李怡歆,陳 勇,劉曉祿,艾尼江·爾斯?jié)M,徐李娟,4,劉倩倩,包曉瑋,宋素琴

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830091;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052;3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與農(nóng)業(yè)節(jié)水研究所,烏魯木齊 830091;4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,烏魯木齊 830052;5.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十三師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,新疆額敏 839000)

0 引 言

【研究意義】極端環(huán)境包括高壓、高堿、高酸、高溫、高鹽和高輻射等[1]。極端環(huán)境的微生物因其生存的極端環(huán)境決定其生長繁殖以及代謝路徑等[2]。且代謝產(chǎn)物能抵抗外界對(duì)自身的傷害[3]。鹽湖因蘊(yùn)含豐富的氯化鈉,是一種咸水化水體。新疆是我國內(nèi)陸鹽類主要產(chǎn)地之一,例如羅布泊鹽湖、艾比鹽湖、巴里坤鹽湖、達(dá)坂城鹽湖和烏爾禾鹽湖等?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】從達(dá)坂城鹽湖分離到的微生物大多屬于Firmicutes和γ-proteobacteria兩大類群,包括鹽單胞菌屬(Halomonas)、枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、喜鹽芽孢桿菌屬 (Halobacillus)、鹽水球菌屬 (Salinicoccus)、Ornithinibacillus、Oceanobacillus、Thalassobacillus和Salimicrobium[4];以及中度嗜鹽菌Moderatelyhalophilicbacteria[5]、嗜鹽古菌Natrialba、Haloarcula、Haloterrigena、Halorubrum等[6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】從普通環(huán)境例如土壤及植物體內(nèi)分離出的活性菌株及其活性代謝產(chǎn)物的種類具有極高的重復(fù)率。目前,對(duì)新疆達(dá)坂城鹽湖嗜鹽細(xì)菌的研究較少,需要進(jìn)一步挖掘達(dá)坂城鹽湖的嗜鹽菌資源?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采集達(dá)坂城鹽湖湖邊淤泥,選用不同的分離培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行嗜鹽細(xì)菌的分離培養(yǎng),根據(jù)形態(tài)進(jìn)行分離,結(jié)合16S rRNA 基因序列,對(duì)部分放線菌開展活性研究,為研究新疆達(dá)坂鹽湖地區(qū)嗜鹽細(xì)菌物種基因資源的多樣性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣 品

于新疆達(dá)坂城鹽湖(88°03′53″～88°12′15″E, 43°21′00″～43°25′25″N),湖水邊緣,用采集器采集15～20 cm深處的淤泥樣品,分裝于無菌密封袋,置于4℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

M-2(海藻糖-脯氨酸)培養(yǎng)基:Trehalose 6g,Proline 1 g,KNO30.5 g,Na2HPO40.3 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,CaCl20.5 g,agar15 g,H2O 1 L,pH 7.2

MM瓊脂培養(yǎng)基[7]:glucose 0.5 g, yeast extract 0.5 g,K2HPO40.3 g,NaCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 1 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,CaCO30.1 g,MnCl·4H2O 0.02 g,ZnSO40.07 g,agar 15 g,H2O 1 L,pH 7.2。

M-7(甘油-天門冬酰胺)培養(yǎng)基:Glycerol 10.0 g,Asparagine 1 g,K2HPO41 g,微量鹽1 ml,agar 15 g,H2O 1 L,pH 7.2。

M-1(TWYE):Yeast 0.25 g, K2HPO40.5 g,agar 15 g,H2O 1 L,pH 7.2。

每種培養(yǎng)基滅菌前均添加終濃度為25 mg/L的萘啶酮酸和50 mg/L的制霉菌素。

拮抗植物病原菌采用PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑

NaOH、NaCl、MgSO4、MnCl2等均為化學(xué)純。

1.1.4 植物病原菌

西瓜枯萎(尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum)、水稻惡苗(串珠鐮孢菌Fusariummoliniforme)、棉花枯萎(尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum)、核桃腐爛病(殼囊孢Cycosporasp.)、蘋果樹腐爛病(殼囊孢Valsamalivar.mali)。以上病原菌由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)種子健康中心提供。

腫瘤細(xì)胞:腫瘤細(xì)胞采用人肝癌細(xì)胞HepG2,由浙江大學(xué)海洋學(xué)院提供。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的分離和純化

稱取6 g土樣,在干燥箱中進(jìn)行70℃烘干處理2 h[8],之后從中稱取2 g加人盛有18 mL無菌水的三角燒瓶中,振蕩1 h后吸取1 mL土壤懸浮液到含9 mL無菌水的試管中,制成10-2的土壤懸液,按10倍法依次稀釋至10-4。吸取10-2和10-4濃度的稀釋液各0.2 mL,分別接于上述平板培養(yǎng)基上,每個(gè)稀釋度2個(gè)重復(fù),用涂布棒均勻涂布后置于30和37℃恒溫下倒置培養(yǎng),并采用劃線分離法對(duì)菌株進(jìn)一步的純化分離,4℃斜面保存,根據(jù)形態(tài)特征和培養(yǎng)特征對(duì)放線菌進(jìn)行鑒定[9]。

1.2.2 相關(guān)模式菌株

構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹外源菌:Bacillussubtilis(AS1.1849)。

1.2.3 16S rRNA序列的測定

1.2.3.1 細(xì)菌總DNA的提取

在滅菌的2 mL/1.5mL的離心管中加入20 μL 無菌水,用槍頭挑取適量菌體,混勻并標(biāo)記。100℃沸水浴沸騰5 min,放入-20℃冷凍5 min,此步驟重復(fù)2次,28℃,5 000 r/min,離心3 min。

1.2.3.2 16S rRNA序列的PCR擴(kuò)增

采用細(xì)菌通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3`)擴(kuò)增菌株16S rRNA 序列。PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5 min,主循環(huán)(94℃,30 s;54℃,30 s;72℃,30 s),循環(huán)30次,終延伸72℃,7 min,4℃保存。擴(kuò)增中利用水代替 DNA 模板作為空白對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測,陽性產(chǎn)物送至北京鼎國昌盛生物技術(shù)責(zé)任股份有限公司進(jìn)行純化測序,測序結(jié)果與 GenBank 的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.2.4 基于16S rRNA 的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)

用MEGA 7.0的 Neighbor-Joining 法構(gòu)建16S rRNA 相似序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.5 菌株發(fā)酵液以及粗提物的制備

在超凈工作臺(tái)內(nèi),用10 μL的槍頭挑取放線菌菌落,轉(zhuǎn)接于甘油-天門冬酰胺液體培養(yǎng)基,30℃,180 r/min,恒溫震蕩培養(yǎng)5～7 d。待發(fā)酵完成后,用乙酸乙酯等體積混合震蕩萃取發(fā)酵液3次,回收濃縮得發(fā)酵液粗提物。

1.2.6 拮抗菌株篩選

1.2.6.1 抗菌活性

采用平板對(duì)峙法測定所分離到的放線菌對(duì)植物病原菌的抑菌效果。在超凈臺(tái)內(nèi),用5 mm打孔器將PDA平板打孔,每個(gè)平板打四個(gè)孔,打孔位置距離培養(yǎng)皿中心距離相等,用滅菌竹簽挑取植物病原菌的新鮮孢子接于平板中心,再用槍頭吸取100 μL離心后的菌株發(fā)酵液上清液,注入孔內(nèi),以不接發(fā)酵液的平板為對(duì)照,28℃培養(yǎng), 5～7 d后觀察記錄有無抑菌圈產(chǎn)生。

1.2.6.2 抗腫瘤活性篩選

選用人源細(xì)胞株HepG2(人肝癌細(xì)胞株)為檢測對(duì)象,采用磺酰羅丹明B(SRB)方法[10]檢測菌株發(fā)酵液粗提物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用,菌株粗提物用DMSO配成10 mg/ml得濃度。

收集對(duì)數(shù)生長期HepG2細(xì)胞并以8×103細(xì)胞/孔的密度種于96孔板內(nèi),過夜培養(yǎng)后加藥,以阿霉素為陽性藥,設(shè)置3個(gè)重復(fù),繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后取出96孔板,棄去培養(yǎng)基后每孔加入100 μL 10%的三氯乙酸水溶液,4℃冰箱中固定至少2 h。然后取出96孔板,棄去三氯乙酸溶液,并用緩慢流動(dòng)的水沖洗至少4遍并烘干,再加入80 μL 1%醋酸配制的0.4% SRB溶液染色20 min,期間配置1%醋酸水溶液,染色結(jié)束后用1%醋酸水溶液沖洗4遍以去除未結(jié)合的染料,再次烘干至完全干燥后每孔加入100 μL 10 mM Tris溶液,并震蕩使與蛋白結(jié)合的染料完全溶解,再置于酶標(biāo)儀中于515 nm處檢測吸光度。

抑制率=(對(duì)照組OD值-給藥組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 達(dá)坂城鹽湖嗜鹽細(xì)菌的分離鑒定

研究表明,共獲得14個(gè)屬18株嗜鹽細(xì)菌,其中 M-7培養(yǎng)基(甘油-天門冬酰胺) 共分離到 11個(gè)屬 13個(gè)不同種的嗜鹽細(xì)菌。表1,圖1

表1 不同培養(yǎng)基分離到的嗜鹽細(xì)菌種屬

注:a:菌株DBC23;b:菌株DBC30;c:菌株DBC31;d:菌株DBC5;e:菌株DBC9;f:菌株DBC10

2.2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)

研究表明,菌株18位于Bacillus的屬中,和眾多Bacillus在同一個(gè)分支上,菌株18與其親緣關(guān)系較近,同源性為95.93%。菌株23屬于Nocardioides屬,且單獨(dú)位于一個(gè)較長分支上,同源性為97.43%。圖2,圖3

圖2 菌株18基于 16S rRNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 菌株23基于 16S rRNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 放線菌發(fā)酵液的抗菌活性

研究表明,DBC26、DBC31和DBC5對(duì)病原菌具有潛在的抗菌活性,其中DBC26和DBC31有拮抗棉花枯萎病菌活性,為Tsukamurellasinensis和Nocardiopsiscrassaminis,DBC5有抗水稻惡苗病菌活性,是Streptomyceslongispororuber。表3

表3 達(dá)坂城鹽湖嗜鹽放線菌抗菌活性

2.4 放線菌粗提物抗腫瘤活性

研究表明,菌株DBC5對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制率最高,達(dá)到了96.4%;其次是菌株DBC9,抑制率為91.8%;菌株DBC10和菌株DBC26的抑制率分別為87.8%和83.2%;菌株DBC24的抑制活性較弱,抑制率僅為16.7%,而菌株DBC3對(duì)HepG2細(xì)胞增殖沒有抑制率。表4

3 討 論

3.1研究共獲得14個(gè)屬18株嗜鹽細(xì)菌,其中芽孢桿菌屬(Bacillus)、諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)和鏈霉菌屬(Streptomyces)為優(yōu)勢菌屬,且放線菌大多為稀有放線菌。其中 M-7培養(yǎng)基(甘油-天門冬酰胺) 共分離到 11個(gè)屬 13個(gè)不同種的嗜鹽細(xì)菌,分離效果好于其他3種培養(yǎng)基, 認(rèn)為M-7(甘油-天門冬酰胺)培養(yǎng)基分離鹽湖可以得到較多種類的嗜鹽細(xì)菌?？赡苁且?yàn)楦视吞荚?能適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓;而L-天門冬酰胺可能是鹽湖微生物賴以生存的一種有機(jī)酸,滿足了高鹽環(huán)境嗜鹽細(xì)菌的生理和特殊的營養(yǎng)需求。用M-7(甘油-天門冬酰胺)培養(yǎng)基分離死海嗜鹽放線菌[11]。

表4 鹽湖放線菌發(fā)酵液粗提物對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用

3.2極端環(huán)境生長的放線菌所需的營養(yǎng)條件不同于普通環(huán)境的放線菌,鹽湖環(huán)境除了高鹽的特性,還存在著豐富的化學(xué)離子,如Na+、K+、Mg2+、SO42-等,李二陽[12]和唐蜀昆[13]等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)湖水化學(xué)成分出現(xiàn)差異,會(huì)導(dǎo)致菌群結(jié)構(gòu)特異演化。離子成分對(duì)鹽湖微生物的生長起著驅(qū)動(dòng)作用,為培養(yǎng)基成分的選擇提供了參考。因此,在分離鹽湖環(huán)境的菌株時(shí),應(yīng)充分考慮分離條件和培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)。分離出較多放線菌的M-7培養(yǎng)基中,成分包括了除Na+外的K+、Mg2+。此外,試驗(yàn)設(shè)置了30和37℃2個(gè)溫度梯度,發(fā)現(xiàn)37℃條件下分離放線菌的效果優(yōu)于30℃,冢村氏菌(Tsukamurella)是從達(dá)坂城鹽湖分離出的稀有放線菌,放線菌的分離存在著溫度效應(yīng)[14]。

3.3菌株DBC23和菌株DBC18的16S rRNA序列與已知的菌株 16S rRNA序列相似度分別在97.43%和95.53%,為潛在新種,需要進(jìn)一步研究。抑菌實(shí)驗(yàn)中篩選到3株具有拮抗活性的放線菌,進(jìn)行了初步的拮抗活性篩選,其中具有拮抗活性的放線菌3株,屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)冢村氏菌屬(Tsukamurella)。而關(guān)于冢村氏菌的活性報(bào)道較少,放線菌(DBC26)值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

從新疆達(dá)坂城鹽湖湖邊15-20cm深的淤泥樣品中分離出了18株菌,鑒定為14個(gè)屬,是Bacillus(2株)、Pseudoxanthomonas(1株)、Rhodococcus(1株)、Micromonospora(1株)、Streptomyces(2株)、Brevibacterium(1株)、Tsukamurella(2株)、Planococcus(1株)、Nocardiodes(1株)、Metabacillus(1株)、Paenibacillus(1株)、Microbacterium(1株)、Micrococcus(1株)、Nocardiopsis(2株)。其中冢村氏菌(Tsukamurella)是從達(dá)坂城鹽湖中分離出。對(duì)放線菌進(jìn)行了抗植物病原菌測試,其中DBC5、DBC26和DBC31分別對(duì)水稻惡苗和棉花枯萎具有初步的抑制效果,DBC5、DBC9的細(xì)胞增殖抑制率均在90%以上。