王志珍

（中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所，北京 100101）

鄒承魯先生是近代中國(guó)生物化學(xué)的奠基人之一，一生致力于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究，在細(xì)胞色素與呼吸鏈酶系、人工合成胰島素、酶活性不可逆抑制動(dòng)力學(xué)、酶活性部位的柔性以及蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶等不同領(lǐng)域都做出了重大貢獻(xiàn)。

1964 年我從中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生物物理系畢業(yè)，被分配到中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所。后有幸在鄒先生實(shí)驗(yàn)室工作近20 年，在鄒先生的指導(dǎo)和幫助下，對(duì)胰島素A、B鏈相互作用、蛋白質(zhì)折疊以及幫助蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶和折疊酶開(kāi)展了一些研究工作。鄒先生在科學(xué)研究和做人做事上的言傳身教是我一生彌足珍貴的收獲。時(shí)值鄒先生百年誕辰，希望用這篇短文回顧?quán)u先生在蛋白質(zhì)折疊領(lǐng)域的創(chuàng)新研究及一些后續(xù)工作，以緬懷這位中國(guó)生物化學(xué)與生物物理學(xué)界德高望重的前輩。

1 人工全合成胰島素中的蛋白質(zhì)折疊問(wèn)題

蛋白質(zhì)正確的三維結(jié)構(gòu)是其行使生物學(xué)功能的前提。如何從線性的多肽鏈形成復(fù)雜精巧的三維結(jié)構(gòu)，這就是蛋白質(zhì)折疊問(wèn)題。美國(guó)國(guó)立健康研究院（NIH）的Christian Anfinsen 在上世紀(jì)五、六十年代，系統(tǒng)研究了牛胰核糖核酸酶A的氨基酸序列與生物學(xué)活性構(gòu)象之間的關(guān)系，提出了著名的熱力學(xué)假說(shuō) “一個(gè)天然蛋白質(zhì)在其生理環(huán)境中的三維結(jié)構(gòu)是整個(gè)系統(tǒng)的吉布斯自由能最低的結(jié)構(gòu)”，也就是我們常說(shuō)的“蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)”的原理［1］。這一發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了分子生物學(xué)的中心法則中遺傳信息從一維多肽鏈傳遞到三維蛋白質(zhì)的空白，開(kāi)創(chuàng)了近代蛋白質(zhì)折疊研究的時(shí)代。Anfinsen也因此獲得了1972年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

幾乎同一時(shí)期（1958年），包括鄒承魯先生在內(nèi)的中國(guó)最優(yōu)秀的生物化學(xué)家和有機(jī)化學(xué)家們，提出了向新中國(guó)國(guó)慶10 周年獻(xiàn)禮的項(xiàng)目“合成一個(gè)蛋白質(zhì)”。胰島素是當(dāng)時(shí)唯一被測(cè)定氨基酸序列的蛋白質(zhì)，由分別含有21和30個(gè)氨基酸殘基的A、B兩條肽鏈組成，鏈間由兩個(gè)二硫鍵連接，A鏈還有一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。當(dāng)時(shí)國(guó)際上已經(jīng)有了合成不同長(zhǎng)度肽段的經(jīng)驗(yàn)，但像胰島素這樣含有兩條肽鏈和多個(gè)二硫鍵的蛋白質(zhì)人工全合成還沒(méi)有先例。這是一個(gè)從0到1的創(chuàng)舉！最為現(xiàn)實(shí)的合成路線可能是分別合成A鏈和B鏈，然后通過(guò)巰基的氧化使兩條鏈正確組合，而這一方案中最為關(guān)鍵的問(wèn)題是合成的A鏈和B鏈能否氧化而形成天然的胰島素分子。當(dāng)時(shí)35歲的鄒先生，帶領(lǐng)杜雨蒼、魯子賢、張友尚、許根俊等幾位大學(xué)畢業(yè)不久的年輕研究人員承擔(dān)起“胰島素拆合”工作：把天然胰島素分子拆分成A鏈和B鏈，再把分開(kāi)的A鏈和B鏈重組成具有生物學(xué)活性的胰島素分子。1959 年，鄒先生小組就實(shí)現(xiàn)了胰島素的成功拆合，重組的胰島素活力恢復(fù)到10%。由于當(dāng)時(shí)的政治環(huán)境，國(guó)內(nèi)科技期刊普遍停刊，同時(shí)德國(guó)和美國(guó)也在進(jìn)行胰島素合成的競(jìng)爭(zhēng)，鄒先生小組的結(jié)果沒(méi)有得到及時(shí)發(fā)表。而1960 年Dixon和Wardlaw［2］在《自然》（Nature）雜志上報(bào)道了還原的胰島素A 鏈和B 鏈共同氧化得到1%~2%的胰島素活力。1961年10月，鄒先生小組才在《中國(guó)科學(xué)》復(fù)刊后的第一期上發(fā)表了1959年就得到的結(jié)果［3］。無(wú)論從時(shí)間上還是在質(zhì)量上，中國(guó)人進(jìn)行的胰島素A、B鏈重組都領(lǐng)先于世界。這一成果不但解決了胰島素的合成路線問(wèn)題，也確保了人工合成的A鏈和B鏈能夠以高產(chǎn)率重組成為活性胰島素分子。

胰島素A、B 鏈拆合與Anfinsen 的核糖核酸酶復(fù)性工作非常相似，也幾乎是同時(shí)完成的。后者是將變性狀態(tài)的4個(gè)二硫鍵全部還原的核糖核酸酶肽鏈重新氧化折疊恢復(fù)活力。核糖核酸酶只有1條肽鏈，其4個(gè)二硫鍵的所有組合方式有105種可能性；而胰島素則是由2 條肽鏈組成，2 條肽鏈可能以不同的比例與方式組合，其6個(gè)巰基所有的可能組合方式則是無(wú)窮多，其復(fù)性問(wèn)題遠(yuǎn)遠(yuǎn)復(fù)雜得多。當(dāng)時(shí)鄒先生小組總結(jié)出“天然胰島素的結(jié)構(gòu)是所有AB異構(gòu)物中最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)之一”的重要結(jié)論。但是由于此工作的任務(wù)導(dǎo)向性加上“文革”的種種干擾，他們未能有機(jī)會(huì)去提煉A、B鏈拆合成功所蘊(yùn)含的蛋白質(zhì)折疊問(wèn)題。

20世紀(jì)70年代末 “科學(xué)的春天”到來(lái)，鄒承魯先生在中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所重拾胰島素A、B鏈重組的“老題”，新做其機(jī)制的研究。我從國(guó)外訪學(xué)回國(guó)加入了鄒先生領(lǐng)導(dǎo)的這一課題，作為co-PI爭(zhēng)取到美國(guó)國(guó)立健康研究院的國(guó)際研究基金。在鄒先生指導(dǎo)下，我們運(yùn)用各種生物物理和生物化學(xué)方法研究胰島素A、B 鏈和各種化學(xué)修飾的A、B鏈在不同溶液條件下的相互作用，進(jìn)一步總結(jié)出胰島素分子折疊的觀點(diǎn)：“胰島素A、B 鏈本身已經(jīng)具有一定的結(jié)構(gòu)，含有形成天然胰島素正確結(jié)構(gòu)的全部信息，能在溶液中相互識(shí)別和相互作用，從而導(dǎo)致3 個(gè)二硫鍵（2 個(gè)鏈間二硫鍵和1 個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵）正確配對(duì)，形成結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的天然胰島素分子”［4］，闡明從人工全合成的胰島素A 鏈和B 鏈生成天然胰島素分子的蛋白質(zhì)折疊規(guī)律，揭示了人工合成胰島素中A、B鏈成功重組的理論基礎(chǔ)。

2 蛋白質(zhì)折疊與分子伴侶

1991 年中國(guó)啟動(dòng)了國(guó)家基礎(chǔ)性研究重大項(xiàng)目計(jì)劃（“攀登計(jì)劃”）。鄒承魯先生承擔(dān)了首批30個(gè)項(xiàng)目中的“新生肽鏈及蛋白質(zhì)折疊的研究”，下設(shè)“蛋白質(zhì)折疊與去折疊的一般規(guī)律”（周海夢(mèng)）、“酶活性部位柔性”（周筠梅）、“新生肽鏈折疊”（靜國(guó)忠）、“蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分子設(shè)計(jì)”（王志新和潘憲明）、“幫助蛋白質(zhì)折疊的生物大分子——分子伴侶和折疊酶”（王志珍）5 個(gè)子課題。這一項(xiàng)目取得了一批具有國(guó)際水平的研究成果，同時(shí)編寫(xiě)了《攀登計(jì)劃普及叢書(shū)》中的“第二遺傳密碼？——新生肽鏈及蛋白質(zhì)折疊的研究”，用通俗語(yǔ)言向社會(huì)大眾講述蛋白質(zhì)折疊的科學(xué)問(wèn)題。

當(dāng)時(shí)主流的蛋白質(zhì)折疊研究是用完全變性蛋白質(zhì)的完整肽鏈重新折疊進(jìn)行的。鄒先生很早就意識(shí)到細(xì)胞中新生肽鏈的折疊與蛋白質(zhì)在體外試管里的折疊是不一樣的。1988 年，他在《生物化學(xué)》（Biochemistry）雜志上發(fā)表文章［5］，提出了新生肽折疊的一個(gè)假說(shuō)：在細(xì)胞中，新生肽的卷曲折疊在其合成過(guò)程中就已經(jīng)開(kāi)始了，這些最初形成的結(jié)構(gòu)隨著肽鏈在核糖體上延伸的同時(shí)進(jìn)行調(diào)整，可能與它在最終全長(zhǎng)蛋白質(zhì)中的天然構(gòu)象并不一致，并在合成完成后經(jīng)最終的修正而完成折疊。這就指出了一個(gè)非常重要的科學(xué)問(wèn)題：細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)是如何折疊的？

胰島素拆合以及Anfinsen核糖核酸酶復(fù)性都是在體外較低的蛋白質(zhì)濃度和較溫和的氧化條件下實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞內(nèi)新生肽鏈折疊和成熟是在相對(duì)高的溫度、相當(dāng)高的濃度而又十分擁擠的環(huán)境中以極快的速度和極高的保真度高效進(jìn)行，往往需要分子伴侶和折疊酶兩類作用機(jī)制不同的“幫助蛋白”保駕護(hù)航。折疊酶能夠催化蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中二硫鍵形成、脯氨酸順?lè)串悩?gòu)等化學(xué)鍵變化；而分子伴侶是在20 世紀(jì)80 年代才發(fā)現(xiàn)的“一類具有相似功能的不同蛋白質(zhì)，能幫助促進(jìn)其他大分子（包括蛋白質(zhì)、核酸）進(jìn)行非共價(jià)的折疊、解折疊、組裝、解組裝，但并不是后者發(fā)揮正常生物學(xué)功能時(shí)的永久組成部分”，確切地說(shuō)，分子伴侶是蛋白質(zhì)一種新功能的定義。

在研究胰島素A、B鏈重組機(jī)制的過(guò)程中，我們已經(jīng)開(kāi)始思考細(xì)胞內(nèi)幫助胰島素折疊的分子，并成功運(yùn)用蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）獲得高效的重組。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)對(duì)分子伴侶新概念的認(rèn)識(shí)，提出了“PDI既是酶又是分子伴侶”的假說(shuō)，并為此假說(shuō)提供了一系列的實(shí)驗(yàn)支持［6］。我們用實(shí)驗(yàn)區(qū)分了PDI固有的且相互獨(dú)立的異構(gòu)酶和分子伴侶兩種活力，揭示PDI幫助生理底物蛋白的折疊需要其異構(gòu)酶和分子伴侶兩種活力協(xié)同作用，缺一不可［7］。原核生物大腸桿菌中的DsbC 相應(yīng)于真核生物的PDI，我們也鑒定了DsbC 的分子伴侶活力，這是在大腸桿菌周質(zhì)腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)的首個(gè)分子伴侶［8］。這些發(fā)現(xiàn)不僅僅是發(fā)現(xiàn)一個(gè)蛋白質(zhì)新的活性，更重要的是打破了折疊酶和分子伴侶這兩大類幫助蛋白的界限。PDI也是分子伴侶的概念，已為國(guó)內(nèi)外同行廣泛接受，特別是分子伴侶概念的提出者John Ellis 在其綜述文章中肯定了PDI 的分子伴侶特性［9］，他曾一度斷言“PDI不是分子伴侶”。

通過(guò)與結(jié)構(gòu)生物學(xué)家合作，我們最終解析了人源PDI 氧化態(tài)和還原態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)［10］，直接展示了PDI氧化還原調(diào)控的構(gòu)象變化及其結(jié)合底物的不同模式，總結(jié)出PDI家族蛋白行使分子伴侶活力所需要的結(jié)構(gòu)特征。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞應(yīng)激條件下PDI發(fā)生磷酸化，實(shí)現(xiàn)其異構(gòu)酶和分子伴侶活力兩種功能間的切換［11］。

30 年來(lái)，我們課題組新一代研究人員廣泛運(yùn)用新知識(shí)和新技術(shù)，深入研究了PDI及其家族成員幫助蛋白質(zhì)氧化折疊的分子機(jī)制和生物學(xué)功能，重構(gòu)以PDI與其上游氧化酶Ero1α為中樞、多種過(guò)氧化物酶并行參與的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)氧化折疊網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵酶的翻譯后修飾對(duì)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)氧化折疊和氧化還原穩(wěn)態(tài)的全新方式和一系列新的認(rèn)識(shí)。通過(guò)細(xì)胞和模式生物的研究，將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)氧化折疊和氧化還原穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)與衰老、腫瘤、心血管病等發(fā)病機(jī)制密切聯(lián)系起來(lái)，為這些疾病的干預(yù)或治療提供新的策略。2022 年王磊研究員和我應(yīng)邀在《Trends in Biochemical Sciences》期刊發(fā)表綜述文章，全面總結(jié)了酵母、植物、哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì)氧化折疊機(jī)制，深入討論了蛋白質(zhì)氧化折疊在不同生理和病理過(guò)程中的作用［12］。

3 推動(dòng)學(xué)界認(rèn)識(shí)中國(guó)科學(xué)家對(duì)蛋白質(zhì)折疊早期研究的巨大貢獻(xiàn)

對(duì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)最早來(lái)自于蛋白質(zhì)變性的研究，蛋白質(zhì)變性成為蛋白質(zhì)折疊問(wèn)題研究的前奏和基礎(chǔ)。20 世紀(jì)20 年代中國(guó)杰出生物化學(xué)家吳憲教授基于其在北平協(xié)和醫(yī)學(xué)院生化系開(kāi)展的蛋白質(zhì)變性實(shí)驗(yàn)的研究工作，提出了世界上第一個(gè)“蛋白質(zhì)變性”理論：天然可溶性蛋白質(zhì)的長(zhǎng)肽鏈一定是由氨基酸的各種極性基團(tuán)被分子內(nèi)的某種次級(jí)鍵按一定方式連接而形成有規(guī)律的折疊，使蛋白質(zhì)分子具有一種緊密的構(gòu)型（即今天的“conformation（構(gòu)象）”概念）。蛋白質(zhì)的這種次級(jí)鍵一旦被物理、化學(xué)的力破壞，構(gòu)型就被打開(kāi)，肽鏈則由有規(guī)律的折疊而變?yōu)闊o(wú)序、松散的形式，即發(fā)生了變性。1929 年他在第13 屆國(guó)際生理學(xué)大會(huì)上系統(tǒng)闡述了這一理論，隨后于1931 年以英文發(fā) 表 在《Chinese Journal of Physiology》 雜 志上［13］。然而這一重要發(fā)現(xiàn)在當(dāng)時(shí)并沒(méi)有得到廣泛的關(guān)注。學(xué)界更為人知的反倒是5年后Mirsky和諾獎(jiǎng)獲得者Pauling 共同發(fā)表的非常類似的蛋白質(zhì)變性理論的工作［14］。

鄒承魯先生很早就關(guān)注到吳憲教授“蛋白質(zhì)變性”理論的學(xué)術(shù)貢獻(xiàn)，他認(rèn)為中國(guó)大多數(shù)生物化學(xué)工作者也許知道吳憲的名字，但并不熟悉吳憲對(duì)世界生物化學(xué)作出的重大貢獻(xiàn)，沒(méi)有充分認(rèn)識(shí)吳憲在世界生物化學(xué)發(fā)展史上所占有的地位，必須大力宣傳中國(guó)科學(xué)家的科研成就，弘揚(yáng)他們的科學(xué)精神。1993年吳憲教授誕辰100周年，時(shí)任中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)理事長(zhǎng)的鄒先生就在第七屆全國(guó)生化大會(huì)上，專門(mén)組織了“紀(jì)念吳憲的蛋白質(zhì)變性理論”的專題討論會(huì)。鄒先生邀請(qǐng)了吳憲教授之子、美國(guó)康奈爾大學(xué)的吳瑞教授介紹吳憲教授一生主要的科學(xué)發(fā)現(xiàn)，他本人則詳細(xì)介紹了吳憲教授在蛋白質(zhì)變性領(lǐng)域所做的開(kāi)創(chuàng)性貢獻(xiàn)。

1995 年，蛋白質(zhì)研究的前輩、著名生化學(xué)家哈佛大學(xué)John Edsall 教授把吳憲教授1931 年發(fā)表在《Chinese Journal of Physiology》雜志上的文章重新全文印發(fā)在《Advances in Protein Chemistry》上，并配發(fā)他親自撰寫(xiě)的評(píng)論“吳憲與第一個(gè)蛋白質(zhì)變性理論（1931）”［15］，確定了吳憲是認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)分子天然狀態(tài)和變性狀態(tài)之間關(guān)系的第一人，他的理論是該領(lǐng)域的里程碑，在國(guó)際生化界還原歷史的本來(lái)面目。我看到Edsall 的這篇文章十分激動(dòng)，隨即與鄒先生一起寫(xiě)了一篇評(píng)述文章《立足國(guó)內(nèi) 走向世界——從吳憲教授六十四年前一篇論文的重新發(fā)表談起》［16］，進(jìn)一步介紹了中國(guó)科學(xué)家在蛋白質(zhì)折疊研究中作出的國(guó)際公認(rèn)的巨大貢獻(xiàn)以及對(duì)此的思考。鄒先生強(qiáng)調(diào)了吳憲十余年的研究積累都是在中國(guó)的實(shí)驗(yàn)室里完成的，在發(fā)表了12 篇論文后才提出一個(gè)理論，體現(xiàn)了研究成果嚴(yán)謹(jǐn)和扎實(shí)。鄒先生特別指出吳憲的工作盡管是用英文發(fā)表，沒(méi)有得到應(yīng)有的關(guān)注；這一點(diǎn)他自己也深有體會(huì)，胰島素重組的工作同樣是用英文發(fā)表，也沒(méi)有及時(shí)在國(guó)際上得到應(yīng)有的肯定。鄒先生30 年前呼吁中國(guó)的科學(xué)必須“沖出亞洲，走向世界”，在今天仍然具有極大的重要性和現(xiàn)實(shí)意義。科學(xué)研究必須堅(jiān)持開(kāi)放，把大門(mén)開(kāi)得更大，把科學(xué)和人才的國(guó)際交流做得更有創(chuàng)新性、更加活躍。

4 展 望

隨著AlphaFold的橫空出世［17］，科學(xué)家已經(jīng)能夠依據(jù)一級(jí)序列相當(dāng)準(zhǔn)確地計(jì)算預(yù)測(cè)出幾乎所有蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，甚至有人認(rèn)為人工智能已經(jīng)解決了蛋白質(zhì)折疊問(wèn)題。三維結(jié)構(gòu)只是蛋白質(zhì)折疊在熱力學(xué)上的終點(diǎn)，姑且不談蛋白質(zhì)折疊是否只有唯一的終點(diǎn)，鄒承魯先生早在1988 年提出新生肽折疊模型時(shí)就指出，多肽鏈折疊是一個(gè)不斷變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，蛋白質(zhì)折疊更重要的是從不斷延伸的新生肽鏈起點(diǎn)到天然構(gòu)象終點(diǎn)間的過(guò)程，也就是蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)力學(xué)問(wèn)題。這也許是當(dāng)前AlphaFold 應(yīng)當(dāng)努力的方向之一［18］。細(xì)胞內(nèi)新生肽鏈成為有活性的功能成熟蛋白質(zhì)過(guò)程，則是更為復(fù)雜的廣義的蛋白質(zhì)折疊問(wèn)題。核糖體孔道對(duì)正在翻譯的新生肽鏈形成初始結(jié)構(gòu)非常重要。在翻譯進(jìn)行的同時(shí)或翻譯完成后，新生肽鏈往往還需經(jīng)歷如二硫鍵形成、N-糖基化、蛋白酶剪切等各種修飾加工，這些修飾與肽鏈的折疊也密切相關(guān)。新生肽鏈還需要被轉(zhuǎn)運(yùn)到特定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位包括分泌到胞外，才能發(fā)揮特定的生物功能。這些過(guò)程往往要經(jīng)歷跨膜甚至是多次的跨膜，一般來(lái)說(shuō)蛋白質(zhì)需要解折疊才能跨膜，跨膜后的蛋白質(zhì)又需要重折疊。錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)需要被及時(shí)清除。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊在各個(gè)步驟都涉及與其他生物大分子特別是分子伴侶的相互作用。任何一個(gè)環(huán)節(jié)出問(wèn)題都會(huì)引起蛋白質(zhì)折疊的錯(cuò)誤和病變的風(fēng)險(xiǎn)。未來(lái)將發(fā)展更高分辨率、更快速的成像技術(shù)，拍攝在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊更加精準(zhǔn)精細(xì)的動(dòng)態(tài)電影，從而揭開(kāi)蛋白質(zhì)折疊的真實(shí)面目。