鄭朋飛 張學(xué)勇 孫騫 王楚堃 楊鈺瑩 芮麟 宋來慶 張振魯 由春香

摘要：【目的】蘋果花臉病主要由蘋果銹果類病毒（apple scar skin viroid，ASSVd）引起，是一種嚴(yán)重危害蘋果產(chǎn)量和果實品質(zhì)的病害，通過分析蘋果花臉癥狀相關(guān)基因表達(dá)，探索花臉癥狀形成的潛在機制?！痉椒ā肯魅o癥狀且無ASSVd侵染的果皮和表現(xiàn)花臉癥狀的弘前富士蘋果果皮，提取果皮總RNA，通過高通量測序并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析。【結(jié)果】利用RT-PCR方法從表現(xiàn)花臉癥狀的蘋果果皮中得到兩條ASSVd序列，其基因組長度分別為331 nt 和330 nt，與已公布的ASSVd山東煙臺蘋果分離物SDYT-1（MW302328.1）和SDYT-3（MW315909.1）完全一致。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，與無癥狀果皮相比，表現(xiàn)花臉癥狀的果皮中共有差異表達(dá)基因6938 個，其中有3331 個基因顯著上調(diào)，3607 個基因顯著下調(diào)。通過差異表達(dá)基因功能注釋分析，表明這些差異基因參與到植物激素（茉莉酸、水楊酸和生長素）合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷生物合成等代謝途徑。此外，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)與植物防御反應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，如Md-WRKY18-like、MdWRKY71、MdNAC29、MdWRKY70 等在表現(xiàn)花臉癥狀的蘋果果皮中顯著上調(diào)，而MdERF61 等則顯著下調(diào)。利用實時熒光定量PCR驗證了顯著差異表達(dá)基因變化情況?！窘Y(jié)論】轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，蘋果花臉病果實與正常果實差異表達(dá)基因主要參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和苯丙烷合成途徑。此外，植物抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及防御相關(guān)激素信號可能參與調(diào)控蘋果花臉病的抗病反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：蘋果；ASSVd；轉(zhuǎn)錄組分析；差異表達(dá)基因；轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）06-1109-12

蘋果（Malus domestica）是世界上種植最廣泛的經(jīng)濟果樹之一。作為典型的多年生木本植物，在其生長過程中極易受到病毒或類病毒的侵染[1]。目前常見的侵染蘋果的病毒包括蘋果莖溝病毒（applestem grooving virus，ASGV）[3]、蘋果花葉病毒（applemosaic virus，ApMV）[4]、蘋果褪綠葉斑病毒（applechlorotic leaf spot virus，ACLSV）、蘋果銹果類病毒（apple scar skin viroid，ASSVd）[5-6]、蘋果凹果類病毒（apple dimple fruit viroid，ADFVd）[7- 9]，以及新近鑒定的與中國蘋果花葉病緊密相關(guān)的蘋果壞死花葉病毒（apple necrotic mosaic virus，ApNMV）[4，10-11]。

由類病毒引發(fā)的蘋果銹果病是蘋果生產(chǎn)中最具破壞性的病害之一。目前，該病害在世界各蘋果主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，特別是在中國、日本、韓國，以及美國、印度和伊朗[12-15]。在蘋果生產(chǎn)中，該病害根據(jù)在不同品種上的表型可分為3 種癥狀：銹果型、花臉型和銹果-花臉混合型癥狀[16]。銹果型的典型癥狀是在果實上生有與心室頂部對應(yīng)的五條規(guī)則的木栓化斑紋，主要發(fā)生在金冠等品種上?；樞桶Y狀主要表現(xiàn)在果皮表面形成圓形的黃綠色或紅色斑點，主要發(fā)生在著色品種上，如富士系[16]。而銹果-花臉混合型是上述兩種癥狀的復(fù)合癥狀[1]。該病害主要影響果實的品質(zhì)，包括硬度、風(fēng)味等內(nèi)在品質(zhì)和果實著色等外觀品質(zhì)，使果實失去商業(yè)價值，造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失[1]。

誘導(dǎo)蘋果銹果病發(fā)生的主要病原是ASSVd，其屬于馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒科（Pospiviroidae），蘋果銹果類病毒屬（Apscarviroid）[17- 18]。蘋果植株被ASSVd侵染后將終生帶毒，嚴(yán)重影響蘋果果實的產(chǎn)量和品質(zhì)。ASSVd的基因組為環(huán)狀單鏈RNA，長度約為330 個核苷酸[17]。其基因組RNA不編碼任何蛋白質(zhì)，完全依靠寄主的轉(zhuǎn)錄機制進(jìn)行復(fù)制和增殖[17]。

盡管蘋果銹果病已有30 多年的研究歷史，但目前主要集中于其病原物ASSVd 的檢測及分離方面。關(guān)于該病害發(fā)生的內(nèi)在機制研究尚不多見。筆者在本研究中利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對山東煙臺地區(qū)的表現(xiàn)花臉癥狀富士蘋果檢測，通過分析差異表達(dá)基因的功能，探究與花臉癥狀形成的可能代謝途徑，為后續(xù)深入探究蘋果花臉癥狀形成的內(nèi)在機制提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

對照和感病呈現(xiàn)花臉癥狀的富士果實樣品（圖1）于2018 年9 月采自山東省煙臺市煙臺農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院果樹基地（121.39° E，37.52° N），樣本分別來自樹齡11 年、長勢相對一致的健康且無花臉癥狀和有花臉癥狀的弘前富士蘋果樹，隨機取樣后削取果皮，混樣后設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，液氮冷凍后置于-80 ℃用于后續(xù)RNA的提取及轉(zhuǎn)錄組測序分析。

1.2 ASSVd檢測及克隆

參照GenBank中已公布的ASSVd（AY972082.1）序列設(shè)計引物ASSVd-F1/R1 用以檢測富士蘋果中的ASSVd。根據(jù)擴增到的序列設(shè)計基因特異性引物ASSVd-F2/R2 進(jìn)行第二輪PCR擴增，通過序列組裝獲得ASSVd全基因序列。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序

1.3.1 cDNA文庫構(gòu)建及測序質(zhì)量控制委托青島歐易生物公司提取果皮總RNA，經(jīng)過Agilent 2100Bioanalyzer 質(zhì)量檢測后進(jìn)行樣本轉(zhuǎn)錄組測序分析。在原始數(shù)據(jù)Raw reads 中去接頭（Adaptor），去除低質(zhì)量Reads，從3'端及5′端以不同方式去除低質(zhì)量堿基，得到clean data用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

1.3.2 測序數(shù)據(jù)比對和表達(dá)分析利用Hisat2 以金冠蘋果基因組（GDDH13）為參考基因組對clean data進(jìn)行序列比對。采取序列相似性比對的方法鑒定出各蛋白編碼基因在各樣本中的表達(dá)豐度。使用htseq-count 軟件獲取每個樣本中比對到蛋白編碼基因上的reads 數(shù)，cufflinks 軟件來計算蛋白編碼基因的表達(dá)量FPKM值。

1.3.3 差異基因篩選及功能分析利用DESeq 軟件進(jìn)行樣本間的差異基因分析，對各個樣本基因的counts 數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理（采用basemean 值來估算表達(dá)量），計算差異倍數(shù)，并采用NB（負(fù)二項分布檢驗的方式）對reads 數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗，最終根據(jù)差異倍數(shù)及差異顯著性檢驗結(jié)果來篩選差異蛋白編碼基因。篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2 FoldChange|＞1 且p＜0.05。利用基因本體數(shù)據(jù)庫（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）對基因進(jìn)行功能注釋、分析以及統(tǒng)計。

1.4 總RNA的提取及實時定量PCR（qRT-PCR）驗證

采用天根生化公司的植物RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA 提取；通過Clontech SMARTTM Library 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成用于定量分析的cDNA鏈?？禐槭兰o(jì)公司的Ultra SYBR Mixture（Low ROX）試劑盒用于實時熒光定量PCR，以18S 核糖體RNA基因作為內(nèi)參基因[17]，引物序列見表1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASSVd檢測及序列克隆

利用引物ASSVd-F1/R1 進(jìn)行PCR檢測，從表現(xiàn)花臉的蘋果果皮中擴增得到約300 bp 左右的條帶，而在健康果皮中則沒有該條帶（圖2-A）。經(jīng)過DNA測序并將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行BLASTn 比對，發(fā)現(xiàn)該序列與ASSVd山東煙臺蘋果分離物SDYT-1（MW302328.1）高度相似。為進(jìn)一步獲得ASSVd基因組全序列，根據(jù)已經(jīng)獲得的序列設(shè)計基因特異性引物ASSVd-F2/ R2。用該引物進(jìn)行PCR擴增，獲得第二輪ASSVd序列（圖2-B）。最終，通過序列比對和組裝獲得2 條ASSVd全長序列，全長分別是331 nt和330 nt。通過比對，發(fā)現(xiàn)2 條序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中ASSVd山東煙臺蘋果分離物SDYT-1（MW302328.1）和SDYT-3（MW315909.1）序列完全一致。

2.2 花臉癥狀果皮中差異表達(dá)基因分析

將對照組（CK_1， CK_2， and CK_3）和表現(xiàn)花臉癥狀果皮樣品（Diseased_1， Diseased_2， and Diseased_3）經(jīng)Illumina 測序后共獲得43.47 G原始測序數(shù)據(jù)（表2）。質(zhì)控檢測結(jié)果表明，clean data覆蓋度超過89%，各樣本的Q30 均超過92%，GC 含量約為48%，說明測序質(zhì)量較高，符合后續(xù)的數(shù)據(jù)分析要求。為探究感染蘋果花臉病后果皮中的基因表達(dá)情況，對差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行分析。以|log2 FoldChange|＞1 &p＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，兩組樣品中共篩選出6938 個DEGs，其中上調(diào)DEGs共有3331 個，下調(diào)DEGs共有3607 個。

2.3 ASSVd侵染蘋果果實DEGs的GO富集分析

為探究上述差異表達(dá)基因的功能，筆者對DEGs進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果表明，上述DEGS涉及生物進(jìn)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecularfunction，MF）3 個大類。在DEGs富集數(shù)目的前30個亞類中（圖3），生物進(jìn)程注釋到17 個亞類，其中主要集中在細(xì)胞過程（cellular process）、代謝過程（metabolic process）、單有機體過程（single-organismprocess）和刺激反應(yīng)（response to stimulus）等過程（圖3）。富集在細(xì)胞組分的DEGs主要分為9 個亞類，集中在細(xì)胞（cell）、細(xì)胞部分（cell part）、細(xì)胞器（organelle）和膜（membrane）等組分（圖3）。在分子功能的4個亞類中，DEGs 主要涉及結(jié)合（binding）和催化活性（catalytic activity）（圖3）。

2.4 表現(xiàn)花臉癥狀蘋果果皮中DEGs的KEGG富集分析

為了進(jìn)一步研究DEGs 的生物學(xué)功能，筆者對篩選出的DEGs 進(jìn)行KEGG富集分析。結(jié)果表明，共有2432 個DEGs 富集到了191 條通路中（圖4）。其中富集顯著的前20 條代謝通路包括植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hormone signal transduction）、苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、光合作用-觸角蛋白（photosynthesis-antenna proteins）、光合作用（photosynthesis）、脂肪酸降解（fatty acid degradation）、不飽和脂肪酸的生物合成（biosynthesis of unsaturatedfatty acids）（圖4）。

2.5 表現(xiàn)花臉癥狀蘋果果皮的激素相關(guān)DEGs分析

植物激素是調(diào)控植物生長發(fā)育和應(yīng)對環(huán)境變化的重要調(diào)節(jié)因子。在KEGG富集分析中，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是DEGs 富集數(shù)目最多的代謝通路之一，共有90 個DEGs得到富集（圖5）。上述與植物激素?? 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的90 個DEGs中，有51 個生長素（auxin，IAA）相關(guān)的DEGs，10 個細(xì)胞分裂素（cytokinin，CK）相關(guān)的DEGs，7 個赤霉素（gibberellins，GAs）相關(guān)的DEGs，6 個脫落酸（abscisic acid，ABA）相關(guān)的DEGs，2 個乙烯（ethylene，ET）相關(guān)的DEGs，8 個油菜素內(nèi)酯（brassinosteroid，BR）相關(guān)的DEGs，5 個茉莉酸（jasmonic acid，JA）相關(guān)的DEGs 和1 個水楊酸（salicylic acid，SA）相關(guān)的DEGs。

對上述90 個植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)DEGs 的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，其中24 個DEGs 相比于對照組表達(dá)水平是上調(diào)的，66 個DEGs 是下調(diào)的（圖5），筆者選取表達(dá)倍數(shù)差異顯著的前10 個基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其多數(shù)為生長素信號相關(guān)基因。通過設(shè)計基因特異性引物進(jìn)行qRT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)其與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，所有基因表達(dá)量均顯著下調(diào)（圖6，表3）。

2.6 表現(xiàn)花臉癥狀蘋果果皮中的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)分析

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長發(fā)育及抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。對DEGs中編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)共有194 個轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，并篩選出其中與植物抗病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族編碼基因：14 個WRKY家族蛋白編碼基因、14 個MYB家族蛋白編碼基因、12 個ERF 家族蛋白編碼基因和5個NAC家族蛋白編碼基因。與對照組相比，25個轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)，20個轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)下調(diào)（圖7）。為驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，筆者利用qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)，MdWRKY70（MD01G1168600）、MdWRKY71（MD17G1138100）、MdWRKY18- like（MD15G1039600）、MdNAC29（MD13G1063900）基因表達(dá)量顯著上調(diào)，而MdERF61（MD14G1127700）、MdMYB34-like（MD17G1051700）、MdWRKY7（MD1-7G10-48400）基因的表達(dá)量顯著下調(diào)，與轉(zhuǎn)錄組檢測結(jié)果一致（圖8）。

3 討論

近年來，在中國蘋果主產(chǎn)區(qū)，如山東、遼寧、陜西、甘肅、新疆、河北等地，蘋果銹果類病毒引發(fā)的病害逐年加重，已成為限制蘋果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素。但目前關(guān)于該病害的研究主要集中于ASSVd的檢測及序列分析，關(guān)于病害發(fā)生的機制等問題尚未見報道。筆者在本研究中借助RT-PCR和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對表現(xiàn)花臉癥狀的蘋果果皮進(jìn)行分析，共獲得了6938 個差異表達(dá)基因。并對差異表達(dá)基因的功能注釋進(jìn)行分析總結(jié)，為后續(xù)研究蘋果花臉病害發(fā)生的機制及相關(guān)代謝途徑提供了參考依據(jù)。

筆者在本研究中獲得的2 條ASSVd 序列與GenBank 中已收錄的來自煙臺地區(qū)富士蘋果上的ASSVd 分離物SDYT- 1（MW302328.1）和SDYT- 3（MW315909.1）完全一致，未發(fā)現(xiàn)堿基變異。有研究表明ADFVd 與ASSVd 同為Pospiviroidae 科Apscarviroid屬成員，其基因組RNA長度為306～310 nt，且與ASSVd 序列高度相似，含有ASSVd 序列的整個保守區(qū)域。

GO富集分析結(jié)果表明，表現(xiàn)花臉癥狀的蘋果果皮中的DEGs主要集中在細(xì)胞過程、代謝過程、細(xì)胞、細(xì)胞組分、結(jié)合和催化活性等功能；同時，KEGG分析發(fā)現(xiàn)DEGs富集程度最高的代謝通路是植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其次是苯丙烷生物合成和光合作用等通路，這說明花臉病對上述調(diào)控及反應(yīng)途徑有重要影響。

病原菌入侵會觸發(fā)植物體內(nèi)激素信號途徑而激活植物免疫反應(yīng)，提高植物抵御病原菌侵染的能力[19]。一般認(rèn)為，SA、JA 和ET 是植物抗病反應(yīng)中重要防御激素，SA 通常參與植物對活體營養(yǎng)型和半活體營養(yǎng)型病菌防衛(wèi)反應(yīng)的激活，JA 和ET 則負(fù)責(zé)激活對死體營養(yǎng)型病菌的抗性，其他激素如IAA、ABA、GA等通過相互作用直接或間接地參與調(diào)節(jié)植物的抗病性。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)花臉癥狀的蘋果果皮中SA信號途徑相關(guān)基因NPR4a（MD05G1256300）、JA 信號途徑相關(guān)基因TIFYs（MD13G1127100、MD09G1178600、MD02G1096100、MD16G1127400、MD17G1164400）和ET 信號途徑相關(guān)基因ERS1（MD03G1292200）表達(dá)水平下降，而EIN3（MD08G1245800）表達(dá)水平上調(diào)。然而，不同于典型的抗病反應(yīng)激素，表現(xiàn)花臉癥狀的蘋果果皮中IAA 途徑相關(guān)DEGs 數(shù)目最多，且多為編碼IAA 信號途徑中的關(guān)鍵酶和受體蛋白。IAA 信號途徑的相關(guān)基因的表達(dá)模式與對照組相比多呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，表明IAA 信號可能參與調(diào)控果實抗病性。同時基于IAA 對植物生長發(fā)育的影響，筆者推測花臉病的發(fā)生可能通過影響IAA 途徑相關(guān)基因，減緩了IAA 的生物合成，這可能是果實變小的原因之一。

當(dāng)植物受到外界脅迫刺激時，轉(zhuǎn)錄因子對于傳遞脅迫信號及啟動特定基因的表達(dá)具有重要作用[20]。研究表明，WRKY、MYB、ERF和NAC類轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物生長發(fā)育及防御過程，特別是WRKY類轉(zhuǎn)錄因子[19-20]。當(dāng)植物受到細(xì)菌、病毒等病原物侵染時，WRKY基因的轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后翻譯水平以及結(jié)合活性都會發(fā)生明顯變化[21]，從而調(diào)節(jié)植物抗性反應(yīng)。楊樹PsnWRKY70 基因與MARK級聯(lián)成員結(jié)合增強植物對葉枯病的抗性[22]；過表達(dá)蘋果MdWRKY100 基因正調(diào)控蘋果植株對炭疽病菌（Colletotrichum）的抗性[23]。MYB類轉(zhuǎn)錄因子主要通過調(diào)節(jié)植物的過敏反應(yīng)（hypersensitive respo

nse，HR）和系統(tǒng)性獲得抗性（systemic acquired resistance，SAR）來增強植物對病原菌的抗性[24]。此外，ERF 和NAC家族蛋白也在植物抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，如過表達(dá)MdERF11 增強蘋果對輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）的抗性[25]。水稻OsNAC6的表達(dá)受稻瘟菌所誘導(dǎo)，過量表達(dá)水稻OsNAC6 基因提高了水稻對稻瘟病的抗性。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)花臉病的果皮中大量WRKY、MYB、ERF類轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。其中，MdWRKY70、MdWRKY71、MdWRKY18- like 和MdNAC29 表達(dá)受到顯著誘導(dǎo)，而MdERF61、Md-MYB34- like 和MdWRKY72 表達(dá)則受到顯著抑制。推測轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)控下游結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，參與寄主對病原菌的抗病反應(yīng)。但關(guān)于其準(zhǔn)確的內(nèi)在機制還有待進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

筆者在本研究中對表現(xiàn)花臉癥狀的富士蘋果果皮進(jìn)行分析，分離得到2 個ASSVd序列。轉(zhuǎn)錄組測序分析共獲得6938 個差異表達(dá)基因。利用基因功能注釋分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因多參與植物激素信號途徑及苯丙烷代謝途徑。此外，與抗病相關(guān)的WRKY、MYB、ERF 類轉(zhuǎn)錄因子可能參與到蘋果對花臉病的防御過程。

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