李尚穎 劉慧穎 張麗 徐萬(wàn)魁

【摘要】目的：采用GC-MS/MS法測(cè)定坎地沙坦酯片中的2種基因毒性雜質(zhì)N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）的含量。方法：在程序升溫條件下，于SHIMADZU SH-L-17Sil MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）中進(jìn)行分離，使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)，電子轟擊電離源（EI）電離，同時(shí)對(duì)NDMA與NDEA進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果：NDMA、NDEA及相鄰色譜峰之間的分離效果良好，在5～500 ng/mL線性關(guān)系良好，NDMA的定量限為4.86 ng/mL，檢測(cè)限為0.97 ng/mL；NDEA的定量限為4.88 ng/mL，檢測(cè)限為0.98 ng/mL?？驳厣程辊テ芯礄z出NDMA、NDEA。結(jié)論：建立的方法穩(wěn)定可行、高效簡(jiǎn)便，具有高靈敏度和高專屬性，能且對(duì)儀器的污染少，可用于坎地沙坦酯片中NDMA、NDEA的質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)研究。

【關(guān)鍵詞】GC-MS/MS；坎地沙坦酯片；基因毒性雜質(zhì)；N-亞硝基二甲胺（NDMA）；N-亞硝基二乙胺（NDEA）

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.02.036

【基金項(xiàng)目】遼寧省自然基金（2020-MS-073）。

Determination of Trace N-Nitrosodimethylamine and N-Nitrosodiethylamine in Candesartan Cilexetil Tablets by GC-MS/MS

LI Shangying，LIU Huiying，ZHANG Li，XU Wankui*

（Liaoning Inspection，Examination and Certification Centre〔Liaoning Institute for Drug Control，NMPA Key Laboratory for Quality Research and Evaluation of Chemical Drug/Shenyang Institute of Food and Drug Control〕，Shenyang 110036，China）Abstract：Objective：to detect the two genotoxic impurities including N-Nitrosodimethylamine（NDMA）and N-Nitrosodiethylamine（NDEA）in Candesartan Cilexetil Tablets by using a GC-MS/MS method. Method：the separation performed on a SHIMADZU SH-L-17Sil MS capillary column（30 m×0.25 mm，0.25μm）under temperature rising program. NDMA and NDEA were ionized by electron ionization and multi reaction monitoring（MRM）data acquisition mode was used to detect. Result：the separation among NMDA，NDEA and adjacent chromatographic peaks was effective and revealed good lineary in the range of 5～500 ng/mL. For NDMA，the limit of quantitation was 4.86 ng/mL and the limit of detection was 0.97 ng/mL. For NDEA，the limit of quantitation was 4.88 ng/mL and the limit of detection was 0.98 ng/mL. Neither of NDMA and NDEA were detected in Candesartan Cilexetil Tablets. Conclusion：The method is stable，feasible，effective，sample，highly sensitive and specific and has little pollution to the instruments. It can have applications in quality control and standard control of NDMAand NDEAin Candesartan Cilexetil Tablets.

Key words：GC-MS / MS；candesartan cilexetil tablets；genotoxic impurities；N-Nitrosodimethylamine（NDMA）；NNitrosodiethylamine（NDEA）

坎地沙坦酯是一種螺環(huán)化合物，在體內(nèi)迅速分解成活性代謝產(chǎn)物坎地沙坦。坎地沙坦是新一代二苯并咪唑類可逆的、競(jìng)爭(zhēng)性的血管緊張素2受體拮抗劑，通過(guò)與血管平滑肌AT受體結(jié)合而拮抗血管緊張素2的收縮[1]，從而起到降壓作用。它可用于治療各種急慢性高血壓、冠心病。

N-亞硝胺類化合物是一類具有高致突變性和強(qiáng)致癌性基因毒性雜質(zhì)，痕量水平即可直接或間接損害DNA，導(dǎo)致基因突變或產(chǎn)生癌變物質(zhì)。2018年，華海藥業(yè)生產(chǎn)的纈沙坦中含有遺傳毒性雜質(zhì)NDMA事件發(fā)生后，N-亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)備受關(guān)注[2]。在2020年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的致癌清單中，有10余個(gè)短脂肪鏈的N-硝胺化合物被列為A類致癌物質(zhì)。NDMA和NDEA為2A類致癌物質(zhì)。

目前，亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)的檢測(cè)方法有GC-FID、GCTEA、GC-MS[3-5]等。尚未有對(duì)坎地沙坦酯片劑中的NDMA與NDEA進(jìn)行測(cè)定的相關(guān)文獻(xiàn)。因此，開(kāi)發(fā)具有高靈敏度，能夠排除原料、輔料干擾的測(cè)定坎地沙坦酯片中NDMA與NDEA的檢查方法刻不容緩。本研究采用GC-MS/MS法測(cè)定坎地沙坦酯片中NDMA、NDEA，該方法結(jié)果準(zhǔn)確且靈敏度高，為生產(chǎn)企業(yè)評(píng)估亞硝胺類雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)提供參考。

1材料

1.1主要儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（氣相：島津GC2030，質(zhì)譜：島津TQ8050）；電子天平（廠家：METTLER TOLEDO，型號(hào)：XP205）；離心機(jī)（廠家：HITACHI，型號(hào)：CR22GII）。

1.2藥品與試劑

NDMA對(duì)照品（含量為5 mg/mL，批號(hào)為L(zhǎng)RAC9913）購(gòu)于Supelco。NDEA對(duì)照品（純度為100.0%，批號(hào)：51068-202103）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。二氯甲烷（色譜純，批號(hào)：22085094，美國(guó)Fisher公司）；氫氧化鈉（分析純，批號(hào)：20210220，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為屈臣氏蒸餾水；氦氣（高純度）。坎地沙坦酯片（批號(hào)：000039458，規(guī)格為8 mg，上海醫(yī)藥集團(tuán)青島國(guó)風(fēng)藥業(yè)有限公司）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱為SHIMADZU SH-L-17Sil MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）。柱溫為程序升溫：初始溫度為40℃，維持0.5 min后，以每分鐘20℃的速率升至200℃，再以每分鐘60℃的速率升至250℃，維持3 min；進(jìn)樣口溫度為250℃；進(jìn)樣量：1μL；載氣為氦氣，流速1 mL/min；電離方式：電子轟擊源（EI）；離子源溫度：250℃；采集模式：MRM；溶劑延遲：3.1 min。

2.2對(duì)照品儲(chǔ)備液制備

取NDMA、NDEA對(duì)照品各約10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，精取1 mL置于200 mL量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3供試品溶液的制備

取坎地沙坦酯片的細(xì)粉（約相當(dāng)于坎地沙坦酯100.0 mg）至50 mL離心管中，加入溶解液（取氫氧化鈉約40 g，加水500 mL溶解，再加入乙腈50 mL，用水稀釋至1000 mL）20.0 mL，渦旋混合并震蕩5分鐘，精密加入二氯甲烷4.0 mL萃取，振搖5分鐘，于10000 r/min離心5分鐘，取下層（二氯甲烷層）作為供試品溶液。

2.4系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL置于10 mL量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液，取系統(tǒng)適用性溶液和空白溶液各1μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，溶劑不干擾NDMA、NDEA的測(cè)定，且相鄰色譜峰之間的分離效果良好。

2.5線性

精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用二氯甲烷逐級(jí)稀釋至1、5、10、25、50、250、500 ng/mL濃度，分別進(jìn)樣1μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，在5～ 500 ng/mL范圍內(nèi)，NDMA、NDEA濃度與峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.9999以上。

2.6檢測(cè)限和定量限

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液，用二氯甲烷逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，當(dāng)信噪比（S/N）≈3時(shí)，為其檢測(cè)限（LOD）濃度。當(dāng)信噪比（S/N）≈10時(shí)，為其定量限（LOQ）濃度，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，NDMA的LOQ為4.86 ng/mL，LOD為0.97 ng/mL；NDEA的LOQ為4.88 ng/mL，LOD為0.98 ng/mL。

2.7回收率

取樣品細(xì)粉（約相當(dāng)于坎地沙坦酯100.0 mg）及8μL、80μL、160μL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液至50 mL離心管中，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，分別制得濃度為10 ng/mL、100 ng/mL和200 ng/mL的加樣回收率供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各濃度的回收率。

結(jié)果表明，該方法回收率良好，低濃度的平均加樣回收率為87.4%～100.0%，RSD為2.5%～8.3%（n=3）；中濃度的平均加樣回收率為90.7%～101.4%，RSD為3.5%～5.9%（n=3）；高濃度的平均加樣回收率為92.4%～100.5%，RSD為3.2%～5.9%（n= 3）。

2.8重復(fù)性

取本品，按“2.7”項(xiàng)下方法配制濃度為100 ng/mL的重復(fù)性試驗(yàn)樣品溶液，共6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)定結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NDMA、NDEA含量。結(jié)果表明，各成分重復(fù)性良好，RSD為3.4%～5.1%（n=6）。

2.9穩(wěn)定性

取重復(fù)性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12 h時(shí)測(cè)定。結(jié)果表明，以二氯甲烷為溶劑，NDMA、NDEA在12 h內(nèi)穩(wěn)定，各成分峰面積的RSD為1.8%～3.9%。

2.10測(cè)定結(jié)果

取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜質(zhì)譜圖（圖2）。結(jié)果坎地沙坦酯片中均未檢出NDMA、NDEA，表明坎地沙坦酯片中NDMA、NDEA濃度均小于檢測(cè)限濃度（1 ng/mL），即供試品中NDMA、NDEA濃度均小于0.04μg/g。

3討論

配制濃度為5μg/mL的混合對(duì)照品溶液，通過(guò)產(chǎn)物離子掃描模式，進(jìn)行m/z 40～200范圍內(nèi)的掃描，考察亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)對(duì)照品的質(zhì)譜定量參數(shù)，包括定量離子對(duì)、定性離子對(duì)和碰撞能量的選擇。優(yōu)化后的MRM參數(shù)見(jiàn)表2。

4結(jié)論

本研究建立了GC-MS/MS法測(cè)定NDMA、NDEA，并完成相關(guān)方法學(xué)驗(yàn)證，并將所建立的方法應(yīng)用于坎地沙坦酯片的檢測(cè)中。本實(shí)驗(yàn)中坎地沙坦酯片中的NDMA、NDEA均未檢出，說(shuō)明坎地沙坦酯片中的NDMA、NDEA無(wú)安全風(fēng)險(xiǎn)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]袁婷婷，劉勇.AT1受體拮抗劑-坎地沙坦酯治療高血壓病及靶器官保護(hù)作用若干進(jìn)展[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2016，16（70）：75-76.

[2]吳兆偉，杜凱，王琳，等.GC-MS法測(cè)定纈沙坦中的N-亞硝基二甲胺[J].中國(guó)新藥雜志，2019，28（20）：2478-2481.

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【作者簡(jiǎn)介】

李尚穎，女，1986年出生，副主任藥師，碩士，研究方向?yàn)樗幤焚|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

通訊作者：徐萬(wàn)魁，男，1975年出生，主任藥師，碩士，研究方向?yàn)樗幤焚|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究與質(zhì)量控制。聯(lián)系電話：024-31266300。

（編輯：侯睿琪）