孫澳，郭潤姿，田園，伊君梅，柯尊陽，宋衛(wèi)衛(wèi)，邱創(chuàng)鈞，李忠明，王宇，于繼云

固安鼎泰海規(guī)生物科技有限公司，河北廊坊065000

NMM［N：紐約食管鱗狀細胞癌1（New York esophageal squamous cell carcinoma 1，NY-ESO-1）；M：黏蛋白1（mucin 1，MUC-1）；M：黑色素瘤抗原家族A3（melanoma-associated antigen gene-A3，MAGE-A3）］腫瘤治療性DNA 疫苗裸質(zhì)粒注射液（簡稱NMM 腫瘤DNA 疫苗［1］），屬于重組生物制品，主要針對黑色素瘤、淋巴癌、乳腺癌等體表實體瘤的治療，終產(chǎn)品為質(zhì)粒DNA。DNA 疫苗屬于第三代疫苗技術［2］，其優(yōu)點是注射至機體內(nèi)可誘導機體產(chǎn)生細胞和體液的雙重免疫效果。隨著DNA 疫苗、基因治療制品等生物制品的進一步發(fā)展，質(zhì)粒DNA 臨床用量需求增加，對其質(zhì)量控制提出了更高的要求，以提高臨床用藥的安全性［3-5］。NMM 腫瘤DNA 疫苗生產(chǎn)過程中，在發(fā)酵菌堿裂解步驟以及色譜純化過程中添加了乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na），主要作用是螯合金屬離子，如Mg2+，并抑制脫氧核糖核酸酶對DNA 的降解［6］。在純化工藝過程中EDTA-2Na會逐步被稀釋，但不排除終產(chǎn)品中仍存在EDTA-2Na殘留的可能。

EDTA-2Na在制藥領域中應用范圍較廣，主要作為螯合劑［7］、穩(wěn)定劑［8］。EDTA-2Na 收錄于美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）《非活性組分指南》［9］，可用于非注射劑和注射給藥制劑，若攝入過多EDTA-2Na，會與身體中的鈣離子形成水溶性金屬絡合物，隨體液排出，引起低血鈣或骨鈣流失，導致抽搐甚至死亡［10］。因此需要對注射液中EDTA-2Na殘留量進行控制。

目前針對EDTA的檢測方法有液相法、氣相法、電分析法等［11］，本研究參照相關文獻［12-13］，建立了檢測NMM腫瘤DNA疫苗原液中EDTA-2Na殘留量的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法，其原理為EDTA-2Na 與CuSO4在酸性條件下發(fā)生絡合反應，形成EDTA-Cu絡合物，該絡合物在254 nm附近有較顯著紫外吸收，本研究以水-10%四丁基氫氧化銨-乙腈溶液（74.5∶0.5∶25）為流動相，使用紫外檢測器，采用外標法對EDTA-2Na進行檢測，為NMM腫瘤DNA疫苗及同類產(chǎn)品質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1疫苗及溶劑 DNA疫苗原液（DNA含量：0.96mg／mL；小試原液批號：Bulk20200501、Bulk20200502、Bulk20-200603，中試原液批號：Bulk20200601、Bulk20200602、Bulk20200703、Bulk20200704、Bulk20200805）及原液空白溶劑（DNA溶解液，主要成分為：13.6 mmol／L磷酸氫二鈉、3.2 mmol／L磷酸二氫鈉、6 g／L氯化鈉）由本公司提供。

1.2主要試劑及儀器 EDTA-2Na（批號：190729-1，含量≥99.0%）購自廣東西隴科學股份有限公司；10%四丁基氫氧化銨溶液（分析級）、硫酸銅（分析級）購自天津市致遠化學試劑有限公司；乙腈（色譜級）購自美國Thermo Fisher Scientific；硫酸（分析級）購自盧龍縣雙益磷化有限責任公司；水（二級反滲透）為本公司自制純化水；磷酸氫二鈉（藥用級）、磷酸二氫鈉（藥用級）購自湖南九典制藥股份有限公司；氯化鈉（藥用級）購自河北華晨藥業(yè)有限公司；高效液相色譜儀（日立Chromaster，配有四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、UV 檢測器及Clarity 色譜工作站）購自日本日立公司；色譜柱［ZORBAX SB-C18（150 mm ×4.6 mm，5μm）］購自美國安捷倫公司；PB-10 pH 計、BSA124S電子天平購自德國賽多利斯公司；UV 1800PC紫外分光光度計購自上海菁華科技儀器有限公司。

1.3EDTA-2Na殘留量檢測方法的建立

1.3.1溶液配制 取EDTA-2Na對照品0.1 g，置100 mL量瓶中，用超純水溶解稀釋至刻度，制成1 mg／mL對照品溶液母液。取該溶液200μL，加入560μL 0.1%硫酸銅溶液，加水定容至2 mL，混勻，作為對照品溶液。分別取DNA疫苗原液200μL、原液空白溶劑200μL，同方法制備供試品溶液及空白溶劑；取DNA 疫苗原液200 μL，對照品溶液母液200 μL，同方法制備含EDTA-2Na的供試品溶液。

1.3.2色譜條件 流動相為水-10%四丁基氫氧化銨-乙腈溶液（74.5∶0.5∶25，用硫酸調(diào)pH 至4.0）；流速為0.8 mL／min；檢測波長為254 nm；柱溫為20 ℃；進樣量為20μL；樣品放置溫度為10 ℃。

1.4方法的驗證

1.4.1檢測波長的確認 對流動相、空白溶劑、原液空白溶劑、對照品溶液（超純水稀釋3 倍）及供試品溶液（超純水稀釋9 倍）在190 ～400 nm 波長范圍內(nèi)進行掃描，以確認其最優(yōu)檢測波長。

1.4.2專屬性 DNA 疫苗原液對光照、溫度等條件敏感，質(zhì)粒DNA解超螺旋構型的條件分別為：5 000 lx光照5 d，獲得光照解超螺旋供試品；40 ℃高溫15 d，獲得高溫解超螺旋供試品。分別對流動相、空白溶劑、原液空白溶劑、對照品溶液、供試品溶液、光照解超螺旋供試品溶液、高溫解超螺旋供試品溶液、加入EDTA-2Na 的供試品溶液，按照1.3.2 項色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。

1.4.3檢測限及定量限 取對照品溶液母液，加水稀釋至不同濃度，與硫酸銅絡合后，按照1.3.2 項色譜條件依次進樣檢測并記錄信噪比。當EDTA-2Na 峰信噪比為3∶1時，溶液的濃度即為該方法的檢測限，對該濃度溶液連續(xù)檢測3次；當EDTA-2Na 峰信噪比為10∶1 時，溶液的濃度即為該方法的定量限，對該濃度溶液連續(xù)檢測6次，計算峰面積RSD。

1.4.4線性范圍 分別取1 mg／mL對照品母液8、40、100、200、400、800μL，加入560μL 0.1%硫酸銅溶液，超純水定容至2 mL，混勻過濾即得4、20、50、100、200、400μg／mL系列對照品溶液，按照1.3.2項色譜條件進行檢測。以濃度（μg／mL）為橫坐標，峰面積（mAU·s）為縱坐標，進行線性回歸。

1.4.5溶液穩(wěn)定性 取對照品和供試品溶液，分別于10 ℃放置0、2、4、6、8、10、12 h，按照1.3.2項色譜條件進行檢測，記錄峰面積，并計算RSD。

1.4.6耐用性 分別改變流動相比例（水-10%丁基氫氧化銨-乙腈比例分別為79.5∶0.5∶20、74.5∶0.5∶25、69.5∶0.5∶30）、流速（0.6、0.8、1.0 mL／min）、柱溫（16、20、24 ℃），其他條件不變，評估測定條件發(fā)生微小變動時檢測結果不受影響的程度。

1.4.7準確度 分別取1 mg／mL EDTA-2Na對照品母液160、200、240μL，置2 mL容量瓶中，分別取200μL供試品、560μL 0.1%硫酸銅溶液，加水定容至刻度，混勻后過濾即得EDTA-2Na濃度為0.08、0.10、0.12mg／mL的加標溶液（即加標量為80%、100%、120%），每個濃度加標樣品制備3 份，每份樣品檢測1 次，記錄峰面積，計算EDTA-2Na含量及回收率。

1.4.8精密度 取EDTA-2Na 對照品溶液，連續(xù)檢測6次，計算峰面積均值及RSD，評價方法的重復性；取6 份供試品溶液，每份供試品溶液各檢測1 次，另配制6份含EDTA-2Na的供試品溶液，各檢測1次，計算EDTA-2Na峰面積RSD，評價方法的中間精密度。

1.5方法的初步應用 用建立的方法檢測DNA 疫苗3批小試原液及5批中試原液中EDTA-2Na殘留量。

1.6數(shù)據(jù)采集及分析 使用TeChrom色譜工作站（reliminary 版本8.4.0.46）采集數(shù)據(jù)，所有檢測結果由Microsoft Excel 2016 軟件進行一般計算，標準曲線采用OriginPro 2021版繪制。

2 結果

2.1方法的驗證

2.1.1檢測波長的確認 流動相、空白溶劑、原液空白溶劑在254 nm 附近吸光度值極低或無吸光度值；對照品溶液在254 nm 附近有較高吸光度值；供試品溶液在254 nm附近有最高吸光度值。見圖1。

圖1 流動相（A）、空白溶劑（B）、原液空白溶劑（C）、對照品溶液（D）、供試品溶液（E）波長掃描結果Fig.1 Wavelength scanning results of mobile phase（A），blank solvent（B），bulk blank solvent（C），control solution（D）and sample solution（E）

2.1.2專屬性 EDTA-2Na對照品溶液的保留時間為

5.26 min；流動相、原液空白溶劑、空白溶劑在EDTA-2Na 保留時間附近無吸收峰，表明3 種溶液對EDTA-2Na檢測無干擾；供試品溶液、光照解超螺旋供試品溶液、高溫解超螺旋供試品溶液在5.3 min附近未出現(xiàn)目標峰，供試品經(jīng)光照、高溫等試驗條件處理后，對EDTA-2Na殘留量檢測無影響；供試品溶液運行50 min，目標峰后未見其他峰出現(xiàn)，表明該方法運行15 min內(nèi)可將所有物質(zhì)洗脫下來，且供試品溶液中質(zhì)粒DNA在該色譜條件下未出峰；對連續(xù)6針含EDTA-2Na的供試品溶液檢測發(fā)現(xiàn)，EDTA-2Na的回收率為102.50%，表明質(zhì)粒DNA雖然在254 nm附近有紫外吸收峰，但在該色譜條件下并未出峰，且不干擾EDTA-2Na的檢測。見圖2。

圖2 專屬性驗證色譜圖Fig.2 Chromatograms of specificity verification

2.1.3檢測限及定量限 信噪比為3∶1和10∶1時的溶液濃度分別為10 和40 ng／mL，確定該方法檢測限為10 ng／mL，定量限為40 ng／mL。對定量限濃度溶液連續(xù)進樣6次檢測，峰面積RSD為6.84%，＜10%，表明定量限濃度檢測較準確。

2.1.4線性范圍 EDTA-2Na 對照品溶液濃度在4 ～400μg／mL范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關系，線性回歸方程為y=12.114x-19.245，R2=0.999 9。見圖3。

圖3 HPLC法檢測EDTA-2Na含量的標準曲線Fig.3 Standard curve for determination of EDTA-2Na by HPLC

2.1.5溶液穩(wěn)定性 EDTA-2Na 對照品溶液在10 ℃下放置12 h，峰面積的RSD為1.45%，溶液穩(wěn)定性良好。供試品溶液在10 ℃條件下放置12 h，未出現(xiàn)目標峰及其他峰，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。見表1。

表1 對照品溶液穩(wěn)定性驗證Tab.1 Verification for stability of control solution

2.1.6耐用性 流動相比例對EDTA-2Na 保留時間有影響，乙腈比例越大，EDTA-2Na保留時間越短，乙腈比例越小，EDTA-2Na保留時間越長，見圖4。流速越大，保留時間越短，峰面積越小，見圖5。柱溫對保留時間及峰面積均無顯著影響，見圖6。表明方法檢測條件發(fā)生微小變動時，對檢測結果的影響均在可接受范圍內(nèi)，方法耐用性良好。

圖4 不同比例流動相色譜圖Fig.4 Chromatograms of different ratios of mobile phase

圖5 不同流速色譜圖Fig.5 Chromatograms in different flow rates

圖6 不同柱溫色譜圖Fig.6 Chromatograms at different column temperatures

2.1.7準確度 低、中、高濃度加標樣品EDTA-2Na回收率分別為101.11%、101.60%、101.42%，RSD分別為0.44%、0.27%、0.42%。9 份加標溶液的回收率均值為101.38%，RSD均值為0.39%。見表2。表明該方法準確度良好。

表2 EDTA-2Na加標回收率試驗Tab.2 Spike recovery rate of EDTA-2Na

2.1.8精密度 0.1 mg／mL EDTA-2Na對照品溶液，連續(xù)進樣6次，其峰面積的RSD為0.04%，重復性良好。6份供試品溶液均未檢出EDTA-2Na，含EDTA-2Na 的供試品溶液峰面積RSD為0.02%，中間精密度良好。

2.2方法的初步應用 8 批DNA 疫苗原液均未檢出EDTA-2Na殘留量（圖略），表明本公司生產(chǎn)工藝可有效去除生產(chǎn)過程中添加的EDTA-2Na。

3 討論

EDTA 是一種常用的氨羧絡合劑，目前國內(nèi)外HPLC 法檢測EDTA-2Na 殘留量主要應用于化學藥品［12-16］和食品領域［17-18］，但在重組生物制品的檢測控制中報道較少［19-21］。文獻中多使用Fe3+［15，17-21］或者Cu2+［12-13，22］作為絡合劑檢測EDTA-2Na殘留量。EDTA易與金屬離子絡合，可與色譜柱內(nèi)側不銹鋼表面發(fā)生絡合反應，從而降低EDTA的響應值［15］。由于EDTA與Fe3+形成的絡合物穩(wěn)定系數(shù)高于EDTA 與Cu2+［17］，可考慮使用Fe3+代替Cu2+。也有文獻報道，使用Sephadex G-10色譜柱可直接檢測EDTA-2Na［16］。

本研究在對檢測波長進行掃描時發(fā)現(xiàn)，Cu2+濃度會影響EDTA 的最適波長。通過對硫酸銅添加量的研究，確定硫酸銅終濃度為0.28 mg／mL 時，既可保證EDTA 完全絡合，又可避免過量Cu2+對絡合物吸光度值的影響。

《中國藥典》四部（2020版）收錄了依地酸二鈉藥用輔料的質(zhì)量標準［23］，但目前并未收錄注射液中EDTA-2Na 的控制限度。有文獻報道，EDTA-2Na 的安全濃度為5 ～100 μg／mL［24-25］。參照國家藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心的常用藥用輔料數(shù)據(jù)庫中依地酸二鈉常用量以及最大用量，確定原液中EDTA-2Na殘留量的企業(yè)控制標準為不高于0.01%。本研究結果顯示，多批次原液中均未檢測出EDTA-2Na 殘留量，該質(zhì)量標準制定較為合理。

本研究方法驗證結果顯示，專屬性、線性范圍、溶液穩(wěn)定性、精密度以及耐用性均良好，檢測限為10 ng／mL，定量限為40 ng／mL，加標溶液平均回收率為101.38%，表明該方法穩(wěn)定可靠，精密度良好，可適用于測定NMM腫瘤DNA疫苗中EDTA-2Na的殘留。