對羥基苯甲酸對三七黑斑病致病性因素的影響研究

胡光玉 楊善武 周彬 趙春瓊 陳健好 趙靜

摘要 ［目的］探討對羥基苯甲酸與三七黑斑病“病害三角”之間的互作影響，分析對羥基苯甲酸對病原真菌及其寄主植物在生理功能、抗病性和病原菌致病性上的影響。［方法］以三七一年生幼苗及三七黑斑病菌（Altemaria panax Whetzel）為試材，借助酶學(xué)分析技術(shù)，分別探討4個不同濃度對羥基苯甲酸脅迫下三七-土壤-病原菌致病性生態(tài)因素的變化。［結(jié)果］不同濃度的對羥基苯甲酸對三七幼苗及病原菌的化感作用受到濃度效應(yīng)的影響。在2.5～5.0 mmol/L濃度下，三七根系抗性酶活性會有短期內(nèi)的增加，后逐漸降低，而高濃度（10.0 mmol/L）的脅迫下則明顯下降；土壤酶活性的變化也有相同的趨勢。三七黑斑病菌在2.5～5.0 mmol/L濃度下其果膠酶、纖維素酶均出現(xiàn)較高活性，說明在該濃度范圍內(nèi)病原菌生長情況及繁殖能力較好。［結(jié)論］對羥基苯甲酸與三七黑斑病發(fā)生的3個要素即寄主、土壤、病原菌三者之間存在化感濃度效應(yīng)。

關(guān)鍵詞 對羥基苯甲酸；三七黑斑病；病原真菌；抗性酶；土壤酶活性；致病性酶

中圖分類號 S432.1? 文獻標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）13-0163-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.13.038

Study on Effects of p-hydroxybenzoic Acid on the Pathogenic Factors of Black Spot Disease in Panax notoginseng

HU Guang-yu，YANG Shan-wu，ZHOU Bin et al

（College of Chemistry， Biology and Environment， Yuxi Normol University， Yuxi，Yunnan 653100）

Abstract ［Objective］To explore the interaction between p-hydroxybenzoic acid and the “disease triangle” of Panax notoginseng black spot disease， and analyze the effects of p-hydroxybenzoic acid on the physiological function， disease resistance and pathogenicity of pathogenic fungi and their host plants.［Method］Using one-year seedlings of Panax notoginseng and Alteraria panax Whetzel as test materials， the enzymatic analysis techniques were used to investigate the changes in the pathogenic ecological factors of Panax notoginseng-soil-pathogen under four different concentrations of p-hydroxybenzoic acid stress.［Result］The allelopathy of different concentrations of p-hydroxybenzoic acid on the seedlings and pathogens of Panax notoginseng was affected by the concentration effect. At a concentration of 2.5-5.0 mmol/L， the root resistance enzyme activity of Panax notoginseng increased in a short period of time， and then gradually decreased， while under high concentration （10.0 mmol/L）， it decreased significantly;the changes of soil enzyme activity showed the same trend. At the concentration of 2.5-5.0 mmol/L， the pectinase and cellulase activity of Panax notoginseng were higher， which indicated that the growth and reproduction ability of the pathogenic bacteria were relatively good within this concentration range. ［Conclusion］There is an allelopathic concentration effect of p-hydroxybenzoic acid on the three factors involved in the occurrence of black spot disease of Panax notoginseng， namely host， soil and pathogenic bacteria.

Key words P-hydroxybenzoic acid;Panax notoginseng black spot disease;Pathogenic fungi;Resistant enzyme;Soil enzyme activity;Pathogenic enzyme

基金項目 國家自然科學(xué)基金項目（32060036）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（202111390001）。

作者簡介 胡光玉（2000—），女，云南昭通人，從事生物科學(xué)研究。通信作者，副教授，博士，從事植物病原菌與寄主互作研究。

收稿日期 2022-04-01

植物的根系在其生命過程中扮演重要的角色，是植物直接與土壤的接觸部分，承擔(dān)著植物與土壤物質(zhì)的吸收與交換。根系一方面從土壤中吸收水分和養(yǎng)分，另一方面也向周圍土壤釋放一些無機離子和有機化合物，即根系分泌物，這些物質(zhì)是一類復(fù)雜的混合物，Rice［1］把植物根系分泌物歸為14類，其中最常見的是低分子量有機酸、酚類和萜類化合物。酚酸類物質(zhì)是構(gòu)成植物不同根際微生態(tài)特征的關(guān)鍵因素［2-3］，也是引起作物連作障礙的主要因素。酚酸類物質(zhì)可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的通透性、植物激素、光合作用等因素來影響植物的生長。另外，酚酸類物質(zhì)為根際微生物提供充足的營養(yǎng)，增加根際微生物的數(shù)量，提高微生物活性，直接或間接地改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，進而影響作物生長。對于不同的作物，分泌酚酸的種類、數(shù)量存在較大差異，因而對土壤條件和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響不同。Lv等［4］研究了水楊酸在蠶豆連作障礙中的作用機制，結(jié)果表明，水楊酸顯著提高了蠶豆病害的發(fā)病率和病情指數(shù)，抑制了幼苗的生長，降低了蠶豆的生理抗性。白羽祥等［5］研究表明，連作植煙土壤中，酚酸含量與土壤速效鉀、水解氮、速效磷、pH、有機物含量及微生物群落結(jié)構(gòu)均有顯著相關(guān)性。Guo等［6］研究表明肉桂酸能促進法巴豆枯萎病的發(fā)生并降低幼苗的抗性，同時也顯著提高了鐮刀菌的致病性。

對羥基苯甲酸為酚酸類化感物質(zhì)，是自然界中常見的化合物，存在于高等植物、微生物、苔蘚和土壤中。該研究通過對三七幼苗進行不同濃度對羥基苯甲酸的脅迫生長，分析其對三七根系抗性酶、土壤酶活及三七黑斑病的致病性酶活性的影響，以期為三七種植的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試三七幼苗取自云南省玉溪市建水縣三七種植基地。外源對羥基苯甲酸為分析純標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 三七幼苗抗性酶試驗處理

1.2.1 試驗處理。

基于前期研究基礎(chǔ)［7］，試驗設(shè)置4個對羥基苯甲酸濃度（用0.3%乙醇溶液配制濃度分別是1.0、2.5、5.0、10.0 mmol/L），同時以0.3%乙醇溶液為對照處理（CK）。

以一年生三七苗為試驗材料，定植于50 cm×10 cm×15 cm的栽培盆中，每盆選擇長勢一致的植株10株進行種植。定植14 d后用配制好的對羥基苯甲酸溶液進行根部澆灌處理，每個處理設(shè)3個重復(fù)，定期澆灌營養(yǎng)液，補充水分，確保植株正常生長。為確保土壤中的對羥基苯甲酸濃度，連續(xù)處理5次，每次間隔1 d。為防止酚酸溶液流失，在培養(yǎng)盆下面放置托盤，將外滲的酚酸溶液重新澆回培養(yǎng)盆中，處理10 d后開始取樣，進行相關(guān)生理指標(biāo)的測定。

1.2.2 根系抗氧化酶活性的測定。

試驗選取超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）3個指標(biāo)進行測定，方法參照文獻［8］。

1.3 病原菌致病性酶活性測定

1.3.1 供試菌株。

以三七種植中三七黑斑病菌的病原人參鏈格孢（Altemaria panax Whetzel）為供試菌株。這個菌株為實驗室分離并通過接種試驗及生理生化、分子鑒定保存的三七病原菌。

1.3.2 病原菌致病性酶活性的測定。

試驗選取果膠酶、纖維素酶2個指標(biāo)進行測定分析，方法參照文獻［9-10］。

1.3.3 土壤酶活性的測定。

土壤脲酶活性采用苯酚鈉比色法測定，蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸法測定，堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉法測定，多酚氧化酶活性采用鄰苯三酚比色法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Origin和SPSS 10.0統(tǒng)計分析軟件包對試驗數(shù)據(jù)進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對羥基苯甲酸對三七根系抗性指標(biāo)的影響

對羥基苯甲酸是酚酸類化感物質(zhì)中存在較為廣泛的一種，也是被報道的引起作物連作障礙的酚酸物質(zhì)之一。如圖1所示，在不同濃度外源對羥基苯甲酸脅迫下，三七幼苗根系抗性酶活性與對照相比有明顯變化。SOD是抗氧化金屬酶，在機體氧化與抗氧化的平衡中起到重要作用。與對照相比，隨著脅迫時間的增加，各濃度對羥基苯甲酸處理SOD活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，1.0、2.5、5.0 mmol/L的處理在第5天均達(dá)到酶活性峰值，其中2.5 mmol/L對羥基苯甲酸處理的植株酶活性最強，為0.031 U/g。而高濃度對羥基苯甲酸（10.0 mmol/L）的處理，酶活性最大值在第7天出現(xiàn)，后逐漸下降。所有濃度對羥基苯甲酸處理在第9天時酶活性達(dá)最低值。

POD是眾多涉及清除活性氧（ROS）類物質(zhì)的最重要酶類之一。由圖1可知，隨對羥基苯甲酸脅迫處理時間的延長，POD活性也呈先升高再降低的趨勢，其中2.5 mmol/L處理的POD活性最強，最大值達(dá)到4.9 U/g，說明該濃度下外源對羥基苯甲酸對三七根系產(chǎn)生傷害，引起根系保護性酶POD發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)。而10.0 mmol/L處理，其POD活性始終低于對照也低于其他濃度（除第7天），這說明高濃度的對羥基苯甲酸對三七根系危害性最強。

CAT清除劑也是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。由圖1可知，隨對羥基苯甲酸脅迫程度的加重，對羥基苯甲酸濃度越高的三七根系CAT活性越低，不同濃度酶活性峰值時間不一致。其中，1.0 mmol/L對羥基苯甲酸處理在第7天達(dá)到最大值（0.36 U/g）；2.5 mmol/L對羥基苯甲酸處理在第5天達(dá)到最大值（0.31 U/g）；5.0 mmol/L對羥基苯甲酸處理在第1天達(dá)到最大值（0.28 U/g），后逐漸降低。CAT活性達(dá)最低值為10.0 mmol/L處理第9天，酶活性僅為0.09 U/g。

2.2 對羥基苯甲酸對三七病原菌致病性酶活性的影響

三七黑斑病是由人參鏈格孢（Altemaria panax Whetzel）引起三七生產(chǎn)上減產(chǎn)的重要病害之一。植株發(fā)病后可危害植株的各個部分，常造成落葉、干花、不能結(jié)實、植株折垂而枯死，一般發(fā)病率為25%～35%，嚴(yán)重時可達(dá)90%以上，導(dǎo)致減產(chǎn)［11］。由圖2可知，1.0、2.5、5.0 mmo/L對羥基苯甲酸脅迫下，人參鏈格孢果膠酶活性與對照相比均呈上升趨勢，其中2.5、5.0 mmol/L處理下果膠酶活性最接近；而10.0 mmol/L處理下果膠酶活性較對照下降明顯，僅為1.0 U/（mL·min）。不同濃度對羥基苯甲酸脅迫下對人參鏈格孢纖維素酶活性的變化不明顯，其中1.0 mmol/L處理酶活性最低，為0.39 μmol/min，10.0 mmol/L處理酶活性最高，為0.53 μmol/min，這說明對羥基苯甲酸對人參鏈格孢纖維素酶活性的化感作用不明顯。

2.3 對羥基苯甲酸對土壤酶活性的影響

土壤酶活性是指土壤酶催化物質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力。土壤酶活性既包括已積累于土壤中的酶活性，也包括正在增殖的微生物向土壤釋放的酶活性，它主要來源于土壤中動物、植物根系和微生物的細(xì)胞分泌物以及殘體的分解物［12］，是衡量土壤質(zhì)量的一個重要指標(biāo)。從表1可以看出，對羥基苯甲酸濃度為1.0～5.0 mmol/L的處理，土壤脲酶、堿性磷酸酶隨著濃度的升高活性也升高，當(dāng)濃度達(dá)到10.0 mmol/L時，活性下降且低于對照。蔗糖酶在對羥基苯甲酸濃度為1.0 mmol/L時，酶活性最高，后隨著濃度的升高活性降低。多酚氧化酶在對羥基苯甲酸脅迫下，酶活性隨濃度升高而增加，在10.0 mmol/L時達(dá)最高值。

3 討論與結(jié)論

酚酸化合物是在作物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用的物質(zhì)，在植物-植物、植物-微生物和植物-環(huán)境的相互作用中作為信號劑［13］。酚酸類物質(zhì)是產(chǎn)生作物連作障礙的主要因素，它可以直接或間接地促進或抑制微生物群落，進而影響作物生長。對番茄、黃瓜、西瓜和辣椒等作物根系分泌物分離鑒定出十幾種酚酸物質(zhì)，包括肉桂酸、水楊酸、苯甲酸等。這些酚酸類物質(zhì)作為單一連作體系中含量最多的化感物質(zhì)，通過影響作物的光合作用、阻礙對水分和離子的吸收、DNA和蛋白質(zhì)的合成等來抑制植物生命代謝。劉一鳴等［14］通過盆栽土培試驗研究不同濃度對羥基苯甲酸脅迫下蠶豆與小麥間作對蠶豆生長和枯萎病發(fā)生的影響及其生理響應(yīng)，結(jié)果表明，對羥基苯甲酸可增加鐮刀菌的數(shù)量，促進枯萎病發(fā)生。王寧［15］通過盆栽試驗，運用石蠟切片技術(shù)證實了對羥基苯甲酸還可使草莓根系表皮細(xì)胞、皮層細(xì)胞、中柱鞘細(xì)胞、薄壁細(xì)胞以及導(dǎo)管分子的鐮刀菌感染率顯著升高。

孫雪婷等［16］認(rèn)為土壤環(huán)境災(zāi)變或惡變是三七不能連作的主要原因，當(dāng)然可能與三七自身的適應(yīng)能力也有關(guān)聯(lián)。另外，土壤環(huán)境災(zāi)變的驅(qū)動因素又來源于三七本身，即三七的栽種改變了土壤環(huán)境，而改變的土壤環(huán)境超越了三七本身的適應(yīng)和調(diào)整能力，從而使得三七不能連作。因此，研究三七連作條件下根系分泌物對土壤環(huán)境的影響是解析連作障礙的最有效途徑。該研究探討了不同濃度對羥基苯甲酸對三七幼苗、土壤酶活性、三七病原菌的影響，為重茬條件下三七黑斑病的防控提供理論依據(jù)。該研究表明，不同濃度的對羥基苯甲酸對三七根系抗性酶影響不同，主要表現(xiàn)為低濃度（2.5～5.0 mmol/L）下，三七根系3種抗性酶（SOD、POD、CAT）活性峰值出現(xiàn)在第3～7天，后逐漸降低；而高濃度（10.0 mmol/L）的脅迫下POD、CAT活性則明顯低于對照。這可能是由于2.5～5.0 mmol/L的對羥基苯甲酸可刺激土壤中病原菌的生長，作物短期內(nèi)會增加抗性酶活性，隨著處理時間的延長，酶活性降低。而不同濃度的對羥基苯甲酸對病原菌的化感作用則更加顯現(xiàn)出了濃度效應(yīng)關(guān)系。在對羥基苯甲酸濃度為2.5～5.0 mmol/L時，三七黑斑病原菌（人參鏈格孢）的果膠酶、纖維素酶均出現(xiàn)較高活性，這也說明在該濃度范圍內(nèi)，病原菌生長情況及繁殖能力較好，這將有利于三七黑斑病的發(fā)生。另外，土壤酶活性也受到濃度影響，對羥基苯甲酸濃度為1.0～5.0 mmol/L的處理，土壤脲酶、堿性磷酸酶隨著濃度的升高活性也升高，而10.0 mmol/L處理下，酶活性均明顯下降。

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