平， 其次為鈉、pH 值和有機(jī)碳(SOC)。

圖3 土壤礦質(zhì)元素與北蒼術(shù)次生代謝產(chǎn)物的冗余分析

3 討論

隨著對蒼術(shù)研究的不斷深入，已從蒼術(shù)中分離出了200 多種化合物，主要為萜類和烯炔類[10 [。 《中華人民共和國藥典(2020 版)》規(guī)定，本品按干燥品計算，蒼術(shù)素(C13H10O)含量不得少于0.30%。 本試驗結(jié)果表明，隨著生長年限延長，北蒼術(shù)主要藥用活性成分含量先升高后降低，一年生、三年生和七年生蒼術(shù)素含量均超過藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，三年生蒼術(shù)素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和β－桉葉醇含量均為最高。 這與崔馨月[8]研究發(fā)現(xiàn)三年生根莖中蒼術(shù)酮含量高于四年生和五年生的結(jié)論基本一致。 原因可能與連續(xù)施用化肥加劇北蒼術(shù)連作障礙有關(guān)，造成北蒼術(shù)土壤微環(huán)境惡化。 有報道指出河北北部和遼西的北蒼術(shù)品質(zhì)較好[11]。如果為了追求短期產(chǎn)量而無節(jié)制施用化肥，忽視道地藥材產(chǎn)區(qū)土壤質(zhì)量的提升，勢必導(dǎo)致蒼術(shù)產(chǎn)業(yè)的不良循環(huán)。 土壤礦質(zhì)元素不僅影響中藥材產(chǎn)量和品質(zhì)，還會影響土壤及植物－植食性昆蟲－天敵的營養(yǎng)關(guān)系及藥用植物微生態(tài)系統(tǒng)[12]。 因此，加強(qiáng)北蒼術(shù)道地產(chǎn)區(qū)生態(tài)種植模式研究至關(guān)重要，金永超[13]采用生物質(zhì)炭浸提液對茅蒼術(shù)進(jìn)行灌根，顯著增加了茅蒼術(shù)中蒼術(shù)素含量。 有學(xué)者發(fā)現(xiàn)茅蒼術(shù)和花生間作能夠提高花生產(chǎn)量，降低連作土壤酚酸類物質(zhì)含量，調(diào)控花生土壤微生物群落組成[14]。

本研究表明土壤全鉀含量對北蒼術(shù)次生代謝產(chǎn)物累積正向影響最大。 前人研究也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，如低鉀脅迫下茅蒼術(shù)葉片光合受阻，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油主要成分β－桉葉醇、茅蒼術(shù)醇含量降低[15]。另一方面，鉀素能夠協(xié)同其他營養(yǎng)元素共同提升藥用植物質(zhì)量，楊燕燕[16]研究表明施鉀量與蒼術(shù)不同部位的含氮量呈正相關(guān)。 楊雪等[7]指出當(dāng)前鉀素對藥用植物的研究多集中在藥材產(chǎn)量、有效成分含量及生理代謝等方面，未來應(yīng)加強(qiáng)鉀素對藥效成分及體內(nèi)代謝與基因調(diào)控的研究。 近年來藥理活性研究發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)還具有降血糖、抗菌抗炎、心血管保護(hù)和抗腫瘤等作用[17，18]。 對北蒼術(shù)而言，需要明確人工栽培中鉀肥最佳施用量，進(jìn)一步研究鉀素調(diào)控北蒼術(shù)中蒼術(shù)素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ等藥用成分的內(nèi)在機(jī)制。

微量元素是藥用植物生長發(fā)育中不可或缺的，土壤中微量元素供給水平將直接影響北蒼術(shù)品質(zhì)形成。 適量銅肥能顯著提高關(guān)蒼術(shù)超氧化物歧化酶活性、筒長、花冠長度、花冠寬度、花粉數(shù)量[19]，而對于關(guān)蒼術(shù)蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和β－欖香烯來說鋅肥是關(guān)鍵因素[8]。 對藥用植物來說，微量元素越多并不意味著藥材質(zhì)量越好，同時也面臨著重金屬污染的風(fēng)險。 本研究中，土壤重金屬鉻(Cr)、鋅(Zn)、銅(Cu)和鉛(Pb)元素含量雖然均未超過我國當(dāng)前規(guī)定的農(nóng)用地土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[20]，但相關(guān)性分析表明鉻(Cr)、鋅(Zn)和銅(Cu)元素與北蒼術(shù)藥用成分呈負(fù)相關(guān)，這可能與復(fù)合肥中含有重金屬元素有關(guān)，并且隨著化肥施用年限的延長，農(nóng)田中Cr、Cu 和Zn 元素含量呈現(xiàn)累積態(tài)勢。 因此，對于以地下根莖入藥的北蒼術(shù)而言，必須高度重視土壤潛在的重金屬污染風(fēng)險，提倡有機(jī)肥改良土壤和有機(jī)－無機(jī)肥料配施改良土壤微生態(tài)環(huán)境。

4 結(jié)論

隨著北蒼術(shù)生長年限的延長，土壤礦質(zhì)養(yǎng)分的變化不盡相同。 連續(xù)施用化肥導(dǎo)致北蒼術(shù)土壤pH 值和土壤有機(jī)碳含量均呈下降趨勢，而土壤全氮和全磷含量則呈現(xiàn)增加趨勢；土壤中鉀元素是正向影響北蒼術(shù)次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵因子，鉻和鋅元素等則對北蒼術(shù)品質(zhì)產(chǎn)生一定負(fù)效應(yīng)。 就本研究所涉及的藥用成分來講，生長年限越長并不意味著北蒼術(shù)活性物質(zhì)含量越高，而以三年生北蒼術(shù)質(zhì)量最好，其蒼術(shù)素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和β－桉葉醇含量均高于一年生和七年生。 未來應(yīng)加強(qiáng)北蒼術(shù)的生態(tài)友好型種植模式研究，避免濫用化肥影響北蒼術(shù)質(zhì)量。